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方法文章

小鼠初级视觉皮层中单眼视觉剥夺与眼优势可塑性的测量

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DOI：

10.3791/60600

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2020年2月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Clinical Hospital of Chengdu Brain Science Institute, MOE Key Lab for NeuroInformation, University of Electronic Science and Technology of China, 2Sichuan Institute for Brain Science and Brain-inspired Intelligence, 3Department of Electronic Engineering, City University of Hong Kong, 4Centre for Biosystems, Neuroscience, and Nanotechnology, City University of Hong Kong

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了单眼视觉剥夺和眼优势可塑性分析的详细实验方案，这些方法对于研究关键期视觉可塑性的神经机制以及特定基因对视觉发育的影响具有重要意义。

摘要

单眼视觉剥夺是一种诱导初级视皮层反应可塑性的理想实验范式。通常情况下，在小鼠初级视皮层（V1）的双眼区，皮层对对侧眼刺激的反应远强于同侧眼的反应。在哺乳动物关键期期间，缝合对侧眼会导致V1神经元对对侧眼刺激的反应性迅速下降。随着转基因技术的不断发展，越来越多的研究采用转基因小鼠作为实验模型，以探究特定基因对眼优势（OD）可塑性的影响。本研究中，我们介绍了单眼视觉剥夺的详细实验方案，并计算小鼠V1区眼优势可塑性的变化。在关键期内进行为期4天的单眼剥夺（MD）后，测量每个神经元的方向调谐曲线，并比较V1层4神经元在同侧眼与对侧眼刺激下的调谐曲线差异。可通过每个细胞的眼优势（OD）评分计算对侧眼偏倚指数（CBI），以反映眼优势可塑性的程度。该实验技术对于研究关键期内眼优势可塑性的神经机制以及特定基因在神经发育中的作用具有重要意义。其主要局限性在于，急性实验无法追踪同一只小鼠在不同时间点的神经可塑性变化。

引言

单眼视觉剥夺是研究初级视皮层（V1）可塑性的理想实验范式。为了探究视觉经验在神经发育中的重要性，David Hubel 和 Torsten Wiesel1,2 在不同时间点并对不同持续时间段内，剥夺幼猫单眼的正常视觉。随后，他们观察了初级视皮层（V1）对被剥夺眼和非剥夺眼的反应强度变化。研究结果表明，在出生后前三个月内缝合眼睑的幼猫，其反应该眼的神经元数量显著异常降低。然而，这些幼猫神经元的反应特性在所有方面均与成年正常猫眼睑缝合一年后的反应相同，且幼猫并未出现功能恢复。在成年猫中，单眼剥夺无法诱导眼优势可塑性。因此，视觉经验对V1神经连接的影响仅存在于一个短暂而明确的发育阶段，在此阶段之前和之后，相同刺激的影响均较弱。这种对视觉输入敏感性增强的阶段被称为视觉皮层的关键期。

尽管小鼠是夜行性动物，但其初级视皮层（V1）中的单个神经元具有与猫的神经元相似的特性3,4,5。近年来，随着转基因技术的快速发展，越来越多的视觉神经科学研究采用小鼠作为实验模型6,7,8。在小鼠视觉研究中，神经科学家使用突变体和基因敲除小鼠品系，从而能够控制小鼠的遗传组成。尽管小鼠V1缺乏眼优势柱，V1双眼区的单个神经元仍表现出显著的眼优势特性。例如，大多数细胞对对侧眼刺激的反应强于同侧眼刺激。在关键期内暂时闭合一只眼睛，可引起眼优势指数分布的显著偏移9,10,11。因此，单眼剥夺（MD）可用于建立眼优势可塑性模型，以研究参与神经发育障碍的基因如何在体内影响皮层可塑性。

本文介绍了一种用于研究弱视（MD）的实验方法，并推荐一种常用的方法（电生理记录）来分析单眼视觉剥夺期间眼优势可塑性的变化。该方法已在众多实验室中广泛应用了20多年12,13,14,15,16。此外，还有其他一些用于测量眼优势可塑性的方法，例如慢性视觉诱发电位（VEP）记录17和内在光学成像（IOI）18。这种急性实验方法的显著优势在于操作简便，且结果具有高度的可靠性。

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方案

在本实验方案中，雄性C57Bl/6小鼠购自四川省医学科学院暨四川省人民医院实验动物研究所。所有动物护理和实验程序均经中国电子科技大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 小鼠出生后第28天的单眼剥夺（MD）

