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方法文章

一种改良的手术方法以在豚鼠中诱导膜迷路积水

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DOI：

10.3791/60597

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2020年6月4日

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1Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Washington University School of Medicine in St. Louis

本文内容

摘要

本文展示了一种硬膜外入路，使用精细探针破坏豚鼠的内淋巴囊并损伤内淋巴管，以诱导实验性内淋巴积水。

摘要

内淋巴积水是一种蜗管的扩张，通常与梅尼埃病相关，但其病理生理机制尚不明确。为了充分研究内淋巴积水的特征，例如低频听力损失的成因，需要一个可靠的动物模型。豚鼠是一个 理想的模型，因为它能感知低频声音，而这些频率范围正是内淋巴积水可能影响的区域。以往的研究表明，可通过硬膜内或硬膜外手术途径，通过磨除内淋巴管和内淋巴囊区域来诱导内淋巴积水。然而，是否可以采用一种避免在内淋巴管和内淋巴囊上进行危险钻孔的硬膜外入路来建立内淋巴积水模型，此前尚不清楚。本研究的目的是展示一种改良的硬膜外入路方法，通过使用精细探针破坏内淋巴囊并对内淋巴管造成损伤，在术后30天成功诱导实验性内淋巴积水。实验共使用七只豚鼠。进行听力功能检测后，取颞骨进行组织学分析。该方法在诱导内淋巴积水方面的成功率达到86%。脑脊液漏的风险极低。样本中未发生围手术期死亡或后半规管损伤。所介绍的方法展示了一种安全且可靠的方式，可在相对较短的30天时间内诱导内淋巴积水。该方法的临床意义在于，为深入探索与内淋巴积水相关的低频听力损失的成因提供了一个可靠的模型。

引言

内淋巴积水是指蜗管的扩张。可通过测量蜗管的横截面积来评估内淋巴积水的存在。临床上认为，内淋巴积水可能与低频感音神经性听力损失相关，例如梅尼埃病中所见的听力损失。 但此类听力损失的病因尚不明确。为了深入研究与内淋巴积水相关的低频听力损失的发病机制，需要建立一种可靠的模型。

1965年，Kimura和Schuknecht描述了如何通过硬脑膜内入路在豚鼠中诱导内淋巴积水1。他们的技术采用后颅窝入路，以到达前庭导水管隐窝和弓下窝。操作步骤包括切开硬脑膜，用浸有林格氏液的棉片牵开小脑，并磨除内淋巴管及内淋巴囊的中段部分。随后将骨蜡填入前庭导水管隐窝，以隔离内淋巴管与远端的内淋巴囊。通过放置可吸收的明胶粉（例如Gelfoam）并重新对合覆盖的肌肉来关闭颅骨缺损。术后第1、3、7、14、21和30天均一致观察到组织学上的内淋巴积水证据，表明硬脑膜内入路是一种可靠的方法 ，可诱导出经组织学证实的内淋巴积水。Salt和DeMott采用与Kimura和Schuknecht相同的硬脑膜内入路，但在不同的时间点进行观察，证实耳蜗第二回的中阶在术后第4天及之后显著扩张2。尽管原始研究中未报告采用Kimura和Schuknecht硬脑膜内入路诱导脑脊液（CSF）漏的实际发病率，但脑脊液漏的存在可能增加脑膜炎的风险。有研究提示，脑脊液的丢失可能导致外淋巴流失，从而引起豚鼠内淋巴容积的同步暂时性扩张3。因此，采用硬脑膜外入路诱导内淋巴 积水将是一种更安全的选择。

