本文介绍了利用脂滴特异性荧光染料BODIPY 493/503对黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的oenocyte细胞进行解剖及脂滴染色的详细方法。
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方法文章
Oenocytes 的解剖与脂滴染色 果蝇 幼虫
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
脂质对动物的发育和生理稳态至关重要。脂质代谢失调会导致多种发育缺陷和疾病，例如肥胖和脂肪肝。通常情况下，脂质储存在脂滴中，脂滴是细胞内具有多种功能的脂质储存细胞器。在不同组织和不同条件下，脂滴的大小和数量各不相同。已有研究表明，脂滴通过其生成和降解过程的调控而受到严密控制。在Drosophila melanogaster中，成脂细胞（oenocyte）是脂质代谢的重要组织，最近被确认为在应激条件下调控脂质动员的人类肝脏类似物。然而，成脂细胞中脂滴代谢的调控机制仍不清楚。为解决这一问题，建立一种可靠且灵敏的方法，以直接观察发育过程中及应激条件下成脂细胞内脂滴的动态变化显得尤为重要。本文利用亲脂性染料BODIPY 493/503（一种特异性标记脂滴的荧光染料），详细描述了一种针对饥饿条件下Drosophila幼虫成脂细胞进行组织解剖及后续脂滴染色的实验方案。该方法可通过共聚焦显微镜对不同条件下的脂滴动态进行定性分析。此外，这一快速且高度可重复的方法还可用于遗传筛选，以鉴定参与成脂细胞及其他组织中脂滴代谢的新型遗传因子。
引言
脂质对细胞存活至关重要。除了作为细胞膜系统基本组分的传统功能外，脂质还在个体动物整个生命周期的能量供应和信号转导过程中发挥关键作用1。因此，脂质代谢必须受到严格调控，以维持细胞的生理稳态。已知脂质代谢失调会导致多种疾病，例如糖尿病和脂肪肝。尽管脂质代谢在动物健康中具有重要意义，但其调控机制在很大程度上仍不清楚。
Drosophila 多年来被广泛用于科学研究，自托马斯·H·摩根（Thomas H. Morgan）教授开始将其应用于遗传学及其他基础生物学问题的研究以来，一直发挥着重要作用2。近几十年来，越来越多的证据表明，Drosophila 是研究多种脂质代谢相关疾病（如肥胖症）的优良模式生物1,3。特别是，Drosophila 与人类共享高度保守的代谢相关基因，并具有类似的功能组织/器官和细胞类型，参与脂质代谢过程。
例如，脂肪体的 果蝇，负责甘油三酯的储存，功能类似于人类脂肪组织。最近研究发现，一群特化的肝样细胞（即oenocytes），已被证实是人类肝脏的功能类似物，参与果蝇的脂肪酸和碳氢化合物代谢4,5与哺乳动物肝脏类似，饥饿条件下，幼虫和成虫的脂肪细胞均会通过激活脂滴形成作出响应。 黑腹果蝇，导致oenocyte中脂滴积聚4,6,7,8从解剖学上看，oenocyte 紧密附着于腹部每个半体节侧向表皮内侧基底面，每簇约含六个细胞，因此难以将 oenocyte 簇从表皮中分离。因此，在解剖和染色过程中，必须使 oenocyte 保持附着于表皮。
脂质以脂滴的形式储存，脂滴是细胞中具有单层膜的细胞器9。在不同物种的几乎所有细胞类型中都存在脂滴10。脂滴的动态变化（包括其大小和数量）会随着环境应激因素而改变，这被视为代谢状态对衰老和饥饿等应激反应的反映7,8。因此，建立一种可行且可靠的方法，用于定性分析发育过程中及应激条件下oenocytes中脂滴的动态变化具有重要意义。特别是在三龄幼虫中，正常喂养条件下oenocytes中几乎检测不到或仅有极少的脂滴，而在营养剥夺后则会出现大量较大的脂滴4。为验证该方法的有效性，建议在饥饿条件下对oenocytes进行脂滴染色。
目前，已有多种疏水性染料可用于脂滴染色，例如非荧光染料苏丹黑（Sudan Black）和油红O（Oil Red O），以及荧光染料尼罗红（Nile Red）和BODIPY 493/50311。苏丹黑和油红O常用于组织中胆固醇酯和三酰甘油的染色，可通过光学显微镜轻松检测。然而，相对较高的背景染色和较低的分辨率是其在脂滴动态定性分析应用中的两个限制因素。为了克服非荧光染料的局限性，尼罗红和BODIPY 493/503被用作脂滴染色的理想替代品。已有报道指出，尼罗红也可检测部分游离胆固醇，因此在一定程度上，BODIPY 493/503对细胞内脂滴具有更高的特异性12,13,14。
最重要的是，为了满足对脂滴在oenocyte中快速且灵敏分析的需求，本实验方案提供了一种基于固定剂、使用BODIPY 493/503染料进行脂滴特异性染色的可行且高度可重复的方法。在本报告中，通过解剖获取oenocyte，并利用BODIPY 493/503对其中的脂滴进行染色，随后通过共聚焦显微镜检测脂滴。该方法操作简便、成本低廉，易于修改并进一步应用于其他领域，例如流式细胞术。
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方案
1. 产卵
- 准备用于产卵的标准玉米粉培养基。
注意： 有关此处使用的标准玉米粉培养基的配方及制备方法，请参见先前已发表的详细说明15。 - 在50 mL离心管中，将6 mL蒸馏水加入4 g活性干酵母中，用刮刀混合制成酵母糊。
- 将玉米粉培养基装入产卵瓶中，并用刮刀在培养基表面均匀涂抹约1 g酵母糊，制备产卵瓶。
- 将目标基因型的果蝇放入产卵瓶中，并置于温度恒定为25 °C、湿度为60%的培养箱中。
