我们描述了一种用于在免疫功能健全的小鼠中建立慢性伤口感染的延迟接种方案。
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本文内容
摘要
摘要
铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）是一种日益影响人类健康与疾病的重要医院获得性病原体，尤其在糖尿病患者和住院患者的慢性伤口感染中具有重要意义。目前迫切需要建立慢性感染模型，以促进对伤口致病机制的研究，并推动针对该病原体的新疗法开发。本文介绍了一种在全层皮肤切除造伤后24小时延迟接种的实验方案。在此时间点，伤口中存在的临时基质可使感染既不被迅速清除，也不发生播散，从而建立持续7–10天的慢性感染，且无需植入异物或进行免疫抑制。该方案模拟了人类术后感染的典型时间进程。使用发光型P. aeruginosa菌株（PAO1:lux）可实现对P. aeruginosa伤口感染中细菌负荷量的每日定量评估。这一新型模型可能成为研究细菌致病机制以及开发慢性P. aeruginosa伤口感染新疗法的有力工具。
引言
铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa是一种革兰氏阴性杆菌，在人类健康与疾病中的重要性日益凸显。该菌可导致医院内环境中严重的发病率和死亡率，尤其易引起免疫功能低下患者的伤口感染。1,2该病原体多重耐药菌株的出现为进一步研究其耐药性相关因素提供了新的推动力 P. aeruginosa 毒力，作用机制 P. aeruginosa 抗生素耐药性，以及预防和治疗这种致命感染的新方法3因此，作为研究这些科学问题的工具，对慢性伤口感染动物模型的需求比以往任何时候都更为迫切。
遗憾的是，许多铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染的动物模型往往模拟的是急性感染，其特点是感染迅速消退或因败血症而快速恶化4,5，无法充分模拟此类感染常具有的慢性特征。为克服这一局限，一些模型采用植入异物的方法，例如琼脂珠、硅胶植入物或海藻酸盐凝胶6,7,8
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方案
本文所述所有方法均已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 细菌的制备与培养
- 根据研究人员所在机构的生物安全委员会和动物使用委员会指南，对 P. aeruginosa 和动物实验采取 BSL-2 级防护措施。所有涉及 P. aeruginosa 的操作步骤（包括小鼠接种）均须在生物安全柜中进行。
- 发光型 PAO1:lux 菌株的 P. aeruginosa 可通过申请从本实验室获取。将保存于甘油冻存液中的 PAO1 菌株划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂（LB 琼脂）平板。对于发光型 PAO1:lux 菌株，LB 琼脂中应添加选择性抗生素（100 µg/mL 羧苄西林和 12.5 µg/mL 卡那霉素）。在 37 °C 细菌培养箱中过夜培养。
- 挑取单个孤立菌落，接种于 3 ml LB 液体培养基（pH 7.4）中，在 37 °C 下振荡培养过夜。对于发光菌株，液体培养基中应添加 100 µg/mL 羧苄西林，并在振荡、有氧条件下培养。
2. 实验步骤准备
- 所有进行手术的人员均需穿戴洁净的手术服/实验服、口罩、头套和手套。
- 对所有手术器械（包括剪刀和镊子）进行高压灭菌。在不同动物间操作时，采用无菌技术对器械进行消毒。 ....
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结果
使用携带编码luxABCDE报告系统的质粒的PAO1发光菌株（PAO1:lux），我们对小鼠进行切除性伤口处理，24小时后用浮游态的P. aeruginosa接种伤口，并随时间测量细菌负荷量（图1 和 图2）。利用成像光学系统获得的一幅代表性图像表明，该模型可产生可检测的发光信号（图3A）。根据生物发光和菌落计数结果，感染在接种后第3天达到高峰，并持续至接种后第7天（图3B–C）。利用该模型，我们能够稳定地建立持续7–10天的伤口，具体持续时间取决于细菌菌株和小鼠背景。对从伤口分离的细菌进行培养显示，定量的CFU/伤口数值与检测到的发光信号呈相关性（图3D）。.......
