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纯化与分析 秀丽隐杆线虫 细胞外囊泡

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DOI：

10.3791/60596

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2020年3月31日

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1Department of Pathology, University of Washington

本文内容

摘要

本文介绍了生成、纯化和定量的方法 秀丽隐杆线虫 细胞外囊泡

摘要

将小型膜结合囊泡分泌到胞外环境是所有细胞的基本生理过程。这些细胞外囊泡（EVs）在细胞外发挥作用，通过在组织间传递蛋白质、核酸、代谢物和脂质来调控整体生理过程。EVs 能够反映其来源细胞的生理状态，在人类健康的几乎所有方面均被证实具有基础性作用。因此，EVs 所携带的蛋白质和遗传物质正被 increasingly 用于健康与疾病生物标志物的分析。然而，目前 EV 研究领域仍缺乏一种易于操作的无脊椎动物模型系统，以用于研究 EV 货物的组成。C. elegans 非常适合开展 EV 研究，因为它能主动将 EVs 分泌到体外环境中，便于分离。本文提供了生成、纯化和定量这些环境分泌的 C. elegans EVs 所需的全部信息，包括如何定量操作大量年龄同步化的线虫、EVs 的纯化方法，以及一种通过流式细胞术直接测定纯化样品中完整 EVs 数量的实验方案。因此，可充分利用 C. elegans 研究领域已有的大量遗传工具，来探究遗传通路和生理过程对 EV 货物组成的影响。

引言

膜结合细胞外囊泡（EVs）通过在细胞间主动运输特定的蛋白质、核酸、代谢物和脂质货物，促进机体的多种生理过程1。细胞分泌的EVs大小范围广泛，从2 μm或更大到小至20 nm不等2。小细胞外囊泡（<200 nm）因其在代谢紊乱、癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等病理过程中的作用而受到越来越多的关注3,4,5。这些病理状态也被证实会影响小EVs所携带货物的蛋白质和遗传物质组成。因此，通过LC-MS-MS和RNAseq等EV货物发现方法，与疾病相关的生物标志物特征正被不断揭示6,7,8,9。

秀丽隐杆线虫 一直是用于鉴定进化保守的细胞外囊泡（EV）信号通路的有用无脊椎动物模型。例如，一种 秀丽隐杆线虫 翻转酶最初被证明可诱导细胞外囊泡的生物发生 秀丽隐杆线虫 胚胎，且其人类同源物被证实可影响人类细胞中细胞外囊泡的释放10,11. 秀丽隐杆线虫 已有研究报道，细胞外囊泡（EVs）携带了表皮发育所必需的Hedgehog信号。Hedgehog及其他形态发生素的递送体现了EVs在发育过程中的重要功能，该机制在斑马鱼、小鼠和人类中均具有保守性。12,13,14,15. 秀丽隐杆线虫 非常适合用于细胞外囊泡（EV）生物标志物的发现，因为它会将EV分泌到体外，参与个体间的通讯16,17 (图1A）。然而，由于线虫的特性，先前研究建立的方法无法适用 E. coli 食物来源也会分泌细胞外囊泡（EVs）18. 在该方法中，样品的大部分由 E. coli 污染，限制了蛋白质组学或RNA测序方法在发现中的应用能力 秀丽隐杆线虫 EV 货物。此处描述的方法旨在获得高纯度的 C. elegans 外泌体（EVs）的数量水平具有典型细胞培养实验的特征，因此有助于采用组学方法进行外泌体生物标志物的发现。

为了获得足够数量的细胞外囊泡（EV）用于 cargo 分析，需要培养大量的线虫。因此，本文也包含了对发育同步化的大型 C. elegans 种群进行定量培养的方法。通常情况下，当实验需要大量线虫时，会将其培养在液体培养基中。尽管这种方法能够有效扩增线虫数量，但其生理状态与在标准线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上培养的线虫存在显著差异。液体培养的线虫生长更缓慢、体型更纤细、发育不同步，并且批次间变异程度较高。因此，我们提出了一种简单而有效的方法，利用10 cm高生长平板对发育同步化的大型 C. elegans 种群进行定量培养。高生长平板的培养基成分比常规NGM平板含有更多的蛋白胨，并接种生长能力比OP50更强的 E. coli 菌株NA22。

流式细胞术技术（FACS）的进步使得能够直接分析单个细胞外囊泡（EVs）20,21，从而在无需依赖其他方法固有局限性的条件下实现对EVs的定量。先前的研究表明，蛋白质含量并不能有效反映EVs的数量，因为不同的纯化方法会导致EVs与蛋白质的比例存在显著差异22。高度纯化的EV组分中蛋白质含量相对较低，使得使用BCA法或考马斯亮蓝凝胶难以准确测定样品浓度。Western印迹分析可识别特定蛋白质的相对差异，但无法确定样品中EVs的具体数量。纳米颗粒追踪分析法在对EVs数量进行可靠定量时，受限于其信噪比较窄、难以区分EVs与固体聚集体，以及不同规格仪器之间方法缺乏可转移性等问题23。因此，本文还提供了一种具有普适性的流式细胞术操作流程，用于区分并定量EVs。

