本文介绍了一种用于谷类作物转录组分析的方法。基于微阵列的基因表达谱分析首先从谷物籽粒中分离高质量的总RNA，随后进行cDNA的合成。在完成cRNA标记和微阵列杂交后，本文提供了有关信号检测和质量控制的建议。
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摘要
摘要
基因表达的表征依赖于RNA的质量。在萌发、发育及成熟谷类种子中，高淀粉和高糖含量常常阻碍高质量RNA的提取。这些化合物会降低所提取总RNA的产量和质量。总RNA在数量和质量上的下降可能对后续转录组分析产生显著影响，导致无法准确反映待测样品中基因表达谱的空间和/或时间变化。在本方案中，我们描述了一种优化的总RNA提取方法，可获得足够数量和质量的RNA，用于谷类籽粒的全转录组分析。该方法适用于多种下游应用，可用于发育中、萌发中及成熟谷类种子的转录组谱型分析。文中展示了基于微阵列平台的转录组谱型分析方法。该方法专为具有已知基因组序列的谷类作物基因表达谱分析而设计。详细描述了从微阵列操作到最终质量控制的完整流程，包括cDNA合成、cRNA标记、微阵列杂交、芯片扫描、特征提取以及数据质量验证。通过该方法获得的数据可用于表征谷类在萌发过程、籽粒发育不同阶段，或不同生物和非生物胁迫条件下的转录组。本文展示的结果示例表明，所获得的高质量转录组数据适用于后续生物信息学分析，例如差异表达基因（DEGs）的鉴定、基因调控网络的表征，以及全转录组关联分析（TWAS）的开展。
引言
转录组代表了在特定时间和特定环境及生长条件下，一个生物体基因组所表达的全部核糖核酸（RNA）转录本。每个细胞都有其独特的转录组，反映了该细胞当前的生理和代谢状态。典型的转录组研究通常使用来自相似组织或器官的一群细胞，但单细胞转录组学和空间分辨转录组学正变得越来越流行1。转录组分析始于在特定时间点和明确的生长条件下，从选定组织中提取总RNA。为此，我们推荐使用一种新开发的方法，用于从富含淀粉或糖分的样品（如谷类种子）中提取总RNA2。对不同样品间转录组的比较可鉴定出丰度存在差异的RNA分子，这些RNA分子被称为差异表达基因（DEGs）。来自特定标记基因的转录本丰度可用于评估发育状态，或确定生物体对环境变化的响应。在所研究的各个发育时间点之间转录本丰度无明显变化的基因，通常被用作参考基因或看家基因。
RNA通常通过多种方法进行检测和定量，例如Northern印迹法和定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR），但目前的高通量转录组学方法在很大程度上依赖于使用微阵列技术的核酸杂交以及RNA测序（RNA-Seq）。RNA-Seq目前非常流行，因为它在高通量转录组学应用中具有多项优势，其他综述已有详细阐述3,4。尽管微阵列芯片技术出现较早，但由于其技术更为成熟，且对生物信息学背景要求较低，目前仍被广泛使用。与RNA-Seq相比，微阵列实验产生的数据集更小，更易于分析。此外，其成本效益更高，尤其适用于处理大量样本的情况。在本实验室中，我们常规使用基于微阵列技术的转录组分析，以确定调控谷物生长、发育和代谢过程中分子网络与通路的核心调控枢纽的作用5,6,7,8,9。我们还常规利用该技术开展全基因组基因表达谱研究，以深入理解谷物对非生物胁迫的响应机制10，并开展转录组范围关联分析（TWAS）和连锁作图研究，以鉴定影响谷物品质与营养的相关基因11,12。其他研究团队也已利用微阵列技术构建了大麦13、水稻14,15,16、高粱17和小麦18的发育特异性基因表达图谱。
本文的目的是提供一种简要的文字概述和详细的视觉描述，介绍我们实验室目前使用安捷伦（Agilent）微阵列平台对谷类籽粒进行转录组分析所采用的方法。请注意，虽然存在其他微阵列平台，但本方法中不涉及这些平台。本实验方案首先详细描述了从发育中或萌发中的谷类种子中提取RNA的过程。根据我们的经验，获得高质量和高产量的转录组以用于后续转录组学分析，往往是使用谷类种子组织时的瓶颈。我们曾尝试多种市售的RNA提取试剂盒，但均未获得满意的结果。因此，我们开发了一种化学提取方法，先获得粗RNA提取物，再利用市售试剂盒进行柱纯化。采用该方法，我们常规且可重复地获得了高质量的RNA2（图1），可用于多种下游应用以生成转录组谱型。
方案
1. 总RNA提取与纯化
注意：由于本方法涉及使用有害的挥发性有机溶剂，操作时必须始终在通风橱中进行。实验开始前，将含有无核酸酶水的微量离心管置于50 °C加热块中预热。此无核酸酶水将在步骤1.8中用于从离心柱中洗脱总RNA。
- 使用经液氮预冷的无菌研钵和研杵，将各样本（每个至少包含三个生物学重复）分别研磨成细粉。
- 用浸过液氮的小金属刮勺舀取粉末样本，并将其放入同样预先浸过液氮的2.0 mL无核酸酶微离心管中。立即将样本储存于超低温冰箱（-80 °C）中，直至安排进行批次RNA提取的日期（停止点）。
