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方法文章

一种慢性延迟接种模型 铜绿假单胞菌 伤口感染

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DOI：

10.3791/60599

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2020年2月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Infectious Diseases, School of Medicine, Stanford University, 2Stanford Immunology, Stanford University, 3Palo Alto Veterans Institute of Research

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了一种用于在免疫功能健全的小鼠中建立慢性伤口感染的延迟接种方案。

摘要

铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）是一种日益影响人类健康与疾病的重要医院获得性病原体，尤其在糖尿病患者和住院患者的慢性伤口感染中具有重要意义。目前迫切需要建立慢性感染模型，以促进对伤口致病机制的研究，并推动针对该病原体的新疗法开发。本文介绍了一种在全层皮肤切除造伤后24小时延迟接种的实验方案。在此时间点，伤口中存在的临时基质可使感染既不被迅速清除，也不发生播散，从而建立持续7–10天的慢性感染，且无需植入异物或进行免疫抑制。该方案模拟了人类术后感染的典型时间进程。使用发光型P. aeruginosa菌株（PAO1:lux）可实现对P. aeruginosa伤口感染中细菌负荷量的每日定量评估。这一新型模型可能成为研究细菌致病机制以及开发慢性P. aeruginosa伤口感染新疗法的有力工具。

引言

铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa是一种革兰氏阴性杆菌，在人类健康与疾病中的重要性日益凸显。该菌可导致医院内环境中严重的发病率和死亡率，尤其易引起免疫功能低下患者的伤口感染。1,2该病原体多重耐药菌株的出现为进一步研究其耐药性相关因素提供了新的推动力 P. aeruginosa 毒力，作用机制 P. aeruginosa 抗生素耐药性，以及预防和治疗这种致命感染的新方法3因此，作为研究这些科学问题的工具，对慢性伤口感染动物模型的需求比以往任何时候都更为迫切。

遗憾的是，许多铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染的动物模型往往模拟的是急性感染，其特点是感染迅速消退或因败血症而快速恶化4,5，无法充分模拟此类感染常具有的慢性特征。为克服这一局限，一些模型采用植入异物的方法，例如琼脂珠、硅胶植入物或海藻酸盐凝胶6,7,8。另一些模型则使用因高龄、肥胖或糖尿病导致免疫功能受损的小鼠，或通过药物手段（如环磷酰胺诱导的中性粒细胞减少症）造成免疫抑制9,10,11,12。然而，使用异物材料或免疫功能受损的宿主很可能会改变局部的炎症过程，从而难以理解在免疫系统基本正常的宿主中慢性伤口感染所涉及的病理生理机制。

我们已建立了一种慢性模型 P. aeruginosa 小鼠伤口感染模型，涉及在创伤性伤口形成后延迟接种细菌。延迟接种使得能够进行评估细菌负荷的实验，观察时间可延长至至少7天。该模型为研究感染的发病机制及开发新的治疗方法提供了新的机会 P. aeruginosa 慢性感染

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方案

本文所述所有方法均已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 细菌的制备与培养

  1. 根据研究人员所在机构的生物安全委员会和动物使用委员会指南，对 P. aeruginosa 和动物实验采取 BSL-2 级防护措施。所有涉及 P. aeruginosa 的操作步骤（包括小鼠接种）均须在生物安全柜中进行。
  2. 发光型 PAO1:lux 菌株的 P. aeruginosa 可通过申请从本实验室获取。将保存于甘油冻存液中的 PAO1 菌株划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂（LB 琼脂）平板。对于发光型 PAO1:lux 菌株，LB 琼脂中应添加选择性抗生素（100 µg/mL 羧苄西林和 12.5 µg/mL 卡那霉素）。在 37 °C 细菌培养箱中过夜培养。
  3. 挑取单个孤立菌落，接种于 3 ml LB 液体培养基（pH 7.4）中，在 37 °C 下振荡培养过夜。对于发光菌株，液体培养基中应添加 100 µg/mL 羧苄西林，并在振荡、有氧条件下培养。