方案

1. 准备

  1. 将 2 g 明胶加入 100 mL 的 dH2O 中，微波加热至开始沸腾，搅拌后静置冷却 20 分钟。
  2. 将溶液经 0.22 μm 滤器过滤，分装至无菌离心管中。使用移液器吸取并推出明胶溶液，对移液器吸头进行预处理，处理应在使用前立即进行。处理后的吸头可立即使用，也可储存备用。
  3. 从无菌滤帽中取出滤膜。
  4. 润湿一块 20 cm 见方的 5 μm 尼龙网膜，包裹在无菌滤帽顶部，用数个粗橡皮筋固定。
    注意：仔细检查网膜，确保无褶皱。褶皱会产生气隙，影响负压效果。

2. 计算大量线虫种群数量（图 1A）

  1. 涡旋并用移液器吹打 10 μL 将线虫悬液滴加到线虫培养板盖子或玻片上。重复此过程3次。记录每滴中的线虫数量。
  2. 将线虫悬液调整至每微升含两个动物 μL.
  3. 涡旋混匀悬浮液，并用移液器吸取九滴（10 μL) 置于载玻片或培养皿盖上。人工计数动物个体数量。记录每滴中的动物数量。
  4. 计算每个线虫群体的平均值及平均值的标准误（S.E.M.），并以百分比形式表示。
  5. 通过将平均值除以每个种群中的动物总数来计算 10 μL 然后乘以线虫悬液的总体积 μL.

线虫色谱示意图；包含涡旋、过滤、离心和尺寸排阻步骤的装置示意图。
图 1：C. elegans EVs 的制备、定量与纯化流程概览。（A）对大量线虫种群进行计数的示意图。（B）用于收集EVs的线虫制备示意图。（C）从C. elegans上清液中纯化EVs的示意图。请点击此处查看此图的放大版本。

3. 培养 C. elegans 用于EV纯化

  1. 生成大量发育同步的群体 秀丽隐杆线虫为此，请遵循以下步骤。
    1. 将单个动物加入一个6 cm的正常生长培养基平板中。孵育两代后，将动物洗入两个高营养生长培养基平板中。
    2. 孵育至线虫耗尽食物。
    3. 过滤L1期幼虫 5 μm 步骤1.4中准备的尼龙筛网。将螺口盖盖在无菌瓶上，启动真空泵，将线虫倒入滤器中。将相同体积的培养基通过滤器上的线虫聚集体。
    4. 定量统计蠕虫并计算总数（参见步骤 2）。近期饥饿处理的（<在高生长培养板上培养24小时后，可获得约80,000条L1幼虫。
    5. 以 2,000 x 离心 L1 幼虫 g 3 分钟。重悬至每毫升约 100,000 个动物。
    6. 每个高生长培养板中放置约 50,000 个动物。将动物在 20 °C 直到它们成为怀卵的成虫（约72小时）。
    7. 通过标准方法漂白带有卵的成虫，并将胚胎置于10 mL S Basal溶液中孵化 2.5 μg/mL 胆固醇
    8. 定量L1幼虫（见步骤2），然后将50,000条线虫加入每块高密度培养板中。
    9. 在培养皿中培养 20 °C 直到动物达到年轻成年阶段。
  2. 准备 C. elegans 用于分泌组的生成。
    1. 用15 mL无菌M9缓冲液冲洗平板上的线虫 50 μg/mL 向每个高密度培养板中加入羧苄青霉素。将加样后的培养板静置5分钟。通过在培养板内旋转缓冲液使线虫脱离。避免剧烈晃动。将每个培养板中的缓冲液分别倒入独立的50 mL锥形离心管中。重复洗涤步骤2次，使每块培养板的缓冲液总体积达到45 mL。
    2. 让线虫静置15分钟。弃去上清液，向管中加入50 mL新鲜M9缓冲液。重复此步骤，共4次。
    3. 将线虫漂浮于30%蔗糖阶梯梯度溶液上层，并在S基础溶液中回收动物24.
      1. 将线虫在15 mL冰冻的100 mM NaCl溶液中短暂重悬，加入15 mL冰冻的60%蔗糖溶液，轻轻翻转混匀。用玻璃移液管在蔗糖混合液上层小心地叠加5 mL冰冻的100 mM NaCl溶液。
      2. 1,500 x g 离心 g 5 分钟后，线虫将集中在 NaCl 与蔗糖之间的界面处。
      3. 轻柔地用移液器将动物从界面移至新的50 mL锥形管中。加入S基础溶液至50 mL。静置5分钟，使线虫沉降。
      4. 弃去上清液，加入 50 mL 新鲜的 S 基础培养液。重复此步骤至少 3 次。
    4. 按照第2步所述方法对蠕虫数量进行定量。
    5. 将线虫重悬至每单位密度为一个个体 μL 含有无菌S基础溶液 2.5 μg/mL 胆固醇的 50 μM 羧苄青霉素
    6. 为制备用于分泌组生成的样品，将最多400 mL悬浮液加入无菌的2 L底部带挡板的锥形瓶中。
    7. 将培养瓶置于圆周旋转仪上 20 °C 在 100 rpm 条件下于培养箱中孵育 24 小时。