注意：种子样本可在去壳或不去壳的情况下研磨成细粉。对于水稻，我们通常在不去壳的情况下研磨样本，因为稻壳含有二氧化硅，有助于研磨过程。
注意：此步骤必须快速完成，并严格在低温条件下操作。一种自动化选择是使用低温球磨仪研磨样本，以最大限度减少RNA降解和质量下降。
- 用浸过液氮的小金属刮勺舀取粉末样本，并将其放入同样预先浸过液氮的2.0 mL无核酸酶微离心管中。立即将样本储存于超低温冰箱（-80 °C）中，直至安排进行批次RNA提取的日期（停止点）。
- 取约200 mg原始粉末样本，获得粗提RNA。将每个样本分别加入含有750 µL RNA提取缓冲液（100 mM Tris，pH 8.0，150 mM LiCl，50 mM EDTA，1.5% SDS，1.5% 2-巯基乙醇）和500 µL 苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）的无核酸酶微离心管中。
- 使用高速多管涡旋混合器在室温下同时混合所有样本5分钟。立即把所有离心管置于冰上静置2分钟。
注意：所有操作均应在通风橱内进行，尤其是涉及苯酚、氯仿及其他有机溶剂的步骤。理想情况下，应使用足够宽敞的通风橱，能够容纳台式离心机、涡旋混合器、多管涡旋混合器和多管旋转混合器。
- 使用高速多管涡旋混合器在室温下同时混合所有样本5分钟。立即把所有离心管置于冰上静置2分钟。
- 在14,000 × g 条件下离心10分钟，将粗提RNA与残渣分离。本步骤中所有离心操作均应采用相同设置。
- 将约800 µL上清液转移至新的2.0 mL微离心管中，该管内已含有400 µL 1.2 M NaCl和700 µL异丙醇。轻轻颠倒混合5次。
- 将样本置于普通低温冰箱（-20 °C）或超低温冰箱（-80 °C）中孵育至少1小时（或过夜），以沉淀RNA。
停止或暂停点：若需暂停数小时，可将样本保留在普通-20 °C冰箱中；若需过夜或更长时间暂停，则应将样本储存于超低温冰箱（-80 °C）中。
- 在18,800 × g 条件下离心15分钟，获得粗提RNA沉淀。弃去上清液后，使用小型试剂盒（材料表）通过柱纯化法进一步纯化RNA沉淀。
- 将沉淀溶解于450 µL新鲜配制的RLT缓冲液中（使用前每100 mL RLT缓冲液加入100 µL β-巯基乙醇，每日新鲜配制）。通过在室温下使用多管涡旋混合器混合至少5分钟，促进所有沉淀的充分溶解。
- 将溶解后的裂解液通过紫色微型离心柱（配有2 mL收集管）进行纯化。在室温下以9,000 × g 离心1分钟，弃去紫色微型离心柱。
- 向2 mL收集管中的澄清裂解液中加入0.5体积的无水乙醇（约225 µL）。使用同一塑料吸头反复吹打数次，混匀溶液。
- 立即将溶液转移至粉红色微型离心柱（配有2 mL收集管）中，以收集纯化的RNA。在9,000 × g 条件下离心15秒，使RNA结合到粉红色微型离心柱的硅胶膜上。弃去穿流液，加入350 µL RW1缓冲液，在9,000 × g 条件下离心15秒，洗涤RNA。
- 通过直接向膜上加入80 µL稀释的DNase 1（50 µL冷冻储存的DNase原液 + 350 µL RDD，使用DNase试剂盒配制），去除残留的基因组DNA，并在室温下孵育至少15分钟进行消化（暂停点）。
- 加入350 µL RW1缓冲液洗去DNase 1，并在9,000 × g 条件下离心15秒。重复两次，但此次使用500 µL RPE缓冲液洗涤。将离心柱转移至新的2 mL收集管中，在9,000 × g 条件下离心2分钟以干燥膜。
- 将干燥后的离心柱转移至新的1.5 mL无核酸酶收集管中。加入50 µL预热至50 °C的无核酸酶水，开始洗脱纯化后的RNA。在50 °C金属浴中孵育3分钟。
- 孵育结束后，在9,000 × g 条件下离心1分钟，洗脱总RNA。立即将所有样本置于冰上。
- 按照Nanodrop和BioAnalyzer各自的制造商操作说明，使用适当稀释度（通常为1:10）测定总RNA提取物的浓度和质量。RNA提取物的RIN值应至少达到8.0，浓度不低于50 ng/µL。图1展示了从小麦叶片和种子中提取RNA的典型结果。
停止点：将样本储存于-80 °C直至使用。
2. cDNA 合成后接 cRNA 转录与标记
