体内感染 Leishmania amazonensis 评估小鼠体内寄生虫毒力

摘要

此处，我们提供了一套整合的实验方案，用于评估小鼠皮肤感染情况 Leishmania amazonensis这是一种研究寄生虫毒力的可靠方法，可系统地观察脊椎动物宿主对感染的反应。

摘要

利什曼原虫 spp. 是引起利什曼病的原生动物寄生虫，该病临床表现多样，从皮肤型病变到内脏型病变不等。目前估计有1200万人感染 利什曼原虫 全球范围内，超过10亿人面临感染风险。 Leishmania amazonensis 在中美洲和南美洲呈地方性流行，通常导致皮肤型疾病，该类型可在动物模型中直接观察到。因此， L. amazonensis 菌株是皮肤利什曼病研究的良好模型，因为它们也易于在体外培养。C57BL/6小鼠可模拟 L. amazonensis驱动的疾病进展，被认为是研究皮肤利什曼病的最佳小鼠品系之一。在脊椎动物宿主体内，尽管巨噬细胞具有防御机制，这些寄生虫仍可在其内生存。已有许多研究采用体外巨噬细胞感染实验，以评估不同条件下寄生虫的感染能力。然而，体外方法仅限于孤立的细胞系统，忽略了整个机体的免疫应答。本文整合了一种体内小鼠感染方法，可系统性地反映宿主与寄生虫相互作用的生理状态。以下为C57BL/6小鼠体内感染的详细实验方案 L. amazonensis 包括寄生虫向感染性无鞭毛体的分化、小鼠足垫皮肤接种、病灶形成及寄生虫负荷量测定。我们推荐这一成熟的方法作为研究宿主对皮肤利什曼病免疫与代谢反应生理学的最适宜方法。

引言

利什曼病是全球流行的寄生虫性传染病，在发展中国家构成重要挑战，被世界卫生组织认定为最重要的被忽视热带病之一^1,2。利什曼病的临床表现包括皮肤型、黏膜型和/或内脏型。皮肤利什曼病通常由L. amazonensis、L. mexicana、L. braziliensis、L. guyanensis、L. major、L. tropica和L. aethiopica引起³。由于可诱导保护性细胞免疫反应，该病在人体中通常可自愈。然而，细胞免疫反应可能失效，导致疾病进展为播散性皮肤利什曼病^4,5。由于Leishmania物种的多样性以及宿主遗传背景的差异，目前尚无可用疫苗^6,7。治疗选择也十分有限，因为目前大多数可用药物价格昂贵、具有毒性，和/或需要长期治疗^8,9。此外，已有针对现有疗法产生耐药性的报道^10,11。

利什曼病的病原体是原生动物寄生虫Leishmania。该寄生虫在其生命周期中呈现两种不同的形态：前鞭毛体，即存在于白蛉体内的具鞭毛形式；以及无鞭毛体，即存在于哺乳动物宿主巨噬细胞内含寄生虫空泡中的细胞内形式^12,13。无鞭毛体能够在脊椎动物宿主巨噬细胞的防御机制下入侵、存活并复制的能力，已成为众多研究的主题^14,15,16,17。因此，多个研究团队已陆续报道了体外巨噬细胞感染实验，用于评估特定环境因素以及寄生虫和宿主基因对寄生虫感染能力的影响。该实验具有多项优势，例如可适应高通量研究模式、获得结果所需时间相对较短，以及减少实验动物的使用数量¹⁸。然而，体外实验的结果存在局限性，因其并不总能重现体内实验的结果^14,19,20,21。体内实验能够提供宿主-寄生虫相互作用的系统性生理全景，这是体外实验无法完全模拟的。例如，可通过采集的足垫组织切片或甚至腘窝淋巴结进行免疫组织化学实验，以分析回收的免疫细胞²²。

在生物和生物医学研究中，动物常被用作人类疾病的模型，以更好地理解这些疾病的潜在生理机制²³。以利什曼病为例，接种途径、接种部位或接种剂量均会影响疾病结局^24,25,26,27。此外，人类和小鼠对感染的易感性与抗性在很大程度上受到宿主和寄生虫遗传背景的调控^{4,5,22,28,29,30,31}。BALB/c小鼠对L. amazonensis引起的皮肤感染高度易感，表现为疾病迅速进展，并伴随寄生虫向淋巴结、脾脏和肝脏的播散³²。由于疾病可能发展为皮肤转移，感染可导致死亡。相比之下，C57BL/6小鼠在L. amazonensis感染实验中通常形成慢性病灶，并持续携带寄生虫³³。因此，利用该特定小鼠品系建立的L. amazonensis感染模型被认为是一种研究人类慢性皮肤利什曼病的优良模型，因其对疾病进展的模拟优于BALB/c小鼠感染模型^5,34。