2. 实验步骤准备

  1. 所有进行手术的人员均需穿戴洁净的手术服/实验服、口罩、头套和手套。
  2. 对所有手术器械（包括剪刀和镊子）进行高压灭菌。在不同动物间操作时，采用无菌技术对器械进行消毒。
  3. 用乙醇清洁手术台，并准备干净的手术区域。

3. 脱毛

  1. 使用1%–3%异氟烷麻醉8–12周龄的C57BL/6J小鼠。研究人员应遵循所在机构兽医人员关于异氟烷使用的麻醉指南。
    1. 以1%–3%异氟烷开始麻醉，调节氧气流速至1.5 L/min。将小鼠放入诱导室中。
    2. 轻捏小鼠脚趾以评估麻醉深度。当小鼠对刺激不再有反应时，将其从诱导室中取出，并将其置于手术台上，鼻部放入异氟烷鼻罩中。
    3. 在两只眼睛上涂抹眼用润滑剂。
  2. 称量小鼠体重，记录术前基础体重。
  3. 将小鼠置于俯卧位。在两侧 flank 处皮下注射预热的无菌0.9%氯化钠溶液，每侧250 µL，共500 µL。
  4. 使用电动剃毛器剃除小鼠背部毛发。剃毛操作应在与手术区域不同的位置进行，以防止毛发污染伤口。
  5. 涂抹一层薄薄的脱毛膏，静置20–60秒。用温水浸湿的纱布擦去毛发和多余脱毛膏。脱毛完成后，立即进行切除性伤口操作。

4. 全层切除性伤口手术

  1. 使用25 G针头在小鼠背部中线区域皮下注射缓释布托啡诺，剂量为0.6–1 mg/kg。缓释布托啡诺可在48–72小时内提供镇痛作用。
  2. 消毒手术部位。用无菌碘伏棉签擦拭背部表面，再用无菌酒精棉签擦去多余碘伏。此步骤应重复3次（交替使用碘伏和酒精），以伤口中心为起点向外周作环形擦拭。让手术区域自然晾干。
  3. 使用无菌纱布或塑料保鲜膜在手术部位周围创建无菌铺巾。
  4. 向尾侧方向拉紧皮肤。使用无菌直径6 mm的皮肤活检打孔器，在左侧背部表皮制造初始切口。在右侧背部表皮重复相同操作。
  5. 用镊子将左侧标记伤口区域中央的皮肤提起形成 tents 状。使用剪刀切除表皮层和真皮层。在右侧标记伤口区域重复该操作，以制造对称的切除性伤口。
  6. 用50 µL无菌生理盐水冲洗伤口。让手术部位及周围皮肤自然晾干，然后用透明薄膜敷料覆盖伤口及背部。
  7. 将小鼠放回清洁的笼盒中，每笼单独饲养一只动物。
  8. 将笼盒置于加热垫上，并持续监测直至小鼠苏醒。
  9. 当对多只动物进行上述手术时，应在每只动物之间使用高温珠灭菌器对所有手术器械进行消毒。
  10. 给予小鼠24小时恢复时间，以完成术后恢复并在伤口表面形成临时性伤口基质，之后再进行细菌接种操作。

5. 接种铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）

  1. 将过夜培养的PAO1:lux菌液用LB培养基稀释至OD600 = 0.05（含100 µg/mL羧苄青霉素），继续培养细菌至对数生长期初期（OD600 ≈ 0.3），大约需要2–3小时。
  2. 将PAO1:lux菌液用PBS缓冲液稀释至浓度为(7.5 ± 2.5) × 102 CFU/mL。务必准备过量的接种液，以确保有足够的体积，并为实验后涂布平板留出足够样本。若需在不同设施之间转运（例如从实验室到动物房），应使用防漏盒进行双重封装，并明确标记“生物危害”标识。
  3. 所有涉及P. aeruginosa和小鼠的操作均须在经批准的动物生物安全二级（ABSL-2）生物安全柜（BSC）中进行，并佩戴经批准的个人防护装备。可重复使用的设备（如电子天平）应使用保鲜膜覆盖，以防污染。
  4. 按照前述方法使用3%异氟烷进行麻醉。称量小鼠体重并记录。在每侧腹股沟皮下注射预热的无菌0.9%氯化钠溶液250 µL，总量为500 µL。
  5. 若小鼠的透明薄膜敷料在过夜后脱落，应小心去除形成的结痂，并更换新的敷料。
  6. 使用500 µL带安全帽的27 G结核菌素注射器，将40 µL PAO1:lux菌悬液透过透明薄膜敷料注入每个伤口。为避免对侧交叉污染，非接种/PBS对照组伤口应使用不同的小鼠。
  7. 将小鼠放回笼中，并置于加热垫上，持续观察直至其苏醒。所有小鼠应单独饲养于独立笼具中，以防止交叉污染。
  8. 在笼底将高热量营养补充膏夹在饲料颗粒之间提供给小鼠。
  9. 利用剩余的接种液涂布LB琼脂平板，通过菌落计数确认实际给予的细菌数量。

