微量热泳技术能够以较低的材料消耗快速获得结合常数。目前市面上有标记型和无标记型微量热泳技术可供选择；然而，无标记型热泳技术在相互作用检测的多样性方面不及使用荧光标记的技术。本文提供了一种基于标记型热泳的检测方案。
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摘要
摘要
确定脂质与蛋白质结合亲和力的能力，是理解膜运输、信号转导以及细胞骨架重塑过程中蛋白质-脂质相互作用的关键环节。用于测量此类相互作用的经典工具包括表面等离子共振（SPR）和等温滴定 calorimetry（ITC）。尽管这些方法功能强大，但也存在局限性。ITC 需要大量纯化的蛋白质和脂质，而这些材料的制备可能成本高昂且困难。此外，ITC 和 SPR 均耗时较长，显著增加了实验的总体成本。克服这些限制的一种方法是采用相对较新的微尺度热泳（MST）技术。MST 快速且经济高效，仅需少量样品即可获得特定结合事件的饱和曲线。目前有两种类型的 MST 系统可供选择。一种 MST 需要在蓝光或红光光谱范围内用荧光染料进行标记；另一种系统则依赖芳香族氨基酸在紫外（UV）范围内的固有荧光。两种系统均通过检测分子在红外激光局部加热诱导下的运动来实现测量。每种方法各有优缺点。无标记 MST 可使用未标记的天然蛋白质；然而，许多分析物（包括药物）在紫外范围内具有荧光，可能干扰准确 KD 值的测定。相比之下，标记 MST 利用可见光范围内具有可测吸光度的荧光标记探针连接配体，避免了使用紫外光，从而减少了分析物产生干扰信号的可能性，适用于更广泛的成对相互作用测量。
引言
微量热泳是一种相对较新的技术，可用于测定生物化学相关配体之间的解离常数（KD）以及抑制常数（IC50）。目前主要的微量热泳商业设备供应商（如 NanoTemper）提供两种常用的 MST 技术：1）无需标记的微量热泳技术，但需要荧光标记；2）基于蛋白质自身荧光的标记热泳技术，其信号依赖于每个蛋白质中芳香族残基的数量1。无标记热泳技术的一个缺点是，在大多数情况下无法用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。然而，有可能通过蛋白质工程手段去除色氨酸等芳香族氨基酸，从而使其适用于无标记热泳分析2。
目前可用的技术中，微尺度热泳（MST）通过红外激光诱导产生微观温度场，测量粒子在该温度场中的运动响应1。MST可用于检测蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-脂质相互作用、蛋白质-小分子相互作用、竞争实验，甚至小分子之间的相互作用，只要能够产生足够的信号区分。此外，MST还能够测量嵌入脂质体或纳米盘中的膜蛋白相关相互作用。标记热泳技术利用荧光标记标签，实现配体与分析物之间化学可控的信号分离。对于蛋白质结合反应，热泳技术可在低纳摩尔浓度下测定其KD值，通常所需蛋白浓度远低于等温滴定量热法（ITC）的要求
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方案
1. 材料准备
- 配制磷酸盐缓冲液（PBS）：137 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM NaH2PO4 和 2 mM KH2PO4，pH 7.41。
- 配制 NTA-Atto 647 N 染料：将储存于 100% DMSO 溶液中的 NTA-Atto 647 N 染料用不含 Tween 的 PBS 稀释至 100 nM。
- 在 E. coli 中表达 Vam7-His8 蛋白作为融合蛋白，并使用 Ni-NTA 亲和层析和凝胶过滤层析进行纯化8。
- 用 PBS 缓冲液对分析物进行滴定。如果分析物处于不同的缓冲液中，微量热泳动（MST）标记法对诸如 DMSO 等小分子引起的轻微缓冲液差异不敏感，除非分析物缓冲液成分与标记蛋白发生相互作用。
2. MST 设备的准备
- 打开设备背面的电源开关。
- 打开控制软件，确保笔记本电脑已开机，并且与连接到设备的计算机处于连接状态。
- 输入本实验的荧光和微尺度热泳（MST）参数设置。设定 MST 前 到 3 s,
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结果
这是使用亲和力分析的一个示例结果。采用标记的微量热泳（MST）方法测定Vam7-His8 与其天然底物之一的可溶性二辛酰基（DiC8）磷脂酸（PA）之间的结合常数9。图1展示了在500 μM起始浓度的DiC8 PA对50 nM Vam7-His8进行1:1滴定实验中一次试验所获得的热泳曲线。图中显示了初始荧光（红外激光开启前的时间）、Tjump（红外激光刚开启后的初始时间段）以及热泳阶段（粒子达到与温度平衡后的状态）。可通过上述任一测量值单独计算解离常数 KD，也可结合Tjump与热泳两个测量值进行综合分析。
在 图2，分析软件输出的Tjump热泳饱和曲线如图所示。如图所示 图2，可根据这些结果绘制饱和曲线；然而，由于Fnorm并非从零开始，计算饱和曲线可能存在困难。为解决这一问题，可对数据.......
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讨论
Vam7-His8与DiC8-PA结合的测定结果给出了该相互作用的稳健拟合KD 值，其亲和力略低于Vam7-His8 与PA脂质体结合所测得的KD值（未发表数据）。这种差异很可能是由于缺乏膜结构所致，通常情况下，缺少膜环境会导致膜特异性脂质结合相互作用的亲和力降低，因此该结果说明了脂质体膜支架在此相互作用中的重要作用11。
为了进一步确定 MST 数据的强度，研究人员需要同时考察曲线图的形状 图1 以及所选分析方法中迹线的分离。观察来自 图1，大多数浓度下，曲线的热泳部分趋于平稳，形成清晰的轨迹。在某些情况下，轨迹对应于荧光测量末期含有较高分析物浓度的反应 可能是由于样品在毛细管上的聚集或黏附所致，可通过向缓冲液中添加Pluronic、Tween或两者来解决
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披露
作者声明不存在潜在的利益冲突。
致谢
本研究获得了美国国家科学基金会（MCB 1818310）向RAF提供的资助。 本工作部分得到了H. Lee Moffitt癌症中心化学生物学核心设施/蛋白质晶体学单元（NIH/NCI：P30-CA076292）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Cy5 马来酰亚胺单反应性染料 | GE Healthcare | PA23031 | 用于蛋白质标记 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | ||
| Monolith NT.115 毛细管（1000 支） | Nanotemper | MO-K022 | MST 实验用毛细管 |
| Monolith NT.115 仪器 | Nanotemper | 大学设备 | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | 用于 His 标签的标记 |
| 磷脂酰肌醇-3-磷酸二辛酰酯（PI(3)P diC8） | Echelon | P-3008 | 结合实验用脂质 |
参考文献
- Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
- Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, nP.
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重印与许可