因此，我们认为，小鼠体内感染是研究Leishmania毒力生理学并应用于人类疾病的一种有效方法，可系统性地揭示宿主与寄生虫之间的相互作用。通过对已有成熟检测方法²²的重新审视，本文提供了一套完整的、分步操作的C57BL/6小鼠体内感染L. amazonensis的实验方案，内容包括无鞭毛体体外分化、小鼠足垫皮肤接种、病损形成以及寄生虫负荷量的测定。该方案可适用于其他小鼠品系及引起皮肤利什曼病的其他Leishmania物种。总之，本文所述方法对于发现新的抗Leishmania药物靶点和疫苗，以及研究宿主对Leishmania感染的免疫与代谢反应的生理机制至关重要。

方案

所有实验操作均经圣保罗大学生物科学研究所动物护理与使用委员会批准（CEUA 342/2019），并遵循圣保罗州《实验动物护理与使用政策和建议》（州法 11.977，2005年8月25日）以及巴西政府相关规定（联邦法 11.794，2008年10月8日）。第1至第5节中所述的所有步骤均应在层流柜内以无菌方式操作。处理活体Leishmania寄生虫时应使用个人防护装备。

1. L. amazonensis 前鞭毛体在体外非寄生条件下向无鞭毛体的分化^{15,20,35,36,37,38}

注意：L. amazonensis（MHOM/BR/1973/M2269）（La）寄生虫用于本实验。根据研究目的的不同，感染性寄生虫形态可通过密度梯度法纯化前循环型获得，方法如前所述¹⁴，或通过将前鞭毛体体外分化为无菌型无鞭毛体，具体步骤如下。

1. 在含有 10 mL 无鞭毛体培养基（pro-medium，pH = 7.0）的 25 cm² 细胞培养瓶中培养 La 前鞭毛体。
2. 于 25 °C 培养 3 天。
   注意：使用体外传代少于 10 代的前鞭毛体培养物，以避免寄生虫毒力丧失及非整倍性变化^{39,40,41,42,43,44}。
3. 将 5 mL 对数生长期的前鞭毛体培养物移入一个新的 25 cm² 培养瓶中。
4. 加入 5 mL 无菌培养基（ama-medium，pH = 5.2）。
5. 于 34 °C 培养 3–4 天。
6. 按 1:3 的比例用 ama-medium 稀释培养物，并转移至新的 25 cm² 培养瓶中进行传代。
7. 于 34 °C 培养 3–5 天。
   注意：无菌培养的无鞭毛体最多培养 5 天，此时代表成熟阶段的结束³⁷。

2. C57BL/6 足垫感染 L. amazonensis

注意：实验所用雌性 C57BL/6 小鼠（6-8 周龄）购自圣保罗大学生物医学科学研究所动物中心，并在此中心饲养。动物可自由摄食和饮水。

1. 使用血细胞计数板（即Neubauer计数室），将溶于PBS中的无菌培养无鞭毛利什曼原虫悬液取适量稀释后进行计数。计数无鞭毛的虫体，即为无鞭毛体形态。
   注意：也可使用台盼蓝（1:1）对可存活无鞭毛体的数量进行计数（即未被台盼蓝染色的细胞）。
2. 根据所需的接种剂量和接种数量，用 PBS 稀释无菌无鞭毛体（1 × 10⁶ 建议使用50 µL PBS中的无菌无鞭毛体。
3. 用27 G针头的结核菌素注射器吸取制备好的寄生虫悬液。
4. 使用异氟烷（3-5%）麻醉C57BL/6小鼠，具体操作参照约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会的建议⁴⁵通过测试小鼠对脚趾夹捏的反应来评估麻醉深度。
5. 接种50 µL均质化的寄生虫悬液（1 x 10⁶ 使用预先装填好的结核菌素注射器（步骤 2.3），将无菌的无鞭毛体或所需接种剂量注入左后足垫的皮下组织。