注意：此步骤适用于同时处理24个样品。建议在一天内连续完成整个步骤，但文中已标明可选的暂停点。开始以下步骤前，务必预先将三个微量离心管加热块分别预热至80 °C、65 °C和37 °C。这些温度设置将根据下文步骤中的说明进行调整。例如，在配制完单色 Spike Mix 后（或若其已预先配制好），将37 °C加热块的温度调整为40 °C。根据制造商说明书，使用低输入快速扩增基因表达标记试剂盒（参见材料表）配制单色 Spike Mix、T7 启动子混合液和 cDNA 扩增主混合液。该配制过程取决于起始RNA提取物的量，通常总RNA的用量范围为10至200 ng，PolyA RNA为5 ng。我们常规使用50 ng总RNA作为微阵列杂交2及下文所述方法的起始材料。在为24个样品配制主混合液时，额外增加2个反应量，以补偿移液过程中的误差。此步骤中务必使用无核酸酶的微量离心管和无核酸酶水。
- 由于产量较高，通常需将RNA提取物稀释100倍，使其浓度落在50–100 ng范围内。根据步骤1.9中的RNA定量结果，在1.5 mL离心管中将1 µL纯化的RNA提取物加入99 µL无核酸酶水中，制成1:100稀释液。使用Nanodrop测定该稀释液的实际浓度。
- 在1.5 mL离心管中对每个总RNA样本进行第二次稀释，使最终体积为1.5 µL时含有50 ng总RNA。所有样本均需置于冰上保存。
- 根据制造商说明书配制Spike Mix。此步骤亦在Püffeld等20192中有简要总结。该步骤使用37 °C恒温金属浴。将单色Spike Mix阳性对照的第一和第二稀释液储存于超低温冰箱（-80 °C）中，且仅允许经历八次反复冻融循环。
- 第三和第四稀释液需每日新鲜配制。使用前将Spike Mix的第三和第四稀释液在冰上解冻并保存。
注意：当Spike Mix配制完成后（或若其已预先配制），应将37 °C金属浴的温度调整为40 °C。
- 第三和第四稀释液需每日新鲜配制。使用前将Spike Mix的第三和第四稀释液在冰上解冻并保存。
- 配制T7启动子混合液（T7 Promoter Mix），并在使用前置于冰上保存。以下配制量适用于24个样本：
20.8 µL T7启动子引物
+ 26.0 µL 无核酸酶水
= 46.8 µL 总体积T7启动子混合液 - 向每个含有步骤2.1中1.5 µL（50 ng）RNA样本的离心管中加入1.8 µL T7启动子引物混合液（步骤2.3）。通过多次移液充分混匀各组分。将RNA模板-引物混合物在65 °C金属浴中孵育10分钟以实现变性。随后立即将离心管置于冰上，为下一步操作做准备。
- 在变性模板-引物混合物的同时（步骤2.4），将5x第一链缓冲液（5x First Strand Buffer）在80 °C预热至少4分钟。根据制造商说明书，快速配制低输入快速扩增标记试剂盒（参见材料表）中的cDNA合成主混合液（cDNA synthesis Master Mix）。以下配制量适用于24个反应：
52.0 µL 预热的5x第一链缓冲液（步骤2.5）
+ 26.0 µL 0.1 M DTT
+ 13.0 µL 10 mM dNTP混合液
+ 31.2 µL RNase抑制剂混合液（RNase Block Mix）
= 122.2 µL 总体积cDNA合成主混合液- 所有组分均在冰上解冻，通过轻柔移液混匀。主混合液在使用前置于室温下保存。
注意：RNase抑制剂混合液使用后应立即放回-20 °C冰箱中。
- 所有组分均在冰上解冻，通过轻柔移液混匀。主混合液在使用前置于室温下保存。
- 将置于冰上的RNA模板-引物混合物（步骤2.4）短暂离心，以使管内所有液体沉降至离心管底部。向每管中加入4.7 µL cDNA主混合液（步骤2.5），通过轻柔上下移液仔细混匀。所有组分加入后总体积应为8.0 µL。
- 在40 °C金属浴中孵育2小时以合成cDNA。在2小时孵育期间，将65 °C金属浴的温度调整为70 °C，为后续热失活步骤（步骤2.7）做准备。
可选暂停点：样本可在-80 °C保存过夜。实验可在次日完成热失活（步骤2.7）后继续进行。
- 在40 °C金属浴中孵育2小时以合成cDNA。在2小时孵育期间，将65 °C金属浴的温度调整为70 °C，为后续热失活步骤（步骤2.7）做准备。
- 将各管在70 °C金属浴中孵育15分钟，以热失活RNase抑制剂混合液。立即转移至冰上，并至少孵育5分钟。
- 在样本于冰上孵育5分钟期间（步骤2.7），快速配制转录主混合液（Transcription Master Mix）。所有组分可在室温下混合，但需在冰上解冻。以下配制量适用于24个样本：
19.5 µL 无核酸酶水
+ 83.2 µL 5x转录缓冲液
+ 15.6 µL 0.1 M DTT
+ 26.0 µL NTP混合液
+ 5.5 µL T7 RNA聚合酶混合物（T7 RNA Polymerase Blend）
+ 6.2 µL 花青素3-CTP（Cy3）
= 156.0 µL 总体积转录主混合液