注意： 理想的杂交组合通常包括150只处女蝇和至少75只雄蝇。将产卵瓶置于避光盒中保持黑暗环境，可提高繁殖率。 - 在收集卵之前，让果蝇产卵1小时，以排出雌蝇输卵管中残留的所有陈旧卵。
- 让果蝇在新的产卵瓶中产卵1小时，随后将成虫移除。
注意： 控制产卵时间以最小化胚胎发育的时间差异，从而获得发育阶段精确一致的幼虫。 - 将卵置于25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的培养箱中继续发育84小时，直至进入三龄幼虫阶段。
2. 幼虫的饥饿处理
注意： 如上所述，在三龄幼虫中，正常饲喂条件下油细胞内几乎检测不到或没有脂滴，但在饥饿等应激条件下，油细胞内可诱导产生大量大型脂滴。为了进一步验证该方法，有必要对这些幼虫进行预处理，以诱导油细胞中脂滴的生成。本实验选用12小时、24小时和36小时的饥饿时间进程作为范例。特别地，短期饥饿（例如3小时）已足以在油细胞中诱导出可检测的脂滴。饥饿持续时间可根据具体的实验目的和条件进行调整。
- 制备饥饿处理和对照处理的实验装置。
- 对于饥饿处理装置：将适当大小的滤纸放入6 cm的培养皿中，并用移液器向滤纸上加入1 mL PBS。
- 对于对照处理装置：在培养皿中加入5 mL布卢明顿标准玉米粉培养基。
- 使用解剖刀轻轻刮取含有仍在培养基中钻行的幼虫的上层培养基，并将其转移至盛有5 mL PBS的培养皿中。在PBS中轻轻搅拌幼虫，以去除幼虫表面的食物残留，使其尽可能清洁。
- 使用小号画笔收集约40只大小相近的三龄幼虫。随机将它们分为两组，每组20只，分别放入饥饿处理组或对照处理组的装置中。
- 将实验装置置于25 °C、60%湿度的培养箱中，分别进行12 h、24 h和36 h的处理。
注意：对于饥饿处理组中的幼虫，每隔12 h添加1 mL PBS，以防止幼虫脱水。
3. 油细胞的解剖
- 使用小号画笔挑选适当年龄的幼虫（处理后 12 h、24 h 或 36 h），然后将其转移至一个盛有 5 mL 冰冷 PBS 的新培养皿中进行清洗。
注意：处理对照组幼虫时，重复步骤 2.2 以去除任何食物污染。 - 用冰冷的 PBS 填充分离板，并用镊子轻轻将幼虫转移至分离板中。将分离板置于体视显微镜下，进行后续解剖操作。
注意：低温有助于减缓幼虫的活动，便于解剖操作。 - 将幼虫腹面朝上、背面朝下放置，并用镊子轻轻固定。用解剖针从前端的咽部穿入，再用另一根针从后端的气门穿入，将幼虫固定在解剖板上。
注意：背侧可通过气管背侧主干的存在来最容易地识别。 - 使用 Vannas 弹簧剪刀从幼虫前端至后端沿纵向切开表皮。
- 用镊子去除表皮内的内部组织。
注意：在移除气管分支时需格外小心，避免损伤位于表皮内表面的脂细胞（oenocytes）。 - 用镊子取出解剖针，将表皮转移至一个装有 PBS 并置于冰上的 1.5 mL 微量离心管中。
- 按照上述步骤继续解剖其他幼虫。
4. 脂滴染色
- 将分离的表皮组织置于固定液中，在室温（RT）条件下于旋转仪上孵育 30 分钟。
注意：固定液含有 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液。 - 移除固定液后进行快速洗涤。快速洗涤操作如下：去除 PFA 后，向离心管中加入 1 mL 室温 PBS，轻轻重悬组织，随后弃去 PBS。
注意：固定液中含有对人类健康有害的多聚甲醛（PFA），必须将固定液作为危险废物妥善处理。 - 用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 5 分钟，以彻底清除残留的 PFA。
- 将表皮组织与 BODIPY 493/503（1 µg/mL；参见 材料表）在室温（RT）条件下于旋转仪上孵育 30 分钟。
注意：从本步骤开始，需用铝箔包裹微量离心管，以保护样品免受光照，减少可能的光漂白。 - 移除 BODIPY 493/503 染色液，并用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 10 分钟，以完全去除残留染料。
5. 封片与成像
- 在干净的显微镜载玻片上滴加 6 µL 封片剂。
注意：封片剂因其抗荧光淬灭特性，可用于延长检测时间。 - 使用镊子夹取一片表皮，并用纸巾轻轻吸除残留的 PBS。
- 将表皮放入封片剂中，调整其方向，使含有脂细胞的内表面朝下，外表面朝上。
- 轻轻将盖玻片覆盖在表皮上。
注意：如有必要，可用纸巾吸除从盖玻片边缘溢出的多余封片剂。为便于成像，可用镊子轻轻按压盖玻片，使在显微镜下观察时，脂细胞簇能清晰地处于同一焦平面。或者，也可沿中线将表皮切成两半，形成两个半片表皮，以避免完整表皮在封片时发生卷曲。 - 在盖玻片四周涂抹透明指甲油进行封固。
- 将载玻片放入避光样品盒中，在室温下静置，使指甲油干燥，通常需要 5–10 分钟。
- 进行显微镜分析。使用共聚焦显微镜（放大倍数 63×，GFP 或 FITC 滤光片参数优化，激发波长 = 488 nm，发射波长 = 503 nm）采集图像，以获得背景低、信号清晰且灵敏度高的图像。
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结果
成功执行本实验步骤后，应能清晰显示脂滴染色结果，从而揭示脂细胞中脂滴的数量和大小。图1A,A',A'' 显示，在不同发育阶段正常喂养的幼虫脂细胞中，可检测到的脂滴（绿色点状结构）较少。图1B,B',B'' 显示，脂细胞中脂滴（绿色点状结构）的数量在饥饿处理12 h（B）、24 h（B'）和36 h（B''）后逐渐增加。需要注意的是，经过96 h后，正常喂养的幼虫（A）脂细胞中似乎出现一定程度的脂滴积累，这可能与其快速生长速率有关。研究人员在处理该阶段幼虫时应给予更多关注。