4. 细胞外囊泡纯化

  1. 收获与分级分离
    1. 从培养箱中取出装有线虫的2L锥形瓶，将线虫在50 mL圆锥形离心管中离心沉淀（500 ×g，2分钟）。
    2. 将上清液通过0.22 μm真空滤膜过滤，以去除任何颗粒状杂质。
      注意：此时含有分泌组和囊泡的滤过上清液可于-80 °C保存。
    3. 按照步骤2所述方法计数动物数量。
    4. 通过将一滴悬浮线虫置于细菌菌苔上评估线虫活力。等待15分钟后，将线虫分为运动、麻痹或死亡状态进行评分。
    5. 使用再生硝酸纤维素10 kDa滤膜装置将0.22 μm滤过的上清液浓缩至700 μL。加入150 μL S Basal溶液，然后用移液器反复吹打滤膜并涡旋混合。重复此操作两次。
    6. 将浓缩后的上清液在4 °C条件下以18,000 ×g离心20分钟，并将上清液转移至新管中。此步骤可去除在操作过程中可能积聚的潜在杂质或较大颗粒。
    7. 根据制造商说明书添加蛋白酶抑制剂混合物和EDTA。
      注意：此时含有分泌组和囊泡的浓缩上清液可于-80 °C保存。
  2. 尺寸排阻层析
    1. 将80–200 μm琼脂糖树脂（适用于球状蛋白质的孔径分级范围为70,000至40,000,000 kDa）倒入空的重力流层析柱中。用S Basal溶液冲洗，直至树脂床压实至最终体积为10 mL。
      注意：若倒入柱中的树脂过多，可用移液器分散柱顶部并吸除多余树脂。
    2. 将40 mL无菌过滤的S Basal溶液通过层析柱，使其在重力作用下自然流下。
      警告：注意检查树脂是否被扰动。
    3. 让缓冲液流至树脂顶部不再浸没时，封闭层析柱底部。在柱下方放置收集管。
    4. 取下柱上的封帽。将步骤2.1中获得的浓缩分泌组逐滴加至柱床顶部。再用移液器将1 mL S Basal溶液逐滴加入。在柱下方更换新的收集管。
    5. 缓慢向柱上部储液区加入5 mL S Basal溶液，避免扰动树脂。收集最初流出的2 mL洗脱液，然后迅速更换收集管，继续收集接下来的4 mL洗脱液。此部分为富含细胞外囊泡（EVs）的组分。
    6. 使用再生硝酸纤维素10 kDa分子量截留（MWCO）滤膜将洗脱液浓缩至300 μL，并将截留物转移至低吸附性微量离心管中。
    7. 用100 μL S Basal溶液涡旋洗涤滤膜两次，每次20秒，并将缓冲液吹打过滤膜表面。将洗涤液加入初始样品中，最终体积为500 µL。
    8. 根据制造商说明书添加蛋白酶抑制剂混合物。
    9. 立即进行后续实验（如RNA测序、液相色谱-串联质谱、气相色谱-串联质谱、Western blot、流式细胞术等），或于-80 °C保存。