注意：T7 RNA聚合酶混合物应保存于-20 °C冰箱中，使用后立即放回。此外，Cy3对光敏感，因此混合（步骤2.9）和分装（步骤2.10）应在低光照条件下进行。为此，我们通常关闭实验台正上方的照明灯。 - 由于样本经历了快速升温和降温（步骤2.7），需使用微量离心机短暂离心各管，以收集管壁上的液体至管底。通过轻柔上下移液加入6 µL转录主混合液（步骤2.8）。此时反应总体积应为16 µL。将各管在40 °C孵育2小时，以生成Cy3标记的cRNA。
可选终止点：转录完成后，样本可在-80 °C保存。 - 在生成cRNA的同时（步骤2.9），将金属浴温度设定为55 °C。在金属浴中至少放置一管无核酸酶水，用于后续纯化cRNA的洗脱步骤。
- cRNA转录与标记完成后，使用RNeasy Mini试剂盒对标记的cRNA进行纯化，具体操作详见步骤3。
3. cRNA 纯化
- 使用RNeasy Mini试剂盒纯化标记的cRNA（参见材料表）。根据制造商说明书配制缓冲液。例如，试剂盒中提供的RPE缓冲液为浓缩液，使用前需加入4体积分子生物学级无水乙醇（96-100%）。
- 向每个样品中加入84 µL无核酸酶水，使总体积调整至100 µL。然后向每管中加入350 µL RLT缓冲液和250 µL无水乙醇。用移液器充分混匀。
- 将每种混合液700 µL转移至配有2 mL收集管的微型离心柱中。在4 °C、7,534 × g条件下离心30秒，使标记的cRNA结合于膜上。弃去穿流液。
- 用500 µL RPE缓冲液洗涤每个样品。离心并弃去穿流液，操作同前一步骤。重复此步骤一次，然后进入下一步。
- 将微型离心柱转移至新的收集管中。参照步骤3.3的条件进行离心，以干燥样品。
- 将微型离心柱转移至试剂盒提供的无核酸酶1.5 mL微量离心管中。直接向膜滤器中加入30 µL预热至55 °C的无核酸酶水，洗脱标记的cRNA样品。在55 °C金属浴中孵育60秒以提高洗脱效率。
- 在室温下以7,535 × g离心30秒收集洗脱的标记cRNA。弃去离心柱，盖紧各微量离心管。立即将每管置于冰上。
可选暂停点：洗脱后的样品可在-80 °C保存。 - 使用Nanodrop的微阵列功能测定cRNA浓度。将样品类型设为RNA-40。获取以下数值并记录于电子表格中：Cy3染料浓度（pmol/µL）、RNA吸光度比值（260 nm/280 nm）以及cRNA浓度（ng/µL）。
暂停点：读数后立即将cRNA样品在-80 °C保存。 - 按照Püffeld等20192中所述方法计算cRNA得率和比活性。
4. 微阵列杂交与扫描
注意：此步骤仅需 3-4 小时，因此可在午餐后开始 24 个样品的杂交。一名操作人员可轻松处理最多 4 张载片（32 个样品）。次日早晨用于微阵列载片的洗涤和扫描。随后可在第二天下午进行额外的运行。此步骤需重复进行，直至所有样品完成杂交和扫描。建议在处理和操作载片时使用无色、无粉的乳胶手套，以确保样品不会被可能干扰微阵列分析的有色色素污染。除商用微阵列外，以下定制阵列由我组设计，并可从 Agilent 订购：大麦（Hordeum vulgare）订购编号 028827，水稻（Oryza sativa 亚种 Japonica）订购编号 054269，水稻（Oryza sativa 亚种 Indica）订购编号 054270，小麦（Triticum aestivum）订购编号 048923。
- 使用基因表达杂交试剂盒进行微阵列杂交（参见材料表）。根据制造商说明书2配制10倍浓度阻断剂。将10倍浓度阻断剂分装为每份200 µL，-20 °C保存备用。每份分装可用于最多40次杂交反应，且在2个月内保持稳定。
- 在进行微阵列杂交的当天，将一份200 µL的10倍浓度阻断剂置于冰上解冻。同时，将杂交炉预热至65 °C，并将金属浴预热至60 °C，用于cRNA片段化过程。
- 按照制造商说明2为每个样本配制片段化混合液。在本实验室中，我们常规在8联微阵列中使用600 ng线性扩增的Cy3标记cRNA进行杂交。在此情况下，以下列表总结了每个样本片段化混合液的组分：
600 ng 线性扩增的、氰基3标记的cRNA
+ 5 µL 10倍浓度阻断剂
用无核酸酶水调整体积至24 µL
+ 1 µL 25倍浓度片段化缓冲液
= 总体积为25 µL的片段化混合液- 使用涡旋振荡器轻轻混匀样本。用微量离心机短暂离心所有样本。
- 将所有样本置于60 °C金属浴中精确孵育30分钟。立即在冰上冷却每支离心管1分钟，随后迅速进入下一步操作。
- 为彻底终止片段化反应，向每支离心管中加入2倍浓度GEx杂交缓冲液HI-RPM。通过反复吹打轻轻混匀，注意避免在混匀过程中引入气泡。我们常规使用25 µL杂交缓冲液来终止8联微阵列格式的片段化反应。
- 在室温下以15,750 x g离心所有离心管1分钟。迅速将所有离心管放回冰上，并尽快加载每个样本。
- 在离开实验室进行17小时过夜孵育前，按照视频中的详细说明准备杂交组件2。