1989年，Andrews和Bohmer描述了两种经硬膜外入路到达内淋巴囊和内淋巴管的外科手术方法，即经中颅窝入路或经后颅窝入路，以闭塞内淋巴囊4。他们描述了使用金刚石钻头去除盖板，然后通过钻除内淋巴囊的中间部分，或使用精细的钩针破坏内淋巴囊和内淋巴管。1993年，Lee、Wright和Meyerhoff描述了一种类似的方法，包括钻穿内淋巴囊和内淋巴管，但不同之处在于他们同时阻塞了耳蜗导水管5。他们在闭塞内淋巴囊并阻塞耳蜗导水管后四周，通过组织学评估证实了内淋巴积水的存在。Megerian等人首次发表了一篇视频文章，展示了经硬膜外途径闭塞内淋巴囊和内淋巴管的手术操作，该方法涉及直接在盖板内侧部分进行钻孔，以进入内淋巴囊和内淋巴管6。他们在术后28周处死的豚鼠中观察到了组织学上的内淋巴积水证据，并发现16 kHz频率区域出现听力损失6。然而，是否可通过硬膜外入路在早期时间点诱导出经组织学证实的内淋巴积水及低频听力损失，尚不清楚。

本报告的总体目标是通过使用精细探针破坏内淋巴囊并损伤内淋巴管，展示一种硬膜外入路方法，以在术后30天诱导产生实验性内淋巴积水。采用该技术的原理在于其具有避免磨除岩部颞骨的优越性，从而消除了意外损伤硬脑膜导致脑脊液漏的风险，降低了损伤后半规管的可能性，并减少了对乙状窦造成损伤的风险。

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方案

以下“实验方案”部分列出的所有操作均按照圣路易斯华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

1. 麻醉诱导与生命体征监测

注意：本研究使用了来自内部繁殖种群的有色毛发NIH品系豚鼠。

  1. 使用任一性别的豚鼠，体重至少350 g。
  2. 将豚鼠置于新生儿暖箱中，并通过腹腔注射给予氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮50 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg）以诱导麻醉。观察豚鼠直至其失去脚趾夹捏反射。
  3. 一旦豚鼠的足夹反射消失，使用通常用于人类的毛发修剪器剃除其后颈部和头部的毛发。
  4. 皮下注射 12 mL乳酸林格液推注至动物背部。
  5. 将豚鼠仰卧置于加热垫上，四肢抬高，经腹腔插入27.5 G蝶形针头。通过抽吸确认仅抽出空气，以验证蝶形针头位于正确的腹腔内位置。若抽吸出血液或液体，则提示可能误入血管或肠道系统。 蝶形针用于反复给予麻醉剂。
  6. 将豚鼠翻转至俯卧位，并将其头部固定于立体定位仪上。
  7. 固定 将脉搏血氧仪连接至足部。若使用有色毛发的豚鼠，有色的足掌可能影响血氧饱和度读数。因此，应将脉搏血氧仪置于无色素沉着的足掌上。
  8. 插入直肠温度探头以监测体温。直肠探头是温控毯系统的一部分，用于维持体温在38 °C。在直肠探头就位前，切勿开启温控毯，以免导致温控毯过热。若放置直肠探头存在困难，可将其沿豚鼠体侧放置。
  9. 为豚鼠的双眼涂抹润滑剂，以防止角膜擦伤。
  10. 根据需要通过靠近鼻部的橡胶管给予辅助氧气，以维持血氧饱和度在90%以上。
  11. 皮下注射0.5 mg/kg恩诺沙星作为抗生素预防用药。
  12. 在预期切口部位皮下注射0.25 mg/kg布比卡因（含1:100,000肾上腺素）以实现局部麻醉和血管收缩作用。
  13. 每20分钟给予一次维持麻醉 重复4个循环，之后根据生命体征按需进行。常规通过体温、呼吸频率、血氧饱和度和心率监测麻醉深度。
  14. 每15分钟监测一次生命体征（体温、呼吸频率、心率和血氧饱和度）。

2. 手术准备

  1. 将豚鼠头部牢固地固定在立体定位仪中后，在其背部贴上一条医用胶带，以在枕部皮肤表面提供足够的张力。将胶带两端固定在立体定位仪上。
  2. 采用无菌技术，使用聚维酮碘和70%乙醇交替进行三次消毒，彻底清洁枕部及后颈部皮肤。
  3. 此时应采取无菌防护措施，并使用经高压灭菌的器械。将无菌手术单覆盖在豚鼠身上。