  1. 将手术器械、缝合针（直径 0.25 mm，线径 0.07 mm）和棉签放入铝盒中，在 120 °C 下高压灭菌 0.5 小时。用 75% 乙醇对超净台进行消毒。将手术器械置于干燥箱中烘干。
  2. 配制 2% 琼脂糖溶液，并置于 75 °C 水浴中以防止凝固。
  3. 使用异氟烷与氧气混合气体对小鼠进行麻醉（诱导浓度 2%，维持浓度 1.2–1.5%）。将小鼠固定于立体定位仪上，并使用温控装置维持小鼠体温在 37 °C，防止低体温。
  4. 在双眼上涂抹一层薄薄的石油基眼膏。
  5. 在带照明的解剖显微镜下，缝合单侧眼睑。使针穿过眼睑两侧各两次（图 1A），共缝约四针。
  6. 打结 2–3 次后剪断线头。在结上滴加 3 μL 快干胶以增强其稳定性，然后剪除多余的缝合线。
  7. 对小鼠进行腹腔注射布托啡诺（1 mg/kg）。
  8. 将小鼠转移至加热垫上，维持其体温在 37 °C，防止低体温，并持续监测直至其恢复意识。
  9. 当小鼠完全清醒后，将其放入单独的饲养笼中。
  10. 每日检查眼睑，确保其保持闭合且无感染迹象。若发现眼睑张开，则剔除该小鼠。
  11. 在进行电生理记录前，使用异氟烷与氧气混合气体对小鼠进行麻醉（诱导浓度 2%，维持浓度 1.2–1.5%）。
  12. 用眼科剪拆除缝线以暴露眼球。小心修剪眼睑组织。
  13. 用镜片溶液冲洗眼球，并在显微镜下检查眼球透明度。剔除角膜混浊或有感染迹象的小鼠。

2. 小鼠单眼剥夺第4天后在V1双眼区域进行开颅手术

  1. 麻醉小鼠后，通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉深度。
  2. 将小鼠固定在立体定位仪上，调节耳杆和门齿杆的高度，使脑部保持平坦且稳定。
  3. 使用加热垫维持小鼠体温。
  4. 在眼睛表面涂抹石油基眼膏，以保持眼球湿润。
  5. 去除小鼠头部的毛发以暴露皮肤，并交替使用碘酒和70%乙醇对皮肤进行三次擦拭消毒。
  6. 在两耳之间切开一个8 × 8 mm的皮肤区域，暴露颅骨并去除头皮组织，随后用30%过氧化氢清除表面结缔组织。
  7. 在小脑上方的颅骨上钻一个1 × 1 mm的孔，并在孔中固定一个小骨螺钉作为参考电极位置。
  8. 在对侧半球V1双眼视觉区（图1B，A-P：lambdа -0.51–lambdа +1.67 mm；M-L：-2.6– -3.0 mm；D-V：0–1 mm）进行直径约1 mm的小型开颅手术，小心移除颅骨碎片，避免损伤脑组织。
  9. 用40 °C的2%琼脂糖溶液覆盖暴露的皮层表面，体积为75 μL，以防止干燥。
  10. 将钨电极固定在立体定位架上，将其垂直放置于暴露的皮层表面——即V1区的双眼视觉区域，以确保所记录的神经元对双眼刺激均有反应。
  11. 使用棉签清除眼表凝胶，并每隔2小时在眼睛表面涂抹一次硅油。

3. 视觉刺激与电生理记录

  1. 用不透明塑料板遮盖一只眼睛，将液晶显示器置于小鼠眼睛前方23厘米处。
  2. 当小鼠完全麻醉后，将麻醉剂浓度降低至0.5–0.8%。
  3. 使用油压微操纵器缓慢推进微电极，当观察到较高的信噪比且电极已进入第4层时停止推进（图1C，深度约为250–450 μm）。确保放大倍数设置为1,000，滤波器设置为300–100 Hz，采样频率为40 Hz。
  4. 在LED显示器上呈现全视野移动正弦光栅刺激（图1D，12个方向，100%对比度，时间频率2 Hz，空间频率0.04 cycles/度）。
  5. 分别刺激同侧眼和对侧眼，测量细胞反应，每种条件重复呈现3–5次。
  6. 每次穿刺记录5至8个细胞的反应，在每只小鼠中进行4至6次穿刺。
  7. 记录结束后，将异氟烷气流速率调至5%或更高，继续暴露异氟烷1分钟，随后实施颈椎脱位。
    注：在V1双眼区内的不同穿刺点之间至少相距200 μm。