5. 细胞外囊泡丰度的流式细胞术定量

  1. 染料制备
    1. 使用新鲜的DMSO配制10 mM的DI-8-ANEPPS储备液。分装至 10 μL 分装并储存于 -20 °C.
    2. 通过添加制备 1 mM 的工作液 90 μL 加入无菌过滤的 PBS 至含有样本的离心管中 10 μL 染料储备液
  2. 实验样品制备
    1. 添加 840 μL 将 S 基础溶液加入微量离心管中。然后加入 60 μL 4.2 节制备的纯化 EVs 并涡旋震荡。
    2. 等分试样 300 μL 将样品均分至两个新的微量离心管中。此时，已有三管实验样品，包含 300 μL 每份加入稀释后的EVs。将离心管标记为#1–#3。向样品#2和#3中加入 7 μL 5.1.2 中配制的 DI-8-ANEPPS 储存液，然后加入 7 μL 向3号管中加入1% Triton-X 100。涡旋振荡混匀各管。
    3. 将超声探头置于样品3的中央，以20%功率、30%占空比脉冲处理10次。
      注意：确保超声波破碎仪探针尖端位于样品中央，以尽量减少泡沫产生。泡沫可能导致细胞外囊泡（EVs）聚集，从而影响样品质量。
    4. 添加 300 μL 向两支微量离心管中加入 S 基础溶液。添加 7 μL 将第5.1步配制的DI-8-ANNEPS工作试剂加入第二支试管，并标记为“Dye Only”。将另一支试管标记为“Buffer Only”。
      注意：使用相同的 S 基础培养基来源制备染料对照样品和缓冲液对照样品以及实验样品。
    5. 将样品在室温下避光孵育1小时。
  3. 进行流式细胞术实验。
    1. 将流式细胞仪的激发滤光片设为 488 nm（蓝色），发射滤光片设为 605 nm（橙色）。将流速设为 1.5 μL 每分钟
    2. 运行纳米珠FACS校准混合液（可选，但推荐）。
    3. 每个样本在FACS仪器上运行3分钟（180秒）。准确记录以秒为单位的运行时间。
  4. 分析FACS数据。
    1. 使用 FACS 分析软件打开文件。
    2. 切换 Y 轴至 488-Org（面积） 通过点击 轴，从下拉菜单中选择。
    3. 从图谱顶部开始设置一个矩形门，横跨SALS水平102 至 104 (<300 nm 大小的颗粒）。将门控范围向下延伸，直至其包含总事件数的 2.5%。将该门命名为“DI-8-ANEPPS+”事件。
  5. 样本EV丰度的定量分析
    1. 将此门控复制并粘贴到实验组中的另外两个样本，以及“仅缓冲液”和“仅染料”对照样本上。将分析结果导出至电子表格。
    2. 如果FACS样本的运行时间未达到推荐的3分钟（180秒），则需将样本中所有事件数标准化为每180秒的事件数。例如，若某样本运行了250秒，则DI-8-ANEPPS+事件数应乘以250秒/180秒进行校正。
    3. 通过从样本#2中的DI-8-ANEPPS+事件数中减去“仅染料”对照组中的DI-8-ANEPPS+事件数，消除染料背景信号。
    4. 通过减去样本#1中DI-8-ANEPPS+事件的数量，去除同型对照背景信号。
    5. 通过减去样本 #3 中 DI-8-ANEPPS+ 事件的数量，去除去污剂不敏感的事件。该数值即为真实的 EV 数量。
    6. 计算EVs的数量 1 μL 通过将步骤5.5.5中计算的数值除以所分析的样品体积来计算样品的 μL (4.5 μL 按照第5.3步所述进行分析，并乘以稀释倍数（第2.5步所述的10倍）。将该数值乘以数量 μL 保留在EV制备物中的EV数量。这是可用于下游分析的EV数量。

流式细胞术分析；FACS 散点图；使用染料检测EV；样品制备步骤；数据表结果。
图 2：定量EV丰度的流式细胞术样品制备示意图。 （A）EV制备物被分为三个相同的样品。样品#1为无染料阴性对照。随后将DI-8-ANEPPS加入样品#2和#3中。然后向样品#3中加入Triton-X 100。绿色箭头表示仅对样品#3进行后续超声处理。流式数据有助于确定FACS样品中去垢剂敏感性EV的绝对数量，并进一步计算总制备物中EV的丰度。染料阳性事件的设门依据不含染料的样品#1来确定。表格数据中的红色文字用于说明：需从染料标记的样品中减去经去垢剂处理样品的染料阳性事件数。（B）用于定量FACS分析样品中EV数量并计算样品中EV总数的计算公式。请点击此处查看此图的放大版本。

结果

生成和纯化EVs所需步骤的示意图如图所示 图1各步骤所需的典型时间如下所示。 图2 显示使用DI-8-ANEPPS制备用于流式细胞术分析样品的示意图（图2A）以及估算样本中EVs总数所需的计算方法（图 2B).

10 次生物学重复的代表性结果如图 3A所示。重复样本之间的变异性不显著，种群数量的典型标准误（S.E.M.）略高于 10%（图 3B）。通过过滤线虫并在新鲜的高密度培养板上培养，可获得大量处于产卵期的成虫，适用于次氯酸钠同步化处理。单个饥饿板经此方法处理后，可产生 1 × 106 或更多的同步化子代，因为每条产卵期成虫体内约含有 10 个卵。通过使用 40 μm 滤膜过滤卵和幼虫以从较老的个体中收集卵囊（EVs），可维持大量发育同步化的种群。滞留在滤膜上的成虫以每板 20,000 条的密度转移至新的高密度培养板，该过程每 2 天重复一次。图 3C展示了三次生物学重复中线虫种群在三次板间转移的过程。板间转移过程导致约 10% 的线虫损失（图 3C），而在蔗糖漂浮步骤中约有 20% 的线虫损失（图 3D）。

