本方案描述了使用激光切割神经血管植入物对血液接触类器械进行全面血液相容性评价的方法。采用新鲜肝素化人血构建循环流动模型以模拟血液流动。灌注后，分析多种血液学指标，并与采血后立即测得的数值进行比较，以评估被测器械的血液相容性。
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方法文章
模拟人体血流的循环流动模型中血液接触型植入物的血液相容性测试 血液相容性测试，植入物，体外循环模型，血流动力学，溶血，血小板活化，凝血功能，白细胞反应，补体激活，血栓形成
本文内容
摘要
摘要
医疗设备（如血管移植物、支架和心脏导管）在体内循环系统中用于临时或永久性植入的情况日益增多，这要求采用一种可靠且多参数的方法，以评估这些设备可能引起的血液学并发症（即血液成分的激活与破坏）。对接触血液的植入物进行全面的体外血液相容性测试，是实现其成功体内应用的第一步。因此，在临床应用前，必须依据国际标准化组织10993-4（ISO 10993-4）标准进行广泛的分析。本文介绍的流动回路描述了一种灵敏的模型，用于分析支架（本例为神经血管支架）的止血性能，并揭示其不良影响。使用新鲜的人全血以及轻柔的采血方式至关重要，以避免血液在实验前被激活。血液在37 °C条件下，以每分钟150 mL的流速，通过蠕动泵驱动，在含肝素涂层管路及测试样品的回路中灌注60分钟。在灌注前后，检测血液学指标（即血细胞计数、血红蛋白、红细胞压积以及血浆标志物），以评估白细胞（多形核中性粒细胞[PMN]-弹性蛋白酶）、血小板（β-血小板球蛋白[β-TG]）、凝血系统（凝血酶-抗凝血酶III复合物[TAT]）以及补体级联反应（SC5b-9）的激活情况。综上所述，我们提出了一种在临床应用前对支架及其他接触血液的医疗器械进行广泛血液相容性评价所必需且可靠的模型。
引言
植入物和与人体血液相互作用的生物材料在体内的应用，需要进行严格的临床前测试，重点研究止血系统各种标志物的变化。国际标准化组织10993-4（ISO 10993-4）规定了对血液接触类器械（如支架和血管移植物）进行评价的核心原则，并考虑了器械的设计、临床用途以及所需材料1。
人血是一种含有多种血浆蛋白和细胞的液体，其中包括白细胞（白血球，WBCs）、红细胞（红血球，RBCs）和血小板，这些成分在人体内执行复杂的功能2异物材料与血液直接接触可能引发不良反应，例如激活免疫系统或凝血系统，从而导致炎症反应、血栓并发症以及植入后的严重问题。3,4,5因此, 体外血液相容性验证可在植入前检测并排除血液与异物表面接触后可能引发的任何血液学并发症6.
本研究建立的循环流动模型通过在管路（直径为3.2 mm）中施加150 mL/min的流速，模拟脑血流条件和动脉直径，用于评估神经血管支架及类似器械的血液相容性2,
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方案
该血液采样程序已获得图宾根大学医学院伦理委员会批准（项目识别代码：270/2010BO1）。所有受试者在参与前均签署了书面知情同意书。
1. 肝素负载单管的制备
- 将未稀释的肝素（5,000 IU/mL）与氯化钠（NaCl，0.9%）溶液混合，配制终浓度为 15 IU/mL 的肝素溶液。
- 向每个中性单支采血管（9 mL）中加入 900 µL 稀释后的肝素溶液，以便在采血后获得 1.5 IU/mL 的终末肝素浓度。每位供体准备三支采血管，另加三支备用采血管，并将装有肝素的采血管于 4 °C 保存至采血前。
2. 血液采样
- 在采血前30分钟，将含肝素的单支采血管从冰箱中取出。
- 通过静脉穿刺，从每位健康供体（n = 5）采集27 mL血液样本用于流环实验。仅使用平滑的止血带，以避免血小板和血液凝固级联反应的过早激活。
- 将血液样本分别收集到三支含有900 µL肝素溶液（1.5 IU/mL）的单支采血管中，并将这三支采血管的血液全部汇入一个塑料容器中，以确保所有成分均匀分布。
- 立即将混合后的肝素化血液分别转移至另外三支不同的单支采血管中，其中分别含有EDTA（1.2 mL）、枸橼酸盐（1.4 mL）或枸橼酸盐、茶碱、腺苷和双嘧达莫混合物（CTAD，2.7 mL），用于获取基线值。随后按照第5–....