3. 小鼠足垫病变发展

1. 每周使用游标卡尺测量一次左后足垫（感染侧）和右后足垫（非感染侧）的厚度，以评估病灶的进展情况。
2. 每周计算左后足垫与右后足垫厚度之间的差值，用于评价病灶的发展进程。
3. 将计算得到的差值绘于Y轴，感染时间绘于X轴，并进行统计学显著性分析。
   注意：根据动物护理与使用委员会的建议，必须在感染病灶发生溃疡前处死动物，因为皮肤溃疡可能导致继发性感染。如补充图1所示，在本实验所用的寄生虫剂量（10⁶ 无菌无鞭毛体）和宿主品系（C57BL/6）条件下，病灶出现溃疡征象约需10周时间。因此，应在观察到溃疡征象之前对小鼠实施安乐死并取出病灶组织。

4. 小鼠足垫病灶提取与寄生虫限稀释法

1. 为有限稀释实验准备一个96孔板（平底）^46,47 通过向所有孔中加入 180 µL 前体培养基。
   注意：每只动物使用四孔（即半块板），代表四次重复检测（例如，动物1 = A-D孔；动物2 = E-H孔）。
2. 每处病灶加入1 mL预培养基至玻璃组织研磨管中，并称量管重。
   注意：试管必须保持无菌，因此若在超净工作台外进行称重，应使用无菌盖子，并连同盖子一起称量。
3. 用 CO₂ 处死动物₂ 按照动物护理与使用委员会的建议，将动物放入隔离室。用70%乙醇喷洒对动物进行消毒。
4. 在脚跟处切除动物的足部以取出感染的足垫，并用70%乙醇喷洒足垫进行消毒。通过将剪刀和镊子浸泡在70%乙醇中，确保其灭菌。
5. 将受感染的足垫置于无菌培养皿中，使用无菌镊子和手术刀进行解剖，收集所有软组织，弃去骨骼。
   注意：建议在解剖步骤中保持操作的一致性，以避免组织回收出现偏差。
6. 将收集的组织转移至含有前体培养基的玻璃组织研磨管中，再次称量试管重量以确定病灶组织重量。
   注意：避免将镊子和手术刀直接放入培养基中，以免带出少量培养基，导致组织重量被低估。病灶组织的重量通过以下方式计算：用含有预培养基及所收集组织的试管重量减去仅含预培养基的试管重量。
7. 使用研磨器对组织进行10次匀浆，以实现完全的组织破碎。
8. 静置混合物10分钟，然后收集20 µL上清液。
9. 在1中加入20 µL上清液^st 1 的列^st 步骤4.1中准备的96孔板的孔中。对接下来的三个孔重复此操作，使每只动物有四个复孔（例如，对于动物1，向每个孔中加入20 µL，并标记为A1、B1、C1和D1）。
10. 将96孔板中的每个孔充分匀浆^st 使用多通道移液器将稀释后的样品从第1列转移20 µL至第10列。然后，从第1列的稀释样品中转移20 µL^st 柱至第2^nd 柱
    注意：必须将每一列到下一列的每个孔充分混匀10次。
11. 重复步骤 4.10 至所有剩余的列，直至最后一列（12）^th）并弃去稀释后样品的最后20 µL。
    注意：每次稀释后均需更换枪头，以避免交叉污染。
12. 用封板膜密封，在25 °C的湿盒中孵育7天。

5. 病变部位寄生虫负荷测定

1. 使用倒置显微镜在培养7天后分析培养板，确定每道中最后一个含有寄生虫的孔。
   注意：通过目视观察培养基颜色变化和浑浊度，也可对寄生虫生长情况或细胞密度作出初步判断。
2. 通过将稀释倍数除以病灶重量，计算每道的寄生虫组织负荷量。
   注意：在某一特定道中，若寄生虫仅存在于第1至第5列（即A1-A5孔显示寄生虫生长阳性），则表明第5列每孔含有1个寄生虫，第4列每孔含有10个寄生虫，依此类推，以十倍递增。第1列每孔含有10⁴个寄生虫，代表初始20 µL上清液（步骤4.7中的未稀释样品）中的寄生虫数量。由于这20 µL已与180 µL前体培养基混合稀释，因此初始管中的寄生虫总数为5 × 10⁵个：(1 × 10⁴) / (0.02 mL) = 5 × 10⁵ 个/1 mL。随后，可通过将初始寄生虫浓度除以病灶重量，计算该病灶的寄生虫负荷量：(5 × 10⁵) / 病灶重量（见步骤4.6）。
3. 以对数Y轴绘制每只动物四重复实验结果的平均值。