- 关键步骤：将每份杂交混合液缓慢转移并滴加至每张垫片孔的中心位置，注意避免在加样过程中引入任何气泡。我们常规为8联微阵列格式使用44 µL杂交混合液。对于未使用的孔，也应加入44 µL 1倍浓度杂交缓冲液。
- 立即将微阵列芯片以正确方向放置于垫片芯片上方。此操作需格外小心，避免液体溢出。紧密闭合杂交组件后旋转检查，确保未引入永久性气泡。所有气泡应在垫片芯片内可移动。
- 将杂交腔室组件放入杂交炉旋转器中。若使用2倍浓度GEx杂交缓冲液，设置转速为10 rpm，并在65 °C下精确杂交17小时。
- 使用基因表达洗涤缓冲液试剂盒清洗杂交后的微阵列（参见材料表）。根据制造商说明2配制基因表达洗涤缓冲液1和2。向两种缓冲液中各加入2 mL 10% Triton X-102（此步骤完全可选，但强烈推荐，以减少微阵列洗涤伪影的发生）2。
- 按照先前发表的方法2准备三个洗涤腔室组件。各洗涤腔室的详细信息如下表所示（表1）。
- 将500 mL洗涤缓冲液1分装至1 L试剂瓶中，室温放置。另准备一个1 L试剂瓶并标记为"洗涤缓冲液1重复使用"，用于保存第一个腔室的洗涤缓冲液。此外，将500 mL洗涤缓冲液2分装至试剂瓶中，并在37 °C水浴中过夜孵育。
注意：在离开实验室前务必完成步骤4.9至4.11。这些步骤是次日洗涤操作所必需的。 - 次日，按照表2中的说明准备洗涤缓冲液。将每个培养皿加液至其对应缓冲液的四分之三体积。每种洗涤缓冲液最多可用于4-5张芯片。
- 在精确完成17小时杂交后，取出一个杂交腔室，在铺有无尘纸的实验台上拆解，具体操作详见先前发表的方法2。
- 关键步骤：将微阵列夹心结构转移至1号培养皿。确保微阵列条形码朝上并呈倾斜位置，避免将整张芯片完全浸入缓冲液中。操作每张微阵列芯片时应仅握持其两端，避免接触芯片的活性面。
- 使用镊子将两张玻璃片分离2。让垫片芯片轻轻落入1号培养皿底部，同时确保微阵列芯片被牢固持握以进行下一步操作。
- 关键步骤：缓慢侧向提起微阵列芯片，并立即转移至2号培养皿的微阵列架中，具体操作详见先前发表的方法2。必须确保微阵列芯片尽可能减少暴露于空气中。
- 重复步骤4.13和4.14，直至八张芯片均放入架中。将微阵列芯片均匀分布在架上。此步骤可由一名操作者独立完成，最多处理4张芯片。安装架固定器，并将整个2号培养皿装置转移至第一台磁力搅拌器上。轻轻搅拌精确1分钟。
- 在搅拌1分钟期间（步骤4.14），将3号培养皿从37 °C小型培养箱中取出并放置于第二台磁力搅拌器上。将来自37 °C水浴的洗涤缓冲液2轻轻倒入3号培养皿中。倾倒时避免产生气泡。
- 1分钟搅拌结束后（步骤4.14），缓慢而轻柔地将芯片架从2号培养皿中提起并转移至3号培养皿。取下架固定器，搅拌精确1分钟。
- 缓慢而轻柔地将芯片架从3号培养皿中提起。务必避免缓冲液滴的形成2。通过轻轻接触无尘纸来干燥每张芯片的侧面。将每张吸干的芯片放入芯片盒中，并重复步骤4.16，直至所有微阵列芯片均放入芯片盒。干燥约15分钟。
可选暂停点 - 将每张微阵列芯片放入芯片架中，确保条形码朝上。
注意：微阵列实验室内臭氧浓度应控制在50 ppb（100 µg/m3）或以下。此步骤完全可选，但强烈推荐：使用臭氧防护盖片以避免氰基染料因臭氧暴露而降解。 - 将组装好的芯片架放入扫描仪转盘中。根据条形码编号顺序加载样本。立即使用微阵列扫描仪（参见材料表）进行扫描，具体操作详见先前发表的方法2。
- 运行结束后，对数据进行特征提取和质量控制验证，具体操作详见先前发表的方法2。
结果
本方法针对含有大量淀粉或糖类污染物的谷类种子样品提取进行了优化。该方法设计为每天提取24个种子样品的总RNA。整个流程建议在一天内连续完成，但方案中已标明若干可选的暂停节点。此外，读者也可使用其偏好的RNA提取试剂盒或手动化学提取方法。然而，根据我们以往的经验，市面上的植物RNA提取试剂盒由于种子中含有大量淀粉、蛋白质、糖类和/或脂质污染物，通常不适用于种子样品。在本方法中，首先通过化学法提取粗制RNA，随后使用商业RNA提取试剂盒进行柱纯化。该组合方式通常可获得更高纯度和得率的RNA。图1展示了采用本方法提取RNA后，通过BioAnalyzer检测RNA质量的结果。图中展示了大麦叶片（样品1和2，代表低淀粉含量样品）和大麦种子（样品3和4，代表高淀粉含量样品）的检测结果。所有样品的RNA完整性（RIN）值均为10。
图1展示了纯化RNA提取物的代表性凝胶图像，其质量通过Bioanalyzer进行检测。样品1和2为低淀粉含量样品（如大麦叶片）的典型结果，可见叶绿体来源的额外rRNA条带。样品3和4为高淀粉含量样品（如大麦种子）的代表性结果，显示18S和28S rRNA条带。需要注意的是，由于叶绿体rRNA的存在，绿色植物组织（如叶片样品）无法自动计算RIN值。然而，可通过观察是否出现降解产物（通常表现为低分子量弥散条带）来直观判断RNA的完整性和高质量。根据本文所述方案，高淀粉种子样品（如大麦种子）的RIN值通常可达10。