4. 离线 spike 分类与数据分析

  1. 当原始信号超过阈值水平时检测尖峰。以捕获到的尖峰的首个正峰或负峰为基准进行对齐。使用软件从不同细胞中检测尖峰信号。
  2. 设置两个游标：一个用于正向偏转，另一个用于负向偏转。设定尖峰模板（图 2A）。将模板区域设定为不同类别尖峰之间差异最显著的部分。
  3. 使用主成分分析将尖峰信号分离成不同簇。不同实验室可采用不同的聚类方法。
  4. 使用 K-均值算法对边界处的尖峰进行分类。
  5. 将方位与尖峰发放率相关联，并分别绘制同侧眼和对侧眼的方位调谐曲线。
  6. 计算单个神经元的视觉优势指数（OD指数），该指数代表对侧眼与同侧眼反应强度的比值：
    光密度公式，科学图示中包含变量 R_contra、R_ipsi 的方程。
    其中 Rcontra 和 Ripsi 分别表示细胞对对侧眼和同侧眼的最优反应，Rspon 表示细胞的自发活动水平。
  7. 将视觉优势指数（OD）评分划分为 1–7 级，具体如下：−1 至 −0.75 = 1；−0.75 至 −0.45 = 2；−0.45 至 −0.15 = 3；−0.15 至 0.15 = 4；0.15 至 0.45 = 5；0.45 至 0.75 = 6；0.75 至 1 = 7。
  8. 计算对侧优势指数（CBI）：
    用于科学分析的 CBI 方程，展示数据处理方法的公式。
    其中 N 为细胞总数，nx 表示视觉优势评分等于 x 的细胞数量。

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结果

本文所述实验结果实现了在关键期（P19–P32）内对剥夺眼和非剥夺眼小鼠的单眼剥夺（MD）和眼优势（OD）可塑性的成功测量。图1展示了如何在单眼剥夺后第4天，于初级视皮层（V1）双眼区第4层进行单细胞单位记录，以比较同侧眼与对侧眼的反应。图2展示了刺激同侧眼和对侧眼时的峰电位分选及方位调谐特性测量结果。在峰电位分选中，通过聚类峰电位主成分的权重建立峰电位模板。以图2A,B为例，细胞01和细胞02通过峰电位分选被分类。通过刺激同侧眼和对侧眼测量单个神经元单位的方位调谐曲线。图2C,D展示了四个示例细胞的方位调谐曲线，其中两个来自接受单眼剥夺处理的小鼠，另两个来自未接受剥夺处理的小鼠。我们的结果显示，在单眼剥夺后第4天，刺激对侧眼和同侧眼时，小鼠的放电率相对接近（图2

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讨论

本文介绍了一种通过单细胞记录测量单眼剥夺（MD）及眼优势可塑性的详细实验方案。该方案在视觉神经科学研究中被广泛应用。尽管单眼剥夺实验本身并不复杂，但仍有一些关键的手术步骤必须严格遵循。首先，有两个重要细节可确保缝合质量：缝合线应集中在眼睑的内侧部分，以保证缝合的稳定性；此外，需在结头处涂抹约 3 μL 胶水，以增强结的稳定性，防止眼睛重新睁开。其次，应采取若干关键步骤以促进伤口愈合并减轻动物不适。缝合方法在本实验中至关重要。既往研究已证实，简单的连续缝合模式具有促进伤口愈合和缩短缝合时间的优点19,20。缝合线应细且稳定，以避免造成较大创伤并减轻不适感。建议使用直径约为 0.25 mm 的缝合针，且需打两到三个结以确保牢固。

在记录过程中还有一些关键点需要注意。麻醉剂浓度的控制是电生理记录中的一个重要因素。在麻醉动物中进行实验非常易于控制，结果具有高度的稳定性和可靠性。以往许多研究使用乌拉坦（urethane）作为麻醉剂。然而，在小鼠中使用乌拉坦难以精确控制麻醉深度...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由国家自然科学基金（81571770，81771925，81861128001）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
502 胶水M&G Chenguang Stationery Co., Ltd.AWG97028
数据采集卡National InstumentPCI-6250
琼脂糖BiowestG-10
放大器A-M systemModel 1800
阿托品阿拉丁生化科技股份有限公司A135946-5
脑立体定位仪瑞沃德生命科技有限公司68001
科汉-范纳斯弹簧剪Fine Science Tools15000-02
隐形眼镜护理液北京博士伦眼睛护理产品有限公司GM17064
棉签河南广德润医疗器械有限公司
精细持针器苏州施强医疗器械有限公司CZQ1370
镊子66 视觉科技有限公司53320A
镊子66 视觉科技有限公司53072
镊子66 视觉科技有限公司#5
加热垫StrykerTP 700 T
照明光源麦克奥迪（中国）有限公司MLC-150C
异氟烷瑞沃德生命科技有限公司R510-22
LCD 显示器飞利浦（中国）投资有限公司39PHF3251/T3
显微镜舜宇光学科技（集团）有限公司SZMT1
无创生命体征监测仪Mouseox
油压微操作器NARISHIGE International Ltd.PC-5N06022
凡士林眼用凝胶德州亿乐消毒科技有限公司17C801
Spike2Cambridge Electronic Design, Cambridge, UKSpike2 Version 9
手术剪66 视觉科技有限公司54010
手术剪66 视觉科技有限公司54002
缝合针宁波医用缝针有限公司3/8 弧 2.5*8
钨电极FHC, IncL504-01B
利多卡因华清

参考文献

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