幼虫分布与线虫种群分析；含标准误、小提琴图、柱状图的数据图。
图3：用于细胞外囊泡（EV）分析的大量 C. elegans 种群的定量分析。（A）从单个近期饥饿（<24 h）的高密度培养平板中分离出的L1幼虫期线虫数量的比较。绘制了10次生物学重复中每次的数值，并以小提琴图和带标准误（S.E.M.）的柱状图展示了10次重复中所有数据点的总和。结果表明，单个近期饥饿的平板可获得约80,000条L1幼虫期线虫。（B）将图A中15次不同平板种群测量值的S.E.M. 以单独的点绘制。通常，S.E.M. 略高于10%。（C）在每4小时进行一次转移的情况下，共进行两次平板间转移后，估算了三次生物学重复的线虫种群数量。动物在平板间的转移并未导致种群数量显著下降。这表明本文所述的线虫转移方法不会造成动物的显著损失。（D）在三次EV实验重复过程中进行的种群测量：包括实验起始时L1幼虫的估算数量、蔗糖漂浮法回收并准备进入24小时孵育期的年轻成虫数量，以及EV制备过程中回收分泌组时计数的动物数量。从L1幼虫期初始种群估算值到动物发育为年轻成虫后，种群数量略有下降，但无统计学意义。将平均L1种群数量设定为100%，其余测量值均按与此值的比例进行标准化。误差线表示S.E.M。* = 参数化配对t检验中p值 < 0.05，N.S. = 无显著性差异。请点击此处查看本图的放大版本。

蛋白与动物数量比是表征细胞外囊泡（EV）制备物的一种有用指标。该指标可快速判断不同EV制备物之间的一致性。平均而言，1,000只野生型年轻成虫会向环境中分泌超过10 kDa的蛋白质约1 μg（图4A）。当该组分进一步通过尺寸排阻色谱分离时，总蛋白洗脱曲线显示在2–6 mL之间有一个较小的蛋白峰，以及在8 mL之后出现一个较大的峰。EV主要存在于色谱柱洗脱液的前5 mL中（图4B）。纳米颗粒追踪分析表明，色谱柱洗脱液的前5 mL含有单一分散的小型EV群体，粒径约为150 nm（图4C）。尺寸排阻组分的透射电子显微镜观察显示，在2–6 mL洗脱组分中存在大量EV，而在后续洗脱体积中则未见。EV具有典型的杯状形态，因此在负染色条件下易于与呈现为点状亮斑的固体颗粒相区分（图4D）。

通过色谱法、图表和显微镜进行蛋白质分析；显示洗脱曲线和颗粒图像。
图4：C. elegans 细胞外囊泡（EVs）从总分泌生物量中的纯化。（A）绘制了10个生物学重复样本中，每个样本孵育的线虫数量与大于10 kDa的总蛋白量之间的比值。大多数样本每1,000只动物含有约1 μg蛋白。（B）将1 mL浓缩分泌物上样至10 mL树脂柱后的蛋白洗脱曲线。后续分析中合并的组分以阴影标示。（C）合并的树脂洗脱组分（2–6 mL）的纳米颗粒追踪分析结果。95% 置信区间以灰色阴影表示。（D）合并洗脱组分的透射电镜（TEM）分析。起始材料中同时含有类囊泡颗粒和非囊泡颗粒。合并的2–6 mL洗脱组分中囊泡富集，非囊泡颗粒较少；7–11 mL合并组分中类囊泡颗粒稀少而非囊泡颗粒较多；12–15 mL洗脱组分中仅含非囊泡颗粒。所有显微图像均以相同放大倍数显示。比例尺 = 200 nm。请点击此处查看该图的高清版本。

为了直接比较流式细胞术特征之间的差异 秀丽隐杆线虫 以及人源EVs，我们采用该方法从人神经元细胞培养的条件培养基中纯化EVs。流式细胞术根据光散射对颗粒进行分离。小角度光散射（SALS）大致与颗粒大小相关，而大角度光散射（LALS）则与内部膜结构相关。来自细胞培养及 秀丽隐杆线虫 EV 制剂紧密聚集于以 10 为中心的簇群中3 SALS 和 104 LALS（图5A）。一个直方图 秀丽隐杆线虫 根据SALS对EV样本事件进行分选显示，所有制备样品的峰值均出现在约103 (图5B).