此外，本文还展示了一项代表性的时间过程实验数据，该实验使用两个优质大麦自交系（Sofiara 和 Victoriana）进行麦芽品质分析19。在麦芽制备过程中，淀粉被转化为糖类，因此样品代表了具有不同淀粉与糖含量比例的组织。由于工业麦芽制备过程类似于种子萌发过程，因此我们对两种麦芽品质不同的大麦品系进行了转录组分析。从吸胀后 2、24、48、72、120、144 和 196 小时的萌发种子中提取 RNA，每个时间点设三个生物学重复。RNA 的制备及杂交至定制的大麦微阵列芯片的操作步骤如上所述。图 2 显示了微阵列杂交的标准化网格读数，该数据来自质量控制（QC）报告（图 3）中的结果，以及检测信号的直方图。网格示例展示了芯片各角落产生的信号，包括用于校准的背景和 spike-in 读数点。直方图则反映了具有相应信号强度的可检测点的分布偏差。成功的杂交应呈现一个宽广的高斯分布曲线，仅存在少量离群值，如图所示；失败的杂交可能导致曲线显著偏向一侧（“绿色怪物”）。
最后，可接受值的代表性结果如图3第4列所示。为了评估实验的可靠性，进一步使用GeneSpring软件对结果进行分析。所收集的数据以主成分分析（PCA）形式呈现。PCA将所选点（基因）的值整合为向量。所使用的分析点数量可从数百个到整张芯片不等，具体取决于所用软件。每张芯片（样品）产生一个由分析点的整合信号强度得出的值（向量）。因此，图中（PCA）各样品的相对位置反映了它们之间的相似性：样品间距离越近，相似性越高。技术重复应比生物重复更接近，而同一样品的生物重复应比来自不同时间点、组织或条件的样品更紧密地聚集在一起。
图1：使用Bioanalyzer检测RNA质量后获得的电泳图谱结果汇总。 样品1和2为大麦叶片组织，可见来自叶绿体的额外核糖体条带。样品3和4为大麦种子组织，显示18S和28S rRNA条带。对于叶片等绿色组织，RIN值并非总能计算得出，但根据凝胶结果判断，RNA质量非常好。样品3和4的RIN值为10。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：大麦微阵列杂交成功的质量控制报告。 芯片各角落的网格中均检测到信号，以“+”表示。直方图显示了经背景扣除并取对数后，按信号强度（荧光）分级的信号数量。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：杂交与扫描后质量控制（QC）的汇总。 杂交玻片的数值列于第2列（数值），可接受数值范围显示在第4列。 请点击此处查看该图的高清版本。
| 洗涤室组件 | 内容与标签 | 用途 |
| Dish 1 | 保持空置，放置于实验台直至次日 | 次日加入洗涤缓冲液1，用于拆解微阵列芯片 |
| Dish 2 | 加入一个微阵列芯片架和一根小型磁力搅拌子；标记为“Wash Buffer 1”，放置于实验台直至次日 | 用于次日使用洗涤缓冲液1清洗微阵列芯片 |
| Dish 3 | 加入一根小型磁力搅拌子，标记为“Wash Buffer 2”，并置于37 °C小型培养箱中 | 用于次日在37 °C小型培养箱内使用洗涤缓冲液2清洗微阵列芯片 |
表1：清洗室组件的制备。
| 步骤 | 培养皿 | 洗涤缓冲液 | 温度 | 时间 |
| 拆解 | 1 | 1 | 室温 | 尽可能快 |
| （步骤 4.13） | ||||
| 第一次洗涤 | 2 | 1 | 室温 | 1 min |
| （步骤 4.14） | ||||
| 第二次洗涤 | 3 | 2 | 37 °C | 1 min |
| （步骤 4.15） |
表2：洗涤室组件的孵育温度和时间。
讨论
所述方法可获得高产率和高质量的RNA提取物，且结果具有高度可重复性（图1）。根据我们的经验，建议每种基因型、发育阶段或实验条件设置三个生物学重复用于分析。为了能够检测到具有统计学意义的差异，必须考虑mRNA的总体丰度。但请注意，RNA提取步骤需要每份200 mg的组织样本，且需设置三个重复。因此，对于样本量有限的实验（如基因修饰植物材料），该方法可能不适用。
在微阵列杂交过程中，以下步骤最为关键：（1）将样品加载到垫片玻片上（步骤 4.7）以及（2）杂交后洗涤芯片（步骤 4.13 和 4.14）。样品加载时需格外小心，以避免产生气泡或液体溢出。将微阵列玻片放置到已加载样品的垫片玻片上时必须谨慎操作：应使DNA面（带有点样探针的一面）朝下，以利于杂交反应。在微阵列洗涤过程中，第二次洗涤步骤尤为关键：此处需非常缓慢地（10 秒）将玻片从洗涤缓冲液 2 中取出，以避免在玻片上形成缓冲液残留伪影，这些伪影可能干扰后续的数据采集与分析。
