微量热泳技术能够以较低的材料消耗快速获得结合常数。目前市面上有标记型和无标记型微量热泳技术可供选择；然而，无标记型热泳技术在相互作用检测的多样性方面不及使用荧光标记的技术。本文提供了一种基于标记型热泳的检测方案。
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摘要
摘要
确定脂质与蛋白质结合亲和力的能力，是理解膜运输、信号转导以及细胞骨架重塑过程中蛋白质-脂质相互作用的关键环节。用于测量此类相互作用的经典工具包括表面等离子共振（SPR）和等温滴定 calorimetry（ITC）。尽管这些方法功能强大，但也存在局限性。ITC 需要大量纯化的蛋白质和脂质，而这些材料的制备可能成本高昂且困难。此外，ITC 和 SPR 均耗时较长，显著增加了实验的总体成本。克服这些限制的一种方法是采用相对较新的微尺度热泳（MST）技术。MST 快速且经济高效，仅需少量样品即可获得特定结合事件的饱和曲线。目前有两种类型的 MST 系统可供选择。一种 MST 需要在蓝光或红光光谱范围内用荧光染料进行标记；另一种系统则依赖芳香族氨基酸在紫外（UV）范围内的固有荧光。两种系统均通过检测分子在红外激光局部加热诱导下的运动来实现测量。每种方法各有优缺点。无标记 MST 可使用未标记的天然蛋白质；然而，许多分析物（包括药物）在紫外范围内具有荧光，可能干扰准确 KD 值的测定。相比之下，标记 MST 利用可见光范围内具有可测吸光度的荧光标记探针连接配体，避免了使用紫外光，从而减少了分析物产生干扰信号的可能性，适用于更广泛的成对相互作用测量。
引言
微量热泳是一种相对较新的技术，可用于测定生物化学相关配体之间的解离常数（KD）以及抑制常数（IC50）。目前主要的微量热泳商业设备供应商（如 NanoTemper）提供两种常用的 MST 技术：1）无需标记的微量热泳技术，但需要荧光标记；2）基于蛋白质自身荧光的标记热泳技术，其信号依赖于每个蛋白质中芳香族残基的数量1。无标记热泳技术的一个缺点是，在大多数情况下无法用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。然而，有可能通过蛋白质工程手段去除色氨酸等芳香族氨基酸，从而使其适用于无标记热泳分析2。
目前可用的技术中，微尺度热泳（MST）通过红外激光诱导产生微观温度场，测量粒子在该温度场中的运动响应1。MST可用于检测蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-脂质相互作用、蛋白质-小分子相互作用、竞争实验，甚至小分子之间的相互作用，只要能够产生足够的信号区分。此外，MST还能够测量嵌入脂质体或纳米盘中的膜蛋白相关相互作用。标记热泳技术利用荧光标记标签，实现配体与分析物之间化学可控的信号分离。对于蛋白质结合反应，热泳技术可在低纳摩尔浓度下测定其KD值，通常所需蛋白浓度远低于等温滴定量热法（ITC）的要求3。此外，MST不像表面等离子共振（SPR）那样对缓冲体系有严格要求4，且标记热泳甚至可用于含有基因插入荧光标签的非完全纯化蛋白溶液中，测定目标蛋白的结合常数56。MST的一个缺点是难以像SPR那样便捷地获得动力学参数2。
热泳测量依赖于溶液的局部温差。这种热量可由红外激光产生。MST 仪器配备了一个与红外（IR）光束耦合的荧光检测器，能够检测在红外激光照射点处因荧光分子局部浓度变化所引起的荧光信号改变。MST 仪器利用直接耦合至荧光检测器的红外靶向激光，使检测器聚焦于溶液中产生热量的同一位置，从而稳定地检测与红外激光加热区域分子耗竭相对应的温度变化。通常情况下，随着温度升高，靠近红外激光区域的测量荧光信号会降低。所测得的差异可能由多种因素引起，包括电荷、分子大小或溶剂化熵的变化。这些差异表现为在热诱导条件下，或分子从毛细管加热区域向较冷区域移动时，荧光信号的变化。
在将特定溶液装入毛细管时，重要的是在毛细管两端留有空气，不要将毛细管完全充满溶液。商用毛细管可容纳约 10 μL 溶液。只要将 5 μL 溶液准确移至毛细管中心位置、溶液中无气泡（可在装管前对溶液进行脱气处理），并在装载样品架时小心操作以避免溶液偏离毛细管中心（红外激光的照射位置），即可获得准确的测量结果。如果激光未能完全与溶液接触，该浓度的测量结果很可能出现以下三种不可用情况之一：1）无荧光或荧光信号过低；2）荧光信号过高（可能伴随锯齿状峰形）；3）荧光信号虽处于该滴定系列的合理数值范围内，但峰形呈锯齿状且不圆滑。