6. 统计分析

1. 使用每实验组至少五只动物作为重复，以平均值 ± 标准差表示数据。
2. 采用非配对双尾检验进行统计分析，以 p 值 < 0.05 为差异具有显著性。

结果

Leishmania 原虫寄生虫在其无脊椎动物和脊椎动物宿主中的生活史中存在两种发育形态：前鞭毛体（promastigotes），即存在于雌性白蛉肠腔内的增殖形态；以及无鞭毛体（amastigotes），即存在于哺乳动物宿主细胞内含虫空泡中的增殖形态。前鞭毛体具有长约20 µm、宽约1.5 µm的细长体形，通常从其前端伸出一根鞭毛。无鞭毛体呈圆形或卵圆形，大小范围为长2–6 µm、宽1.5–3 µm，具有一根不明显的鞭毛^12,13（图1A）。当无脊椎宿主（属于 Psychodidae 科的吸血昆虫）吸血时，会摄入含有 Leishmania 无鞭毛体的巨噬细胞。一旦这些细胞进入白蛉的消化道，无鞭毛体即被释放，并分化为前循环前鞭毛体（procyclic promastigotes）（图1

讨论

本方案中描述的体内感染实验可使任何研究人员在系统性情境下，结合宿主与寄生虫的相互作用，评估体内皮肤利什曼病。许多研究团队已采用过此类实验^{22,24,27,29,31,32,34,49}，本文在此整合了一套标准化的分步操作流程，同时考虑了部分研究团队可能面临的基础设施限制。该方案还可用于通过体内生物成像技术评估转基因Leishmania寄生虫的毒力^50,51,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	Greiner bio-one	655180	用于有限稀释实验的平底板
腺嘌呤	Sigma	A8626	添加至M199细胞培养基中的补充剂
卡尺	Mitutoyo	700-118-20	用于测量足垫厚度的卡尺
细胞培养瓶	Corning	353014	体积为25 cm2的细胞培养瓶，用于培养利什曼原虫
离心机	Eppendorf	5804R	用于根据密度分离样品的设备
CO2 培养箱 34 °C	Thermo Scientific	3110	用于无鞭毛体分化的培养箱
乙醇	Merck	K50237083820	用于一般物品的消毒剂
胎牛血清	Gibco	12657-029	添加至M199细胞培养基中的补充剂
玻璃组织研磨管	Thomas Scientific	3431 E04	用于收集并破碎感染足垫组织的管子
葡萄糖	Synth	G1008.01.AH	添加至M199细胞培养基中的补充剂
GraphPad Prism 软件	GraphPad		用于绘制数据图表并计算统计学显著性的软件
血红素	Sigma	H-2250	添加至M199细胞培养基中的补充剂
HEPES	Promega	H5303	添加至M199细胞培养基中的补充剂
培养箱 25 °C	Fanem	347CD	用于前鞭毛体培养的培养箱
倒置显微镜	Nikon	TMS	用于直观分析前鞭毛体和无鞭毛体培养物的设备
异氟烷			用于小鼠的吸入性麻醉剂（3-5%）
层流柜	Veco	VLFS-09	用于无菌操作区域的生物安全柜
M199细胞培养基	Gibco	31100-035	用于利什曼原虫培养的细胞培养基
微量离心管	Axygen	MCT150C	用于样品收集、处理和储存的微量管
多通道移液器	Labsystems	F61978	用于有限稀释实验的多通道移液器
NaHCO3	Merck	6329	添加至M199细胞培养基中的补充剂
NaOH	Sigma	S8045	添加至M199细胞培养基中的补充剂
血球计数板	HBG	2266	用于计数寄生虫悬液的血细胞计数器
光学显微镜	Nikon	E200	用于计数寄生虫的光学设备
封口膜	Bemis	349	一种柔韧且耐久的塑料膜，用于密封培养板
青霉素/链霉素	Gibco	15140122	添加至M199细胞培养基中的补充剂
培养皿	TPP	93100	用于解剖足垫组织的无菌培养皿
移液器套装	Gilson	F167360	包含四支移液器（P2、P20、P200、P1000）的微量移液器套装
电子天平	Quimis	BG2000	用于称量采集的足垫病灶组织的设备
手术刀	Solidor	10237580026	用于切割和采集足垫组织的手术刀
10 mL 血清移液管	Nest	327001	用于转移毫升体积液体的无菌移液管
移液枪头	Axygen		用于转移微升级别液体的移液器枪头
台盼蓝	Gibco	15250-061	用于计数活寄生虫的染料
胰蛋白胨	Merck		添加至M199细胞培养基中的补充剂
结核菌素注射器	BD	305945	带有27G针头的注射器，用于接种寄生虫悬液