静态平衡图、直方图，比较秀丽隐杆线虫和人诱导多能干细胞来源的细胞外囊泡；流式细胞术分析。
图5：C. elegans 来源的细胞外囊泡可通过其光散射特性被明确识别。（A）来自三个生物学重复的 C. elegans 细胞外囊泡的小角度光散射（SALS）事件直方图。约80%的总样本事件集中在一个紧密且界限清晰的群体中。与纳米颗粒追踪分析类似，该结果表明 C. elegans 细胞外囊泡的粒径分布呈单一分散状态。图中同时展示了用于稀释样本的 S 基础缓冲液的直方图作为对照。（B）采用本文所述方法纯化的 C. elegans 与人细胞培养来源细胞外囊泡的折射特性比较。两类细胞外囊泡在小角度和大角度光散射分布（SALS 和 LALS）上均表现出一致且相似的特征。请点击此处查看该图的放大版本。

C. elegans EVs 能被 DI-8-ANEPPS 强烈标记，在 C. elegans 和细胞培养来源的样本中均能持续突出显示大部分总事件。校准微球和对照组结果见图6A。C. elegans 样本的单个 FACS 散点图来自一个由 200,000 只动物制备的样本（#1）以及两个由 500,000 只动物制备的样本（图6B）。同样分析了来自 100 mL（#1）或 200 mL（#2,3）细胞培养液的 EVs（图6C）。无论是 C. elegans 还是细胞培养来源的样本，均显示出大量荧光事件，而在经 0.05% Triton-X 100 处理并进行弱超声后，这些荧光事件消失。这表明所标记的事件是去污剂敏感的磷脂结构（囊泡），而非对去污剂不敏感的固态脂蛋白聚集体。EVs 的丰度计算方式为：DI-8-ANEPPS+ 门控内无去污剂（-）与含去污剂（+）组之间的事件数之差，再减去“仅染料”对照组的事件数。为便于理解，图6B 和 图6C 中单独展示的数据在 图6D 和 图6E 中以柱状图形式汇总。纯化的 EVs 在 C. elegans 与细胞培养来源的样本之间丰度无显著差异（图6F）。

利用秀丽隐杆线虫和细胞培养结合蛋白质染料分析细胞外囊泡的流式细胞术图谱
图6：用于计算EV丰度的流式细胞术数据示例。 (A为了确保不同样本间的事件数可直接比较，需以与EV样本组分相同的流速和采集时间运行“仅缓冲液”和“缓冲液与染料对照”对照组。在DI-8-ANEPPS门控中事件数极少。BDI-8-ANEPPS 及去垢剂处理方案的代表性结果 秀丽隐杆线虫. 显示了三个生物学重复。生物学重复 #1 来自 200,000 个动物，而 #2 和 #3 来自 500,000 个动物。在所有情况下，去污剂处理导致 EVs 消失的现象均十分明显。 (C) 使用人细胞培养条件培养基进行DI-8-ANEPPS和去垢剂处理方案的代表性结果。生物学重复#1和#2由200 mL条件培养基制备，而生物学重复#3由100 mL条件培养基制备。D) 从三次生物学重复实验中收集的数据绘制的柱状图 秀丽隐杆线虫 EVs。误差线 = 标准误。处理组间配对双尾 t 检验。*** = p 值 < 0.001. (E) 从三组细胞培养来源的细胞外囊泡（EVs）生物学重复实验中收集数据绘制的柱状图。组间采用配对双尾t检验。*** = p值 < 0.001 (F染料标记的去垢剂敏感事件数量 μL 针对所有生物学重复样本计算了 C. elegans 以及细胞培养。两种EV样本来源之间的数值差异无统计学显著性。处理组间的配对双尾t检验p值 = 0.685。 请点击此处以查看此图的放大版本。

表1 包含了每种样本类型分析的4.5 μL原始实验数值。从500,000只动物纯化的EV组分中收集到的总事件数，比仅用缓冲液收集到的背景颗粒数高出10–20倍；而从200,000只动物纯化的组分中的事件数约为缓冲液对照的2倍。每个样本在DI-8-ANEPPS+门控内的事件数也一并列出。这些数据可导入电子表格，用于计算如上所述的染料阳性、去污剂敏感型EV数量。例如，第一个显示的C. elegans生物学重复样本每1 mL中的EV数量可按如下方式计算：

(18,974 – 3,853 - 1,487) × (10/4.5) × 1,000 = 30,297,778。

表1：流式细胞术数据汇总。 图6 中所示数据以电子表格形式呈现。对于每个样本，列出了总事件数以及 DI-8-ANEPPS+ 门控内的事件数。每个生物学重复按照实验方案中样本 #1–3 的顺序排列。这些指标显示，从 500,000 只动物或 200 mL 细胞培养条件培养基制备的 C. elegans 样本中收集到的总事件数，比仅用缓冲液收集到的背景颗粒数高出 10–20 倍；而从 200,000 只动物纯化的生物学重复样本中收集到的总事件数约为缓冲液对照的 2 倍。每个样本在 DI-8-ANEPPS+ 门控内的事件数也一并列出。这些数据可导出至电子表格，用于计算囊泡（EV）的总数。请点击此处查看该表格（右键点击可下载）。