6. 体内 感染伤口的成像

  1. 在将小鼠运送至成像仪器及从成像仪器运回时，遵循BSL-2防护规程，包括使用次级容器。在将小鼠转移至诱导室或成像仪器过程中，注意避免转移或洒落任何动物垫料。
  2. 在诱导室中使用吸入式1%–3%异氟烷对小鼠进行麻醉，操作方法如步骤3.1所述。
  3. 小鼠麻醉成功后，将其俯卧位放置于光学成像系统的成像室中，并将鼻部置于异氟烷鼻罩内。
  4. 打开软件程序。
  5. 采集参数将根据同时成像的小鼠数量及生物发光强度而变化。需设置的基本参数包括曝光时间、binning、光圈值（f/stop）和视野（FOV）。我们默认的初始设置为：曝光时间30秒，binning低（2），光圈值1.2，视野25。根据研究人员的具体需求，可相应调整这些参数。
  6. 使用成像软件分析发光数据（参见材料表）。发光信号将以伪彩图像形式叠加在小鼠的彩色照片上显示。
    1. 在伤口部位创建感兴趣区域（ROI），并测量检测到的平均通量（光子/秒）。请注意，数据也可表示为辐亮度（光子/秒/cm²/球面度），但只要成像平台与相机之间的距离在各次成像中保持恒定，使用通量即可满足分析需求。
    2. 在成像平台上选择一个随机区域创建ROI，以测量背景值，并从检测信号中减去该区域的光子数/秒。
    3. 将数据导出至电子表格，以便进一步分析。
  7. 按照上述方法，可每日进行成像，以追踪感染进展。

7. 术后管理

  1. 根据研究人员的IACUC方案所制定的指南对小鼠进行监测。我们于术后前4天每天监测所有小鼠，之后每隔一天监测一次，直至实验结束。术后前4天每天在生物安全柜（BSC）内称量小鼠体重。在感染后第1天和第2天，每只小鼠皮下注射250 µL的0.9%氯化钠溶液。
  2. 观察小鼠是否出现疼痛或痛苦的迹象，包括弓背姿势、毛发杂乱、嗜睡、呼吸困难、面部痛苦表情以及体重下降。
  3. 若动物出现健康状况恶化的迹象，应咨询兽医。任何表现出疼痛或痛苦症状加重且体重下降达到或超过20%的小鼠，均应实施安乐死。

8. 伤口切除

  1. 实验结束时，采用 CO2 吸入法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。按照机构的 ABSL-2 协议处理动物尸体。
  2. 在生物安全柜中使用无菌剪刀和镊子切除伤口床。将每个伤口床置于含有 1 mL 无菌 PBS 的 1.5 mL 聚丙烯管中。用剪刀将伤口组织剪碎。所有伤口均应按 ASBL-2 级别处理，即使未被认定为感染。
  3. 在 4 °C 条件下，以 300 rpm 振荡孵育 2 小时。每管涡旋振荡 10 秒，并用 PBS 对细菌流出液进行连续稀释。将稀释后的细菌流出液接种至 LB 琼脂平板，以定量细菌负荷。
  4. 若伤口处的发光信号高于背景发光水平，且伤口流出液中检测到的细菌数量多于以 PBS 接种的对照组伤口，则判定为感染伤口。

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结果

使用携带编码luxABCDE报告系统的质粒的PAO1发光菌株（PAO1:lux），我们对小鼠进行切除性伤口处理，24小时后用浮游态的P. aeruginosa接种伤口，并随时间测量细菌负荷量（图1 和 图2）。利用成像光学系统获得的一幅代表性图像表明，该模型可产生可检测的发光信号（图3A）。根据生物发光和菌落计数结果，感染在接种后第3天达到高峰，并持续至接种后第7天（图3B–C）。利用该模型，我们能够稳定地建立持续7–10天的伤口，具体持续时间取决于细菌菌株和小鼠背景。对从伤口分离的细菌进行培养显示，定量的CFU/伤口数值与检测到的发光信号呈相关性（图3D）。...