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讨论
我们建立了一种新型的延迟接种P. aeruginosa伤口感染模型。该方法在皮肤切除造成伤口后24小时再接种细菌，从而能够在为期一周的时间范围内评估伤口感染情况。通过使用发光型的P. aeruginosa菌株，可在整个感染过程中动态追踪感染进展。相较于其他P. aeruginosa感染模型，该模型具有更长的感染周期，将为研究宿主与病原体之间的相互作用以及针对P. aeruginosa伤口感染的新型治疗策略提供新的机会。例如，我们已利用该模型证实了Pf噬菌体在激发抗病毒免疫反应中的作用，从而帮助P. aeruginosa逃逸宿主免疫系统的清除14。
在切除性伤口手术与细菌接种之间设置24小时的恢复时间，是该伤口感染模型中的关键步骤。这使得动物在感染前能够从伤口手术中恢复，可能有助于其至少存活7天。此外，这一间隔支持在接种前形成临时性伤口基质，结合透明薄膜敷料，为生物膜的形成提供了有利环境。在本模型的建立过程中，我们进行了一系列探索性实验，考察了不同.......
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披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 发光质粒载体由 J. Hardy 惠赠。示意图使用 BioRender.com 制作。感谢 G. Gurtner 实验室在伤口感染模型方面提供的建议。同时感谢斯坦福大学创新中心的 T. Doyle 在体 内 感谢其技术专长提供的成像支持。本研究获得了以下资助：R21AI133370、R21AI133240、R01AI12492093，以及来自斯坦福SPARK、Falk医学研究信托基金和囊性纤维化基金会（CFF）对P.L.B.的资助。C.R.D. 受T32AI007502项目支持。J.M.S. 获得了斯坦福盖比兰科学与工程研究生奖学金以及Lubert Stryer Bio-X斯坦福跨学科研究生奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 氯化钠注射液 | Hospira | 2484457 | |
| 18 G x 1 无菌针头 | BD | 305195 | |
| 25 G x 1 1/5 无菌针头 | BD | 305127 | |
| 酒精棉片 | BD | 326895 | |
| Aura 成像软件 | Spectral Instruments Imaging | n/a | |
| 聚维酮碘（Betadine） | Purdue Frederick Company | 19-065534 | |
| Buprenorphine SR LAB | Zoopharm | n/a | |
| C57BL/6J 雄性小鼠 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| 一次性活检打孔器，6 mm | Integra | 33-36 | |
| 精细剪刀 - 碳化钨 | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| 玻璃珠干热灭菌器 | Harvard Apparatus | 61-0183 | |
| 颗粒状琼脂 | Fisher BioReagents | BP9744 | |
| 加热垫 | Milliard | 804879481218 | |
| 带 28 G 针头的胰岛素注射器 | BD | 329461 | |
| Lago X 成像系统 | Spectral Instruments Imaging | n/a | |
| LB 肉汤培养基 | Fisher BioReagents | BP1426 | |
| 鲁尔锁 1 mL 注射器 | BD | 309628 | |
| Mini Arco 动物毛发修剪器 | Wahl Professional | 919152 | |
| 含婴儿油的 Nair 脱毛乳液 | Church and Dwight | n/a | 可在任意药房购买 |
| 八角镊 | Fine Science Tools | 11041-08 | |
| 培养皿 | Falcon | 351029 | |
| 1x 磷酸盐缓冲液（PBS） | Corning | 21-040-CV | |
| Press and Seal 保鲜膜 | Glad | n/a | |
| 带 30 G 针头的安全型胰岛素注射器 | BD | 305934 | |
| 安全型胰岛素注射器，1/2 mL，30 G x 5/16 TW | BD | 305934 | |
| 电子天平 | Ohaus Scout Pro | SP202 | |
| Supplical 营养补充剂 | Henry Schein Animal Health | 29908 | |
| Tegaderm 敷料，6 cm x 7 cm | 3M | 1624W |
参考文献
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Serra, R., et al. Chronic....
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重印与许可