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讨论
在上述步骤中，本实验方案包含若干关键环节，其中产卵时间尤为关键。作为一类脂质动员组织，脂细胞对营养状态高度敏感6,8。若产卵时间过长，可能导致幼虫密度过高及食物竞争加剧，从而影响实验结果的准确性。本方案采用1小时的产卵时间，可确保幼虫在无营养竞争的条件下正常发育。若产卵时间延长而产生过多幼虫，也可能影响脂细胞中脂滴的数量和分布模式（如大小、数量和形态）。
此外，延长的产卵时间也会导致幼虫群体的发育阶段存在较大差异。因此，研究人员在使用影响胚胎或幼虫发育的突变体时应格外谨慎，因为这些突变体对脂滴分布模式的影响可能受到发育缺陷的继发效应干扰。时间过程实验表明，在从早期三龄幼虫（84 小时）发育至晚期三龄幼虫（120 小时）期间，饲喂状态下的脂肪细胞中几乎无法检测到脂滴。另外，与成虫脂肪细胞呈现琥珀色色素沉积不同，幼虫期的脂肪细胞是无色的5。因此，在解剖脂肪细胞时应格外注意，避免对其造成潜在损伤，尤其是在去除周围组织（如气管...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（31671422、31529004 和 31601112）、111 计划（D18010）、广东省珠江人才计划地方创新科研团队项目（2017BT01S155）以及中国博士后科学基金（2018M640767）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mL 离心管 | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm 培养皿 | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| 琼脂 | 用于果蝇食物 | ||
| 铝箔 | N/A | N/A | 防止样品见光 |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | 脂滴染色染料 |
| 共聚焦显微镜 | Leica | Leica TSC SP5 | 共聚焦成像 |
| 玉米糖浆 | 用于果蝇食物 | ||
| 玉米粉 | 用于果蝇食物 | ||
| 盖玻片 | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm，厚度 0.13–0.17 |
| 解剖针 | N/A | N/A | |
| 解剖板 | N/A | N/A | |
| 滤纸 | N/A | N/A | 直径：11 cm |
| 固定缓冲液 | N/A | N/A | 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1× PBS |
| 镊子 | Dumont | 11252-30 | #5 |
| 培养箱 | Jiangnan | SPX-380 | 用于果蝇培养 |
| 微量离心管 | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| 显微镜载玻片 | Citoglas | 10127105P-G | |
| 封片介质 | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | 抗荧光淬灭封片剂 |
| 指甲油 | PanEra | AAPR419 | 密封盖玻片 |
| 画笔 | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1× PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4） |
| 旋转仪 | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| 剪刀 | Smartdata Medical | SR81 | Vannas 弹簧剪 |
| 大豆粉 | 用于果蝇食物 | ||
| 刮勺 | N/A | N/A | |
| 标准玉米粉培养基 | N/A | N/A | 根据布卢明顿标准玉米粉培养基配方配制 |
| 体视显微镜 | Leica | Leica S6E | 用于组织解剖 |
| 擦拭纸 | N/A | N/A | |
| 酵母 | 用于果蝇食物 | ||
| yw | 实验室保种 | N/A | 果蝇 |
参考文献
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center. , Indiana University Bloomington. https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019).
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell? Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
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