讨论

EV 领域的一个基本挑战是分离多种多样的 EV 亚型2。本文所述方法利用过滤、差速离心和尺寸排阻色谱法来获得纯度较高的小 EV 群体，因为先前研究表明，约 100 nm 的 EV 可被分泌到外部环境中，并在具有生理相关性的细胞通讯通路中发挥作用16。通过尺寸排阻色谱法纯化的 EV 仍可能包含外泌体和小型微囊泡的混合物，因为这些 EV 亚类的大小相似。脊椎动物的 EV 亚类通常通过免疫沉淀法进行分离，因为该方法可通过特异性膜蛋白标志物结合来富集 EV。本文所描述的方法有助于鉴定 C. elegans EV 的膜标志蛋白，因此未来有可能通过类似的免疫沉淀方法进一步分离小 EV 的不同亚类。理论上，免疫沉淀法可用于从喂养良好的线虫中分离 EV，因为 E. coli 的 EV 不应与抗体发生相互作用。若研究人员希望鉴定较大 EV 亚类（>200 nm）的蛋白质和遗传物质内容物，可通过跳过 0.22 μm 过滤步骤，转而分析沉淀物而非上清液来实现。揭示大尺寸 EV 的蛋白质和遗传物质丰度，将有助于更全面地理解依赖 C. elegans 分泌组发挥作用的生理过程。除了被分泌到外部环境外，C. elegans 的 EV 还可在体内不同组织间进行内部传递。因此，这些方法仅能分离出全部 C. elegans EV 的一个子集。然而，目前尚无法对内部 EV 进行内容物分析，因为尚无有效方法可将 EV 与裂解的线虫组分分离。对外部分泌 EV 子集的内容物分析，为鉴定潜在的通用 EV 蛋白标志物提供了途径，这些标志物未来或可用于标记内部 EV。

EV 制备的规模取决于实验需求。总共 500,000 只年轻成虫可提供足够的 EV，用于并行进行流式细胞术、LC-MS-MS 和 RNAseq 分析。此数量可根据实验需要相应放大或缩小。放大过程中最主要的实践限制因素是所需 10 cm 高密度培养板的数量。使用 500 μL 20 倍浓缩的过夜 NA22 培养物制备的高密度培养板，可支持约 50,000 只成虫从 L1 幼虫阶段生长至成虫第一天。因此，若要进行涉及 500,000 只成虫的实验，共需 13 块高密度培养板：1 块用于产生 L1 群体，2 块用于培养用于漂白的成虫，10 块用于实验动物的生长。这些参数取决于高密度培养板的接种量和细菌生长条件。因此，建议以标准化方式制备所有培养板，并使用已知数量的动物进行校准。

在培养过程中，线虫在两个阶段进行计数：1）接种到培养板之前，以及2）制备条件培养基之前。已有研究表明，动物培养密度会影响其行为、发育和应激反应15,16,17,18，因此也可能影响细胞外囊泡（EV）的 cargo 成分。为了保持一致的培养密度，必须准确估算线虫种群数量。通过计数九滴样品中的线虫数量，可使种群估算具有统计学可信度。每一滴样品必须单独处理，每取一滴之间需充分涡旋混匀，并将移液器插入线虫悬液的深度保持一致。采取这些预防措施可使标准误（S.E.M.）值控制在总种群数的约5–10%范围内。如果线虫种群的S.E.M.超过20%，则说明操作过程中出现了问题。

在无细菌孵育24小时后，年轻的野生型C. elegans被添加到细菌菌苔上时会立即爬行。这表明孵育过程并未对其健康造成严重影响。然而，该步骤确实会影响动物的生理状态，因此可能影响细胞外囊泡（EV）所携带物质的组成。因此，在使用病情较重的基因型或较老的动物时，必须在孵育步骤后检查其存活率。如果所有动物无法全部存活，则应增加实验群体数量并缩短孵育时间。当处理大量条件培养基时，使用由再生硝酸纤维素滤膜制成的搅拌式浓缩装置更为实用。此类滤膜对EV的结合能力弱于其他类型的滤膜14。

从条件培养基中回收的总蛋白量与用于制备的动物数量之间的比值是一个有用的指标。如果该比值显著高于预期，则可能存在种群数量估算偏差，或部分动物在条件培养基中死亡并发生降解。如果该比值显著低于预期，则可能在浓缩过程中部分蛋白质滞留在滤膜上而造成损失。尽管FACS方法可直接定量EVs的颗粒数量，但该指标仍然具有参考价值，因为它能够在制备早期提示样本异常。另一种验证EV制备质量的有效方法是透射电子显微镜（TEM）分析，如图4D所示。尽管由于篇幅限制，本文未正式纳入透射电子显微镜的具体操作流程，但可按照标准方法进行。建议至少在初期将该分析方法作为FACS的补充手段，用于评估EV制备的质量。为获得最佳结果，应使用 freshly discharged formvar-carbon grids，并采用2%磷钨酸（phosphotungstic acid）而非醋酸铀酰（uranyl acetate）对样本进行染色。