3. 手术步骤

  1. 使用15号刀片，在枕骨后部中线处做一个小切口，并向下延伸至后颈部。切开皮肤后，使用虹膜剪将右侧颈后肌肉从枕骨上分离。若在切割肌肉时发生出血，可用无菌棉球压迫止血。
  2. 结合使用#3 mm、#2 mm和#1 mm金刚砂钻头，配合5-0吸引器及无菌冲洗液，进行颅骨开窗术，开窗范围以枕外隆凸、人字缝嵴、枕乳缝线以及枕骨大孔背侧缘为界。
    1. 在分离枕骨与硬脑膜时，将一小块生理盐水浸湿的棉球 轻轻置于骨下。
  3. 使用#0.5 mm金刚砂钻头暴露乙状窦，并小心去除其上方的骨质。
  4. 暴露乙状窦后，用棉球将其轻轻向内侧牵拉，并更换为3-0吸引器。
  5. 确认壶腹（operculum）为位于岩部颞骨内的狭缝样结构。前庭上窝位于其上方，乙状窦位于其内侧。内淋巴囊的骨外部分则表现为一个透明的囊状结构，进入壶腹并附着于覆盖乙状窦的硬脑膜上。壶腹呈椭圆形，大小约为3至4 mm × 1.5至2 mm。然而，从手术视野观察时，壶腹呈现为约1 mm宽的狭缝。从手术视角可见的内淋巴囊部分，其大小通常与可见的壶腹部分相当，甚至更小。
  6. 向内侧轻柔牵拉乙状窦，以清晰显露内淋巴囊的骨外部分，并增加其骨外段与骨内段之间的张力。
    1. 使用精细弯钩轻轻清除内淋巴囊的中间部分。清除过程中必须确保硬脑膜与壶腹之间无任何可见连接；随后将精细钩插入壶腹内部，广泛刮擦骨内壁以造成损伤。
    2. 将精细钩朝向内淋巴管方向旋转，并盲目破坏其内衬组织。此时壶腹内血管可能出血，可用小块棉球控制出血。
  7. 用一小块棉球将空的壶腹干燥。必要时使用3-0吸引器保持棉球干燥。
  8. 用小刮匙刮取颞骨鳞部的骨屑，充分将骨屑填塞入壶腹内。填塞过程中使用棉球和吸引器保持术区干燥。
  9. 在壶腹上涂抹骨蜡以封闭之。确保无多余骨蜡脱落进入颅腔。
  10. 用骨蜡覆盖颅骨 缺损区域。
  11. 使用4-0编织可吸收缝线，以间断方式缝合颈后部肌肉。
  12. 使用4-0编织可吸收缝线行皮下连续缝合。

4. 术后护理

  1. 将豚鼠从定制的立体定位仪中取出，转移至保温培养箱中。
  2. 给予阿替美唑 2 mg/kg 和乳酸林格氏液 24 mL（皮下注射，远离切口处）。由于赛拉嗪具有利尿作用，因此给予乳酸林格氏液。术后给予美洛昔康 0.2 mg/kg（皮下注射）以提供镇痛作用。
  3. 每15分钟测量一次生命体征，直至豚鼠完全从麻醉状态中苏醒。
  4. 在手术结束前约2小时的恢复期间，额外给予12 mL乳酸林格液快速输注。
  5. 当豚鼠恢复清醒、能够自主行走、排尿且排便后，将其送回动物房。豚鼠完全从麻醉状态中苏醒大约需要2至4小时。
  6. 术后前三天，每天两次监测豚鼠的状况。 若观察到不适症状，可根据需要每24小时皮下注射0.2 mg/kg美洛昔康。 或者，若美洛昔康未能充分控制症状，可皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）。 
  7. 每天两次皮下注射12 mL乳酸林格液，持续给予，最多不超过 在豚鼠达到术前体重之前，持续给予液体冲击治疗，最长至术后第三天。如果豚鼠在术后第三天之前已达到术前体重，则停止液体冲击治疗。如果豚鼠在术后前三天持续体重下降，可使用通常面向人类消费 marketed 的营养补充饮品，与压碎的豚鼠饲料颗粒混合后给予。
  8. 每周监测豚鼠直至实验终点。