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讨论

我们建立了一种新型的延迟接种P. aeruginosa伤口感染模型。该方法在皮肤切除造成伤口后24小时再接种细菌，从而能够在为期一周的时间范围内评估伤口感染情况。通过使用发光型的P. aeruginosa菌株，可在整个感染过程中动态追踪感染进展。相较于其他P. aeruginosa感染模型，该模型具有更长的感染周期，将为研究宿主与病原体之间的相互作用以及针对P. aeruginosa伤口感染的新型治疗策略提供新的机会。例如，我们已利用该模型证实了Pf噬菌体在激发抗病毒免疫反应中的作用，从而帮助P. aeruginosa逃逸宿主免疫系统的清除14。

在切除性伤口手术与细菌接种之间设置24小时的恢复时间，是该伤口感染模型中的关键步骤。这使得动物在感染前能够从伤口手术中恢复，可能有助于其至少存活7天。此外，这一间隔支持在接种前形成临时性伤口基质，结合透明薄膜敷料，为生物膜的形成提供了有利环境。在本模型的建立过程中，我们进行了一系列探索性实验，考察了不同...

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披露

作者声明无竞争性财务利益。

致谢

pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 发光质粒载体由 J. Hardy 惠赠。示意图使用 BioRender.com 制作。感谢 G. Gurtner 实验室在伤口感染模型方面提供的建议。同时感谢斯坦福大学创新中心的 T. Doyle 在体 内 感谢其技术专长提供的成像支持。本研究获得了以下资助：R21AI133370、R21AI133240、R01AI12492093，以及来自斯坦福SPARK、Falk医学研究信托基金和囊性纤维化基金会（CFF）对P.L.B.的资助。C.R.D. 受T32AI007502项目支持。J.M.S. 获得了斯坦福盖比兰科学与工程研究生奖学金以及Lubert Stryer Bio-X斯坦福跨学科研究生奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠注射液Hospira2484457
18 G x 1 无菌针头BD305195
25 G x 1 1/5 无菌针头BD305127
酒精棉片BD326895
Aura 成像软件Spectral Instruments Imagingn/a
聚维酮碘（Betadine）Purdue Frederick Company19-065534
Buprenorphine SR LABZoopharmn/a
C57BL/6J 雄性小鼠The Jackson Laboratory000664
一次性活检打孔器，6 mmIntegra33-36
精细剪刀 - 碳化钨Fine Science Tools14568-09
玻璃珠干热灭菌器Harvard Apparatus61-0183
颗粒状琼脂Fisher BioReagentsBP9744
加热垫Milliard804879481218
带 28 G 针头的胰岛素注射器BD329461
Lago X 成像系统Spectral Instruments Imagingn/a
LB 肉汤培养基Fisher BioReagentsBP1426
鲁尔锁 1 mL 注射器BD309628
Mini Arco 动物毛发修剪器Wahl Professional919152
含婴儿油的 Nair 脱毛乳液Church and Dwightn/a可在任意药房购买
八角镊Fine Science Tools11041-08
培养皿Falcon351029
1x 磷酸盐缓冲液（PBS）Corning21-040-CV
Press and Seal 保鲜膜Gladn/a
带 30 G 针头的安全型胰岛素注射器BD305934
安全型胰岛素注射器，1/2 mL，30 G x 5/16 TWBD305934
电子天平Ohaus Scout ProSP202
Supplical 营养补充剂Henry Schein Animal Health29908
Tegaderm 敷料，6 cm x 7 cm3M1624W

参考文献

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
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  3. Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).
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  5. Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).
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  13. Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. , (2019).
  14. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363 (6434), (2019).

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