为了获得可用于下游生物信息学分析的杂交实验结果，应遵循一些重要标准。在完成上述实验方案后生成的质量控制（QC）报告，能够清楚地提示哪些方面需要改进，以及哪些数据处于可用状态（图3）。首先获得的信息是可视化网格图（图2）。在此图中可直接观察到所有荧光读取区域是否正确对齐。如果存在肉眼可见的偏移，将会影响所有其他数值（如背景值、信号强度等），该芯片的读数则不可使用。在总览图（所有异常值的空间分布）中，可以轻松识别出任何影响结果的污染（例如灰尘或毛发）。污染物可通过轻轻吹扫并重新扫描芯片的方式去除。如上所述，信号强度直方图应呈现为一个宽广的高斯分布曲线，仅有少量离群值（图2）。根据所分析的组织类型（图1），该曲线形态可能有所不同，可能出现双峰，或一个主峰伴随肩峰。这种情况不会影响数据质量。只有当峰值明显偏移，或边缘出现高强度信号时，才提示存在问题，例如"绿色怪物"（荧光强度过高），此类问题无法通过洗涤去除，应向芯片制造商报告。此外，"中位信号空间分布图"的数值应在某一共同值附近波动。该值通常在40至100之间，具体取决于所分析芯片的整体信号强度读数。另一项重要的质量控制是对外源添加对照（spike in）数据的评估：外源添加信号的对数图应呈现为一条线性且规则的直线。最后，"评估指标"表格提供了对所获结果的可靠评估。制造商在该表格中提供了可分类为“优秀”、“良好”和“需评估”的数值范围（图3）。根据我们的经验，部分指标并非始终适用于所有芯片。对于水稻定制芯片，"非对照值"常超出推荐范围，但对后续数据处理无显著影响。此外，"NegControl"的可接受范围可根据组织类型、生物体种类及芯片整体输出情况放宽至<80。根据我们的经验，E1中位值变异系数（E1 med CV）的评估范围也可放宽至<9，而非严格限定为<8。遵循上述原则，即可对所有芯片读数数据进行合理评估。总体而言，应始终牢记：独立的生物学重复始终能提供最可靠的结果。
与其它方法相比，该技术的优势在于其代表了一种经济高效、高通量的转录谱分析方法。此外，其下游数据分析流程更简便且更为成熟。尽管具有优势，该技术仍存在某些局限性，例如可分析的基因数量。微阵列仅能对先前在芯片上点样了探针的基因进行分析。因此，该技术仅适用于已完成基因组测序并具有完整基因注释的植物物种。我们预计，基于微阵列的转录组学不仅在基因表达谱分析方面，而且在其他下游生物信息学分析流程（如基因调控网络分析和全转录组关联研究）中，仍将继续具有重要价值和应用意义。
披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
本工作得到了CGIAR全球水稻农业粮食系统研究计划（CRP RICE）、面向非洲和南亚的耐逆境水稻（STRASA）第三阶段项目以及德国哈勒（萨勒）作物植物研究跨学科中心（IZN）的支持。我们感谢Mandy Püffeld提供的出色技术协助，以及Isabel Maria Mora-Ramirez博士在小麦芯片方面提供的信息与经验分享。我们感谢德国IPK Gatersleben研究所RH杂种优势研究组的Rhonda Meyer博士对稿件提出的修改意见和审阅。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ß-巯基乙醇 | Roth | 4227.3 | 使用前立即向20 mL RNA提取缓冲液中加入300 μl |
| Bioanalyzer 2100 | 安捷伦科技 | 测定RNA提取物的质量和数量 | |
| 碎冰机制备器 | 不同品牌 | 在样品处理过程中将样品保持在冰上 | |
| 杜瓦瓶 | 不同品牌 | 用作液氮容器 | |
| 乙醇，纯 | Roth | 9065.1 | |
| 基因表达杂交试剂盒 | 安捷伦科技 | 5188-5242 | 试剂盒组分： 2X Hi-RPM 杂交缓冲液 25X片段化缓冲液 10X基因表达阻断剂 |
| 基因表达洗涤缓冲液试剂盒 | 安捷伦科技 | 5188-5325 | 试剂盒组分： 基因表达洗涤缓冲液1 基因表达洗涤缓冲液2 Triton X-102 |
| 加热块 | 不同品牌 | 建议至少准备一个用于1.5 ml离心管的加热块和另一个用于2.0 ml离心管的加热块 | |
| 杂交炉 | 安捷伦 | G2545A | 用于微阵列杂交的不锈钢烘箱，由Sheldon Manufacturing生产，用于在微阵列中过夜杂交样本。 |
| 杂交垫圈载玻片试剂盒 | 安捷伦 | G2534-60014 | |
| iQAir 空气净化器 | 为确保实验在低臭氧区域进行 | ||
| 异丙醇 | Roth | 9866.5 | |
