本文介绍了单眼视觉剥夺和眼优势可塑性分析的详细实验方案，这些方法对于研究关键期视觉可塑性的神经机制以及特定基因对视觉发育的影响具有重要意义。
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方法文章
小鼠初级视觉皮层中单眼视觉剥夺与眼优势可塑性的测量
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
单眼视觉剥夺是一种诱导初级视皮层反应可塑性的理想实验范式。通常情况下，在小鼠初级视皮层（V1）的双眼区，皮层对对侧眼刺激的反应远强于同侧眼的反应。在哺乳动物关键期期间，缝合对侧眼会导致V1神经元对对侧眼刺激的反应性迅速下降。随着转基因技术的不断发展，越来越多的研究采用转基因小鼠作为实验模型，以探究特定基因对眼优势（OD）可塑性的影响。本研究中，我们介绍了单眼视觉剥夺的详细实验方案，并计算小鼠V1区眼优势可塑性的变化。在关键期内进行为期4天的单眼剥夺（MD）后，测量每个神经元的方向调谐曲线，并比较V1层4神经元在同侧眼与对侧眼刺激下的调谐曲线差异。可通过每个细胞的眼优势（OD）评分计算对侧眼偏倚指数（CBI），以反映眼优势可塑性的程度。该实验技术对于研究关键期内眼优势可塑性的神经机制以及特定基因在神经发育中的作用具有重要意义。其主要局限性在于，急性实验无法追踪同一只小鼠在不同时间点的神经可塑性变化。
引言
单眼视觉剥夺是研究初级视皮层（V1）可塑性的理想实验范式。为了探究视觉经验在神经发育中的重要性，David Hubel 和 Torsten Wiesel1,2 在不同时间点并对不同持续时间段内，剥夺幼猫单眼的正常视觉。随后，他们观察了初级视皮层（V1）对被剥夺眼和非剥夺眼的反应强度变化。研究结果表明，在出生后前三个月内缝合眼睑的幼猫，其反应该眼的神经元数量显著异常降低。然而，这些幼猫神经元的反应特性在所有方面均与成年正常猫眼睑缝合一年后的反应相同，且幼猫并未出现功能恢复。在成年猫中，单眼剥夺无法诱导眼优势可塑性。因此，视觉经验对V1神经连接的影响仅存在于一个短暂而明确的发育阶段，在此阶段之前和之后，相同刺激的影响均较弱。这种对视觉输入敏感性增强的阶段被称为视觉皮层的关键期。
尽管小鼠是夜行性动物，但其初级视皮层（V1）中的单个神经元具有与猫的神经元相似的特性3,4,5。近年来，随着转基因技术的快速发展，越来越多的视觉神经科学研究采用小鼠作为实验模型6,7
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方案
在本实验方案中，雄性C57Bl/6小鼠购自四川省医学科学院暨四川省人民医院实验动物研究所。所有动物护理和实验程序均经中国电子科技大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 小鼠出生后第28天的单眼剥夺（MD）
- 将手术器械、缝合针（直径 0.25 mm，线径 0.07 mm）和棉签放入铝盒中，在 120 °C 下高压灭菌 0.5 小时。用 75% 乙醇对超净台进行消毒。将手术器械置于干燥箱中烘干。
- 配制 2% 琼脂糖溶液，并置于 75 °C 水浴中以防止凝固。
- 使用异氟烷与氧气混合气体对小鼠进行麻醉（诱导浓度 2%，维持浓度 1.2–1.5%）。将小鼠固定于立体定位仪上，并使用温控装置维持小鼠体温在 37 °C，防止低体温。
- 在双眼上涂抹一层薄薄的石油基眼膏。
- 在带照明的解剖显微镜下，缝合单侧眼睑。使针穿过眼睑两侧各两次（图 1A），共缝约四针。
- 打结 2–3 次后剪断线头。在结上滴加 3 μL 快干胶以增强其稳定性，然后剪除多余的缝合线。
- 对小鼠进行腹腔注射布托啡诺（1 mg/kg）。
- 将小鼠转移至加热垫上，维持其体温在 37 °C，防止低体温，并持续监测直至其恢复意识。
- 当小鼠完全清醒后，将其放入单独的....