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结果
简要总结，采集含肝素的单支采血管中的人全血，混匀后用于评估细胞计数的基线水平以及血浆中血液相容性标志物。
随后，使用蠕动泵以150 mL/min的流速和37 °C的温度，向含有神经血管植入物样品的管路中灌注血液，并持续灌注60分钟。再次对所有组别的细胞数量进行分析，并制备血浆样本用于ELISA检测（图1）。所有样品类型及对照组的血细胞数量和血液参数（如血红蛋白和红细胞压积）均在采血后立即以及在流动回路模型中灌注后直接进行定量分析。结果显示，白细胞数量（图2A）、红细胞数量（图2B）以及红细胞压积值（图2C）在各组间均未检测到显著变化。然而，与基线值相比，在流动回路模型中孵育血液后检测到血红蛋白水平下降，该变化归因于血液在流动回路系统中的灌注过程（.......
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讨论
本方案介绍了一种在模拟人体血流的剪切流模型中，依据ISO 10993-4标准对接触血液的植入物进行血液相容性测试的全面且可靠的方法。该研究基于对激光切割神经血管植入物的测试，但该方法可适用于多种样品。结果表明，该方法能够广泛分析多项参数，包括血细胞计数、多种血液相容性标志物的表达水平，以及血液接触后对器械表面的显微观察。通过本方案，可检测不同器械在血液相容性方面的潜在差异。
体外血液相容性评估的一种替代方法是体内动物实验，后者存在多种缺点，例如由于组织损伤带来的强烈短期效应，可能导致装置相关效应的变异性更高且结果失真6。
在体外血液相容性测试中，现有三种模型：（1）静态血液孵育模型，（2）振荡血液孵育模型，以及（3）剪切流模型。静态模型通过将器械直接与血液孵育，提供了一种简单且快速评估血栓形成性的方法，但其仅能获得关于血液相容性的初步结果11。为克服静态模型的主要缺陷（即血细胞沉降和较大的空气接触表面积），可采用振荡血液孵育模型，该.......
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披露
作者无任何披露信息。
致谢
对于扫描电子显微镜实验，我们感谢图宾根大学医院医学材料科学与技术部门的 Ernst Schweizer。本研究由捷克共和国教育、青年和体育部在国家可持续发展计划 II（项目 BIOCEV-FAR LQ1604）框架内资助，并得到捷克科学基金会项目 No. 18-01163S 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 注射用水 | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| β-血小板球蛋白 ELISA 试剂盒 | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R 离心机 | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | - | |
| 枸橼酸钠单采血管（1.4 mL） | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD 单采血管（2.7 mL） | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA 单采血管（1.2 mL） | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| 乙醇 p.A.（1000 mL） | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| 戊二醛（25% 水溶液） | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| 试管肝素涂层 | Ension, Pittsburgh, USA | - | |
| 肝素钠（25,000 IE/5 mL） | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 多功能酶标仪 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | - | |
| 0.9% 氯化钠溶液 | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| 空白单采血管（9 mL） | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS 缓冲液（不含 Ca²⁺/Mg²⁺） | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| 蠕动泵 ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| 移液器（100 µL） | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| 移液器（1000 µL） | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| 塑料容器（100 mL） | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-弹性蛋白酶 ELISA 试剂盒 | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| 聚氯乙烯管 | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | - | |
| 反应管（1.5 mL） | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| 神经血管激光切割植入物 | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA 试剂盒 | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| 扫描电子显微镜 | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | - | |
| 密封膜（96 孔板用） | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| 注射器 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT 微量试剂盒 | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| 水浴锅 Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | - |
参考文献
- ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99(2018).
- Li, Y., Boraschi, D.
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重印与许可