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结果

本研究采用硬膜外入路方法，使用精细探针破坏7只豚鼠（2只雄性，5只雌性）的内淋巴囊并对内淋巴管造成损伤。手术从切开至缝合的平均持续时间为2小时，总钻骨时间在5至10分钟之间。豚鼠完全从麻醉中苏醒最长需要4小时。实验样本中未发生术中或术后死亡事件。所有豚鼠均未出现后半规管或硬脑膜损伤。1只豚鼠发生乙状窦损伤（该动物被排除在数据分析之外）。

在处死当天（术后第30天），豚鼠接受了第二次手术，以进行听觉功能检测，包括听神经重叠波形（ANOW）和耳蜗复合动作电位（CAPs）的测量。ANOW和CAP的测量及分析均采用先前描述的方法7,8,9。ANOW是一种完全来源于耳蜗顶部半区神经兴奋的纯神经性测量指标7,<...

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讨论

本研究所采用的硬膜外方法在成功诱导组织学证实的膜迷路积水及低频听力损失方面的成功率为86%。该方法在术后第30天可稳定地获得膜迷路积水的组织学证据，结果与既往采用硬膜内途径的研究一致2。该方法相较于现有方法的优势在于无需造成脑脊液渗漏，从而消除了可能引起内淋巴液代偿性、暂时性扩张的潜在混杂因素3。总体而言，该方法展示了一种快速、安全且可靠的实验性膜迷路积水诱导方式。

与以往研究相比，本方法具有多项优势。首先，该手术入路位于硬膜外，可最大程度地减少脑脊液漏带来的潜在并发症及其混杂效应。其次，通过使用精细探针而非钻头来清除球囊囊并损伤球囊管，该方法避免了对后半规管造成潜在损伤。其中关键步骤是确保硬膜与隐窝盖之间无可见连接。第三，在颞骨操作中使用精细探针代替钻头，可最大限度降低因在岩部颞骨上钻孔所导致的声学创伤风险。最后，该方法提供了一套优化的围手术期动物处理方案，以确保豚鼠术后快速恢复并顺利完成术后观察过程。本方法的局限性在于使用了氯胺酮/赛拉嗪麻醉方案，这一问题可通过采用允许异氟烷给药的立...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Shannon M. Lefler 在图表和材料表方面提供的协助。本出版物中报道的研究工作得到了美国国立卫生研究院下属的国家耳聋及其他沟通障碍研究所的资助，通过以下项目支持： "学术耳鼻喉科中临床医生/研究人员的培养" 培训资助，编号T32DC000022（C.V.V.）以及R01 DC014997（J.T.L）。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 mL 注射器Henke-Sass Wolf5100-X00V0
1 mL 和 3 mL 注射器BD Precision（从 Fischer Sci 订购）14-826-87 15859152
27.5 号蝶形针头Terumo Surflo 翼状输液器，Terumo Corporation，日本（通过 McKesson 公司订购）448407
4-0 缝合线McKesson1034507
4 块 4 克纱布海绵Dukal（向McKesson订购）374454
60 mL 注射器Fisher Sci22-031-375
Anspach 耳科钻机AnspachSC2100
阿替美唑硕腾107204-6
高压灭菌Fisher sci15-103-0508
高压灭菌袋McKesson524881
刺刀式分离器OlympusAL 130564
布比卡因auro Medics Pharma555150-169-10
透明无菌铺巾3M1020
棉球Fisherbrand（从 Fisher Sci 购买）22-456-885
棉签McKesson508716
金刚石车针 #3、#2、#1 和 #0.5 mmAnspachQD8-3SD；QD8-2SD；QD8-1SD；QD8-05SD
尿布垫McKesson945330
一次性15号刀片Swann-Morton0305
恩诺沙星Hospira0409-4888-01
epinephrineMcKesson63739-0456
眼膏德克拉兽用产品17033-211-38
自由升降器格蕾丝医疗215100FX
明胶海绵辉瑞（由麦克森公司订购）82830
理发剪Oster Power Pro 无线款（从亚马逊订购）078400-020-000
碘伏擦洗普渡制药（从McKesson公司订购）521243
虹膜剪奥林巴斯CL-542114
氯胺酮Henry Schein 动物健康55853
乳酸林格氏液B. Braun Medical（通过McKesson订购）186662
罗斯恩 lancet 刀格蕾丝医疗151100FX文中称为刮匙
润滑剂Milex（购自Cooper Surgical）MX5030
美纹纸胶带3M（从 Fisher Sci 订购）19047259
金属矩形盆亚马逊B07NQDBC6T
持针器奥林巴斯CR 213015-ENT
针头：27号，18号BD Precision（从 Fischer Sci 订购）14-826-48 14-826-5D
新生儿保暖隔离器空中生命支持系统731-1800
手术显微镜卡尔·蔡司OPMI pico
氧气瓶AirGasOX USP200
脉搏血氧饱和度CapnoTrue（由 Medacx 提供）M-3090112001
带加热毯的直肠探头Harvard Apparatus探针：PY2 50-7217 加热毯：PY2 50-7214
红色机身Lichtenhan 实验室N/A内部产品
直角奥林巴斯BV-230337
罗斯针OlympusAM-130566定制的，这是我用来撕开囊膜的器械
用于 O 的橡胶管2 给药Fisher Sci14-171-104
保鲜膜Fisher SciNC9617977
立体定向头架WUSTL 仪器机械加工车间N/A内部产品
无菌铺巾Cardinal Health7553
巴龙吸管格蕾丝医疗034903FX 034905FX#3 和 #5 吸引
阿德森-布朗组织镊格蕾丝医疗325112FX
韦特兰德拉钩奥林巴斯格蕾丝医疗BL200011 100313FX
赛拉嗪阿科尔恩59399-110-20