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结果
本文所述实验结果实现了在关键期（P19–P32）内对剥夺眼和非剥夺眼小鼠的单眼剥夺（MD）和眼优势（OD）可塑性的成功测量。图1展示了如何在单眼剥夺后第4天，于初级视皮层（V1）双眼区第4层进行单细胞单位记录，以比较同侧眼与对侧眼的反应。图2展示了刺激同侧眼和对侧眼时的峰电位分选及方位调谐特性测量结果。在峰电位分选中，通过聚类峰电位主成分的权重建立峰电位模板。以图2A,B为例，细胞01和细胞02通过峰电位分选被分类。通过刺激同侧眼和对侧眼测量单个神经元单位的方位调谐曲线。图2C,D展示了四个示例细胞的方位调谐曲线，其中两个来自接受单眼剥夺处理的小鼠，另两个来自未接受剥夺处理的小鼠。我们的结果显示，在单眼剥夺后第4天，刺激对侧眼和同侧眼时，小鼠的放电率相对接近（图2
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讨论
本文介绍了一种通过单细胞记录测量单眼剥夺（MD）及眼优势可塑性的详细实验方案。该方案在视觉神经科学研究中被广泛应用。尽管单眼剥夺实验本身并不复杂，但仍有一些关键的手术步骤必须严格遵循。首先，有两个重要细节可确保缝合质量：缝合线应集中在眼睑的内侧部分，以保证缝合的稳定性；此外，需在结头处涂抹约 3 μL 胶水，以增强结的稳定性，防止眼睛重新睁开。其次，应采取若干关键步骤以促进伤口愈合并减轻动物不适。缝合方法在本实验中至关重要。既往研究已证实，简单的连续缝合模式具有促进伤口愈合和缩短缝合时间的优点19,20。缝合线应细且稳定，以避免造成较大创伤并减轻不适感。建议使用直径约为 0.25 mm 的缝合针，且需打两到三个结以确保牢固。
在记录过程中还有一些关键点需要注意。麻醉剂浓度的控制是电生理记录中的一个重要因素。在麻醉动物中进行实验非常易于控制，结果具有高度的稳定性和可靠性。以往许多研究使用乌拉坦（urethane）作为麻醉剂。然而，在小鼠中使用乌拉坦难以精确控制麻醉深度.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由国家自然科学基金（81571770，81771925，81861128001）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 502 胶水 | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | AWG97028 | |
| 数据采集卡 | National Instument | PCI-6250 | |
| 琼脂糖 | Biowest | G-10 | |
| 放大器 | A-M system | Model 1800 | |
| 阿托品 | 阿拉丁生化科技股份有限公司 | A135946-5 | |
| 脑立体定位仪 | 瑞沃德生命科技有限公司 | 68001 | |
| 科汉-范纳斯弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| 隐形眼镜护理液 | 北京博士伦眼睛护理产品有限公司 | GM17064 | |
| 棉签 | 河南广德润医疗器械有限公司 | ||
| 精细持针器 | 苏州施强医疗器械有限公司 | CZQ1370 | |
| 镊子 | 66 视觉科技有限公司 | 53320A | |
| 镊子 | 66 视觉科技有限公司 | 53072 | |
| 镊子 | 66 视觉科技有限公司 | #5 | |
| 加热垫 | Stryker | TP 700 T | |
| 照明光源 | 麦克奥迪（中国）有限公司 | MLC-150C | |
| 异氟烷 | 瑞沃德生命科技有限公司 | R510-22 | |
| LCD 显示器 | 飞利浦（中国）投资有限公司 | 39PHF3251/T3 | |
| 显微镜 | 舜宇光学科技（集团）有限公司 | SZMT1 | |
| 无创生命体征监测仪 | Mouseox | ||
| 油压微操作器 | NARISHIGE International Ltd. | PC-5N06022 | |
| 凡士林眼用凝胶 | 德州亿乐消毒科技有限公司 | 17C801 | |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | Spike2 Version 9 | |
| 手术剪 | 66 视觉科技有限公司 | 54010 | |
| 手术剪 | 66 视觉科技有限公司 | 54002 | |
| 缝合针 | 宁波医用缝针有限公司 | 3/8 弧 2.5*8 | |
| 钨电极 | FHC, Inc | L504-01B | |
| 利多卡因 | 华清 |
参考文献
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Effects of monocular deprivation in kittens. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 248 (6), 492-497 (1964).
- Daw, N. W., Fox, K., Sato, H., Czepita, D. Critical....
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重印与许可
