Oenocytes 的解剖与脂滴染色 果蝇 幼虫

摘要

本文介绍了利用脂滴特异性荧光染料BODIPY 493/503对黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的oenocyte细胞进行解剖及脂滴染色的详细方法。

摘要

脂质对动物的发育和生理稳态至关重要。脂质代谢失调会导致多种发育缺陷和疾病，例如肥胖和脂肪肝。通常情况下，脂质储存在脂滴中，脂滴是细胞内具有多种功能的脂质储存细胞器。在不同组织和不同条件下，脂滴的大小和数量各不相同。已有研究表明，脂滴通过其生成和降解过程的调控而受到严密控制。在Drosophila melanogaster中，成脂细胞（oenocyte）是脂质代谢的重要组织，最近被确认为在应激条件下调控脂质动员的人类肝脏类似物。然而，成脂细胞中脂滴代谢的调控机制仍不清楚。为解决这一问题，建立一种可靠且灵敏的方法，以直接观察发育过程中及应激条件下成脂细胞内脂滴的动态变化显得尤为重要。本文利用亲脂性染料BODIPY 493/503（一种特异性标记脂滴的荧光染料），详细描述了一种针对饥饿条件下Drosophila幼虫成脂细胞进行组织解剖及后续脂滴染色的实验方案。该方法可通过共聚焦显微镜对不同条件下的脂滴动态进行定性分析。此外，这一快速且高度可重复的方法还可用于遗传筛选，以鉴定参与成脂细胞及其他组织中脂滴代谢的新型遗传因子。

引言

脂质对细胞存活至关重要。除了作为细胞膜系统基本组分的传统功能外，脂质还在个体动物整个生命周期的能量供应和信号转导过程中发挥关键作用¹。因此，脂质代谢必须受到严格调控，以维持细胞的生理稳态。已知脂质代谢失调会导致多种疾病，例如糖尿病和脂肪肝。尽管脂质代谢在动物健康中具有重要意义，但其调控机制在很大程度上仍不清楚。

Drosophila 多年来被广泛用于科学研究，自托马斯·H·摩根（Thomas H. Morgan）教授开始将其应用于遗传学及其他基础生物学问题的研究以来，一直发挥着重要作用²。近几十年来，越来越多的证据表明，Drosophila 是研究多种脂质代谢相关疾病（如肥胖症）的优良模式生物^1,3。特别是，Drosophila 与人类共享高度保守的代谢相关基因，并具有类似的功能组织/器官和细胞类型，参与脂质代谢过程。

例如，脂肪体的 果蝇，负责甘油三酯的储存，功能类似于人类脂肪组织。最近研究发现，一群特化的肝样细胞（即oenocytes），已被证实是人类肝脏的功能类似物，参与果蝇的脂肪酸和碳氢化合物代谢^....

方案

1. 产卵

1. 准备用于产卵的标准玉米粉培养基。
   注意： 有关此处使用的标准玉米粉培养基的配方及制备方法，请参见先前已发表的详细说明¹⁵。
2. 在50 mL离心管中，将6 mL蒸馏水加入4 g活性干酵母中，用刮刀混合制成酵母糊。
3. 将玉米粉培养基装入产卵瓶中，并用刮刀在培养基表面均匀涂抹约1 g酵母糊，制备产卵瓶。
4. 将目标基因型的果蝇放入产卵瓶中，并置于温度恒定为25 °C、湿度为60%的培养箱中。
   注意： 理想的杂交组合通常包括150只处女蝇和至少75只雄蝇。将产卵瓶置于避光盒中保持黑暗环境，可提高繁殖率。
5. 在收集卵之前，让果蝇产卵1小时，以排出雌蝇输卵管中残留的所有陈旧卵。
6. 让果蝇在新的产卵瓶中产卵1小时，随后将成虫移除。
   注意： 控制产卵时间以最小化胚胎发育的时间差异，从而获得发育阶段精确一致的幼虫。
7. 将卵置于25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的培养箱中继续发育84小时，直至进入三龄幼虫阶段。

2. 幼虫的饥饿处理

注意： 如上所述，在三龄幼虫....

结果

成功执行本实验步骤后，应能清晰显示脂滴染色结果，从而揭示脂细胞中脂滴的数量和大小。图1A,A',A'' 显示，在不同发育阶段正常喂养的幼虫脂细胞中，可检测到的脂滴（绿色点状结构）较少。图1B,B',B'' 显示，脂细胞中脂滴（绿色点状结构）的数量在饥饿处理12 h（B）、24 h（B'）和36 h（B''）后逐渐增加。需要注意的是，经过96 h后，正常喂养的幼虫（A）脂细胞中似乎出现一定程度的脂滴积累，这可能与其快速生长速率有关。研究人员在处理该阶段幼虫时应给予更多关注。

讨论

在上述步骤中，本实验方案包含若干关键环节，其中产卵时间尤为关键。作为一类脂质动员组织，脂细胞对营养状态高度敏感^6,8。若产卵时间过长，可能导致幼虫密度过高及食物竞争加剧，从而影响实验结果的准确性。本方案采用1小时的产卵时间，可确保幼虫在无营养竞争的条件下正常发育。若产卵时间延长而产生过多幼虫，也可能影响脂细胞中脂滴的数量和分布模式（如大小、数量和形态）。

此外，延长的产卵时间也会导致幼虫群体的发育阶段存在较大差异。因此，研究人员在使用影响胚胎或幼虫发育的突变体时应格外谨慎，因为这些突变体对脂滴分布模式的影响可能受到发育缺陷的继发效应干扰。时间过程实验表明，在从早期三龄幼虫（84 小时）发育至晚期三龄幼虫（120 小时）期间，饲喂状态下的脂肪细胞中几乎无法检测到脂滴。另外，与成虫脂肪细胞呈现琥珀色色素沉积不同，幼虫期的脂肪细胞是无色的⁵。因此，在解剖脂肪细胞时应格外注意，避免对其造成潜在损伤，尤其是在去除周围组织（如气管.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 离心管	Corning	430829	50 mL
6 cm 培养皿	Thermo Fisher	150326	6 cm
琼脂			用于果蝇食物
铝箔	N/A	N/A	防止样品见光
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	脂滴染色染料
共聚焦显微镜	Leica	Leica TSC SP5	共聚焦成像
玉米糖浆			用于果蝇食物
玉米粉			用于果蝇食物
盖玻片	Citoglas	10212424C	20 × 20 mm，厚度 0.13–0.17
解剖针	N/A	N/A
解剖板	N/A	N/A
滤纸	N/A	N/A	直径：11 cm
固定缓冲液	N/A	N/A	含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1× PBS
镊子	Dumont	11252-30	#5
培养箱	Jiangnan	SPX-380	用于果蝇培养
微量离心管	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
显微镜载玻片	Citoglas	10127105P-G
封片介质	VECTASHIELDAntifade Mounting Medium	H-1000	抗荧光淬灭封片剂
指甲油	PanEra	AAPR419	密封盖玻片
画笔	N/A	N/A
PBS	N/A	N/A	1× PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4）
旋转仪	Kylin-Bell Lab Instruments	WH-986
剪刀	Smartdata Medical	SR81	Vannas 弹簧剪
大豆粉			用于果蝇食物
刮勺	N/A	N/A
标准玉米粉培养基	N/A	N/A	根据布卢明顿标准玉米粉培养基配方配制
体视显微镜	Leica	Leica S6E	用于组织解剖
擦拭纸	N/A	N/A
酵母			用于果蝇食物
yw	实验室保种	N/A	果蝇