对于标记的热泳实验，荧光信号强度在200至2000荧光单位之间为最佳7。MST仪器提供0到100范围内的LED强度设置，可据此调节信号使其高于200或低于2000。或者，也可通过使用不同浓度的标记配体来调整荧光信号至最佳水平。在数据分析时，必须运行一次毛细管扫描（cap scan）作为参考，因为较差的毛细管扫描常会导致出现可能被判定为离群值的数据点。若仅测量一个MST功率并包含毛细管扫描，每次运行时间约为30分钟。商用仪器允许调整MST功率。在较早的软件版本中，该值可设置为0到100；而在较新版本中，可选择低、中或高MST功率。为了获得稳定可靠的信号曲线，研究人员可能需要尝试每种设置，并确定哪种MST参数能为特定相互作用提供最稳健的数据。
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方案
1. 材料准备
- 配制磷酸盐缓冲液（PBS）：137 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM NaH2PO4 和 2 mM KH2PO4，pH 7.41。
- 配制 NTA-Atto 647 N 染料：将储存于 100% DMSO 溶液中的 NTA-Atto 647 N 染料用不含 Tween 的 PBS 稀释至 100 nM。
- 在 E. coli 中表达 Vam7-His8 蛋白作为融合蛋白，并使用 Ni-NTA 亲和层析和凝胶过滤层析进行纯化8。
- 用 PBS 缓冲液对分析物进行滴定。如果分析物处于不同的缓冲液中，微量热泳动（MST）标记法对诸如 DMSO 等小分子引起的轻微缓冲液差异不敏感，除非分析物缓冲液成分与标记蛋白发生相互作用。
2. MST 设备的准备
- 打开设备背面的电源开关。
- 打开控制软件，确保笔记本电脑已开机，并且与连接到设备的计算机处于连接状态。
- 输入本实验的荧光和微尺度热泳（MST）参数设置。设定 MST 前 到 3 s, MST 开启 30 s，以及 荧光恢复（Fluo.） 之后 1 秒在测量初始荧光前无需长时间孵育；MST 是指热诱导后达到平衡所需的实际时间。
- 毛细血管表：对于每根毛细管，输入靶标（配体）的名称、配体（分析物）的名称、靶标的浓度、最高滴定浓度，并使用自动填充滴定比例。例如，输入 50 nM 作为 Vam7-His8 的靶标浓度 Vam7-His8 靶标名称为 (1,2-二辛酰基磷脂酸) Di-C8 PA，配体名称为配体，选择配体的最高浓度为1:1，并拖动自动填充至第2-16号孔。
- 运行一个 帽扫描 选择合适的LED（20% LED（预设）） 根据目标蛋白的信号 并在200至2000荧光单位之间调整标记MST的信号。 帽扫描 应呈现均匀、圆润的钟形峰。
- 选择一系列MST功率，并输入每个功率的测试值，以确定最稳定的结合拟合和信号响应 开始帽扫描 + 测量，扫描不同数值以确定被测相互作用的最佳操作条件。
- 使用分析软件和Tjump热泳预设，通过最佳拟合确定MST功率。根据最低浓度与最高浓度之间的荧光分离程度，结合最佳拟合的MST功率分析拟合结果，并为重复实验选择合适的MST功率。
- 通过进入分析软件并将分析模式切换为专家模式，判断第一次和第二次运行之间是否发生了光漂白。接着，选择荧光而非热泳进行分析。选择专家模式，然后选择光漂白。
3. 标记MST样品的制备
- 将 Vam7-His8 溶液用不含 Tween 的 PBS 缓冲液稀释至浓度为 200 nM。
- 将 NTA-Atto 647 染料用不含 Tween 的 PBS 缓冲液稀释至浓度为 100 nM。
- 按 1:1 的体积比混合 Vam7-His8 与 NTA-Atto 647 染料，避光室温孵育 30 分钟。 参照第 2.5 节确定目标蛋白的合适浓度（参见 视频中关于 Ni-NTA 染料 KD 值应用的补充说明）。
- 在避光环境中，使用台式离心机以约 8,161 × g 的离心力将 NTA-Atto 647 染料与蛋白的混合物离心 10 分钟。
- 实验后将混合物于 4 °C 保存，或在实验期间置于冰上，若需在数小时内重复使用，以防止蛋白变性。
- 使用 NT 浓度计算器确定滴定所需的浓度范围。
- 将 Di-C8 PA 溶于水中，配制为适当的最大浓度。
- 根据上一步结果，在 PBS 缓冲液中对分析物进行 1:1 系列稀释，共配制 16 个浓度。与表面等离子共振（SPR）不同，热泳技术对缓冲液差异的敏感性较低。
4. 样品的微量热泳动实验
- 打开设备及连接的笔记本电脑。
- 按下仪器前面的向上箭头，滑出毛细管架。
- 将毛细管装入支架中，浓度最高的样品置于第1位。
- 在控制软件中，选择对应 NTA-Atto 647 N 的红色通道。
- 在毛细管列表中输入每根毛细管的浓度、位置和名称信息。