参考文献

  1. Kimura, R. S., Schuknecht, H. F. Membranous Hydrops in the Inner Ear of the Guinea Pig after Obliteration of the Endolymphatic Sac. Pract oto-rhino-laryng. 27, 343-354 (1965).
  2. Salt, A. N., DeMott, J. Time course of endolymph volume increase in experimental hydrops measured in vivo with an ionic volume marker. Hearing Research. 74 (1-2), 165-172 (1994).
  3. Walsted, A., Garbarsch, C., Michaels, L. Effect of craniotomy and cerebrospinal fluid loss on the inner ear. An experimental study. Acta Oto-Laryngologica. 114 (6), 626-631 (1994).
  4. Andrews, J. C., Bohmer, A. The surgical approach to the endolymphatic sac and the cochlear aqueduct in the guinea pig. American Journal of Otolaryngology. 10 (1), 61-66 (1989).
  5. Lee, J. R., Wright, C. G., Meyerhoff, W. L. Modified occipital approach to the endolymphatic sac and cochlear aqueduct of the guinea pig. American Journal of Otolaryngology. 14 (2), 165-169 (1993).
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  7. Lichtenhan, J. T., Cooper, N. P., Guinan, J. J. Jr A new auditory threshold estimation technique for low frequencies: proof of concept. Ear and Hearing. 34 (1), 42-51 (2013).
  8. Lichtenhan, J. T., Hartsock, J., Dornhoffer, J. R., Donovan, K. M., Salt, A. N. Drug delivery into the cochlear apex: Improved control to sequentially affect finely spaced regions along the entire length of the cochlear spiral. Journal of Neuroscience Methods. 273, 201-209 (2016).
  9. Lichtenhan, J. T., Hartsock, J. J., Gill, R. M., Guinan, J. J. Jr, Salt, A. N. The auditory nerve overlapped waveform (ANOW) originates in the cochlear apex. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (3), 395-411 (2014).
  10. Lichtenhan, J. T., Hirose, K., Buchman, C. A., Duncan, R. K., Salt, A. N. Direct administration of 2-Hydroxypropyl-Beta-Cyclodextrin into guinea pig cochleae: Effects on physiological and histological measurements. PloS One. 12 (4), e0175236(2017).
  11. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).

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