选择DI-8-ANEPPS是因为其已被证明可对细胞外囊泡（EV）膜进行定量标记，在使用人活检样本和脂质体时的表现优于其他通用EV染料25。该检测方法快速，每个样本仅需3分钟采集时间。对去垢剂敏感性EV的定量具有直接的功能意义，因为它利用了EV与固态脂蛋白聚集体之间的一个基本物理差异。重要的是，该方法不受总蛋白量或非EV聚集体数量的影响，因此能够以无偏倚的方式量化通过不同纯化方法获得的EV。本文所描述的经流式细胞术（FACS）验证的EV检测指标，将特别有助于展示纯化EV生理效应的研究。该方法也有望推动EV领域建立一种基于FACS技术的通用度量标准，从而实现不同研究之间EV绝对丰度的直接比较。活体染料也可标记秀丽隐杆线虫（C. elegans）的EV，但其荧光强度不及使用Di-8-ANEPPS标记的EV。

该纯化方法利用完整活体蠕虫将细胞外囊泡（EVs）主动分泌到体外的特性。这使得 秀丽隐杆线虫 EVs 的纯度和丰度应达到与细胞培养物中分离的EVs相当的水平，该标准足以通过LC-MS-MS和RNA测序分析鉴定数百种蛋白质和RNA cargo26因此，可获取的大量试剂库可用于 秀丽隐杆线虫 该研究可用于探究遗传和生理扰动对细胞外囊泡（EV）内容物组成的影响。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

我们衷心感谢 Nick Terzopoulos 提供的线虫培养板和试剂；感谢美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）下属的Caenorhabditis遗传中心（CGC）提供 N2 线虫品系；感谢 Lucia Vojtech 博士在纳米颗粒追踪分析方面的协助；感谢 Jessica Young 博士和 Marie Claire 医学博士、博士在 hiPSC 来源神经元条件培养基方面的支持；感谢 Wai Pang 在透射电子显微镜成像方面的协助。本研究得到了 NIH 资助项目 P30AG013280（MK 负责）和 NIH 资助项目 AG054098（JCR 负责）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 μm 滤膜单元Genesee25-233用于去除条件培养基中的碎片
1% Triton X-100 溶液ThermoFisherHFH10将其加入至 0.05% 以裂解细胞外囊泡（EVs）
10 cm 高壁培养板N/AN/A用于大量培养线虫
2 L 底部带挡板摇瓶ThermoFisher4110-2000PK用于进行细胞外囊泡（EVs）的尺寸排阻分离
40 μm 网筛AmazonCMY-0040-C/5PK-05用于分离成虫与幼虫阶段的线虫
5 μm 网筛AmazonCMN-0005-C用于分离 L1 幼虫与其他发育阶段的线虫
6 cm 标准生长培养基线虫培养板N/AN/A用于小规模培养线虫
Amicon Ultra-15 离心过滤器，10 kD 截留分子量（mwco）MilliporeSigmaC7715用于浓缩尺寸排阻洗脱液
Amicon Ultra-4 离心过滤器，10 kD 截留分子量（mwco）MilliporeSigmaC78144用于浓缩条件培养基
Apogee A50 流式细胞仪Apogee该流式细胞仪专用于检测纳米级颗粒
ApogeeMixApogee1493用于评估流式细胞术（FACS）的光散射和荧光性能
DI-8-ANEPPSThermoFisherD3167以 20 μM 浓度添加以标记细胞外囊泡（EVs）
一次性层析柱BioRad7321010用于进行细胞外囊泡（EVs）的尺寸排阻分离
明胶（Gelatin）MilliporeSigmaG9391-100G用于处理移液器吸头，防止线虫粘附
HALT 蛋白酶抑制剂ThermoFisher87785添加至细胞外囊泡（EV）样品中以防止蛋白质降解
低蛋白吸附收集管ThermoFisher90410用于存放细胞外囊泡（EV）样品
NaClSigmaS7653-1KG用于线虫的蔗糖漂浮法分离
S 基础缓冲液（S Basal buffer）N/AN/A配方见 WormBook
Sepharose CL-2B 树脂MilliporeSigmaCL2B300-100ML用于进行细胞外囊泡（EVs）的尺寸排阻分离
小型轨道摇床ABC Scientific83211301用于线虫 S 基础缓冲液的孵育
蔗糖（Sucrose）SigmaS8501-5KG用于线虫的蔗糖漂浮法分离

参考文献

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