- 点击开始毛细管扫描，以20% LED（预设值）进行扫描，并根据需要通过调节LED强度或配体（标记蛋白）浓度，将荧光信号调整至200至2000荧光单位之间。
- 选择合适的MST功率范围。
- 启动毛细管扫描 + MST测量。
- 使用分析软件进行数据分析。
5. MST 数据分析
注意：Nanotemper 提供的分析软件为专有软件，需使用 M.O. Affinity Analysis 进行分析。可根据荧光或热泳动原理采用不同方法测量结合亲和力。该软件的新版本默认设置为使用热泳动自动分析数据，并默认采用结合 Tjump 的热泳动模式，以充分利用两种测量方式。此外，也可单独选择仅使用 Tjump 或仅使用热泳动。分析软件还支持在专家模式下，通过初始荧光进行结合亲和力的估算。这些设置仅可在专家模式中访问。
- 在“数据选择”界面中，点击数据集旁闪电图标对应的复选框，将分析软件中的评估策略设置为专家模式。分析软件默认设置为进行MST分析；但研究人员也可选择“创建新分析”，并选择“初始荧光分析”，以基于初始荧光信号估算结合亲和力。初始荧光分析同样提供专家模式。在下文所述的分析中，采用热泳（thermophoresis）和温度跃变（Tjump）方法测定Vam7-His8与其天然底物磷脂酸（phosphatidic acid）结合的KD值。
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结果
这是使用亲和力分析的一个示例结果。采用标记的微量热泳（MST）方法测定Vam7-His8 与其天然底物之一的可溶性二辛酰基（DiC8）磷脂酸（PA）之间的结合常数9。图1展示了在500 μM起始浓度的DiC8 PA对50 nM Vam7-His8进行1:1滴定实验中一次试验所获得的热泳曲线。图中显示了初始荧光（红外激光开启前的时间）、Tjump（红外激光刚开启后的初始时间段）以及热泳阶段（粒子达到与温度平衡后的状态）。可通过上述任一测量值单独计算解离常数 KD，也可结合Tjump与热泳两个测量值进行综合分析。
在 图2，分析软件输出的Tjump热泳饱和曲线如图所示。如图所示 图2，可根据这些结果绘制饱和曲线；然而，由于Fnorm并非从零开始，计算饱和曲线可能存在困难。为解决这一问题，可对数据...
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讨论
Vam7-His8与DiC8-PA结合的测定结果给出了该相互作用的稳健拟合KD 值，其亲和力略低于Vam7-His8 与PA脂质体结合所测得的KD值（未发表数据）。这种差异很可能是由于缺乏膜结构所致，通常情况下，缺少膜环境会导致膜特异性脂质结合相互作用的亲和力降低，因此该结果说明了脂质体膜支架在此相互作用中的重要作用11。
为了进一步确定 MST 数据的强度，研究人员需要同时考察曲线图的形状 图1 以及所选分析方法中迹线的分离。观察来自 图1，大多数浓度下，曲线的热泳部分趋于平稳，形成清晰的轨迹。在某些情况下，轨迹对应于荧光测量末期含有较高分析物浓度的反应 可能是由于样品在毛细管上的聚集或黏附所致，可通过向缓冲液中添加Pluronic、Tween或两者来解决
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披露
作者声明不存在潜在的利益冲突。
致谢
本研究获得了美国国家科学基金会（MCB 1818310）向RAF提供的资助。 本工作部分得到了H. Lee Moffitt癌症中心化学生物学核心设施/蛋白质晶体学单元（NIH/NCI：P30-CA076292）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Cy5 马来酰亚胺单反应性染料 | GE Healthcare | PA23031 | 用于蛋白质标记 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | ||
| Monolith NT.115 毛细管（1000 支） | Nanotemper | MO-K022 | MST 实验用毛细管 |
| Monolith NT.115 仪器 | Nanotemper | 大学设备 | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | 用于 His 标签的标记 |
| 磷脂酰肌醇-3-磷酸二辛酰酯（PI(3)P diC8） | Echelon | P-3008 | 结合实验用脂质 |
参考文献
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