| 无绒纸，Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | KC34155 | |
| 低输入量快速扩增标记试剂盒 | 安捷伦科技 | 5190-2305 | 试剂盒组分： T7引物 5x 第一链缓冲液 0.1 M DTT 10 mM dNTP混合物 AffinityScript RNase抑制剂混合物 5x 转录缓冲液 NTP混合物 T7 RNA聚合酶混合物 无核酸酶水 Cy3-CTP |
| 小型金属刮勺 | 确保小型金属刮勺能够放入微量离心管中，以便于样品的轻松刮取。 | ||
| 微阵列扫描仪 | 安捷伦科技 | 推荐使用 Agilent SureScan 或 Agilent C 微阵列扫描仪 | |
| 微量离心管，无核酸酶 | 不同品牌 | 2.0 mL 和 1.5 mL 容量 | |
| 微型离心机 | Eppendorf | 5810 R | 建议至少配备一台常温离心机和一台低温离心机，转子需能够分别容纳24个1.5 ml和2.0 ml离心管 |
| 小型恒温培养箱 | Labnet | I5110-230V | 任何小型培养箱均可使用。 |
| 研钵和研杵 | 任何能够耐受使用液氮进行低温研磨的小型陶瓷或大理石研钵和研杵。 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Nanodrop 1000 | Peqlab / Thermofisher | ||
| 无核酸酶水 | Biozym | 351900302 | |
| 单色RNA外参试剂盒 | 安捷伦 | 5188-5282 | 试剂盒组分： 单色RNA外参混合物 稀释缓冲液 |
| 臭氧屏障载玻片盖盒套件 | 安捷伦 | G2505-60550 | 可选但强烈推荐 |
| PCR管，0.2 mL，无RN酶 | Stratagene | Z376426 | |
| 苯酚:氯仿:异戊醇混合液（25:24:1） | Roth | A156.2 | |
| 移液器吸头，无核酸酶，带滤芯吸头 | 不同品牌 | 适用于 2、20、20、100、200 和 1000 μl 体积 | |
| 移液器套装 | 不同品牌 | 适用于 2、20、20、100、200 和 1000 μl 体积 | |
| RNA提取缓冲液 | 10 mM Tri-HCl pH 8.0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1.5% EDTA 15 μL/mL β-巯基乙醇 | 我们常规使用 Roth 或 Sigma 的化学品；添加 β每日新鲜配制的β-巯基乙醇 | |
| RNase-free DNase 试剂盒 | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | 试剂盒组分： RNeasy mini 离心柱（粉色） 1.5 ml 收集管 2 ml 收集管 RLT缓冲液 RW缓冲液 缓冲液 RPE 无核酸酶水 |
| RNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 74904 | 试剂盒组分： RNeasy mini 离心柱（粉色） QIAshredder 离心柱（紫色） 1.5 ml 收集管 2 ml 收集管 RLT缓冲液 缓冲液 RLC 缓冲液 RW1 缓冲液 RPE 无核酸酶水 |
| DNA 微阵列扫描仪用载玻片架 | 安捷伦 | G2505-60525 | |
| 可拆卸支架的载玻片染色皿 | DWK Life Sciences 900200 | Fisher Scientific 08-812 | 我们推荐 DWK Life Sciences Wheaton™ 带可拆卸架的玻璃20片染色皿（含皿、盖和玻璃载片架） |
| 氯化钠 | Roth | P029.1 | |
| 超低温冰箱 | 不同品牌 | 可于 -80 保存样品 °C | |
| 涡旋混合器 | 不同品牌 | 至少一个用于单管涡旋混合器，另一个用于可同时涡旋混合多管的设备 |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling
Posted by JoVE Editors on 6/26/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. Two author names were updated.
The names were corrected from:
Christianne Seiler
Nese Sreeenivasulu
to:
Christiane Seiler
Nese Sreenivasulu
