体内感染 Leishmania amazonensis 评估小鼠体内寄生虫毒力

摘要

此处，我们提供了一套整合的实验方案，用于评估小鼠皮肤感染情况 Leishmania amazonensis这是一种研究寄生虫毒力的可靠方法，可系统地观察脊椎动物宿主对感染的反应。

摘要

利什曼原虫 spp. 是引起利什曼病的原生动物寄生虫，该病临床表现多样，从皮肤型病变到内脏型病变不等。目前估计有1200万人感染 利什曼原虫 全球范围内，超过10亿人面临感染风险。 Leishmania amazonensis 在中美洲和南美洲呈地方性流行，通常导致皮肤型疾病，该类型可在动物模型中直接观察到。因此， L. amazonensis 菌株是皮肤利什曼病研究的良好模型，因为它们也易于在体外培养。C57BL/6小鼠可模拟 L. amazonensis驱动的疾病进展，被认为是研究皮肤利什曼病的最佳小鼠品系之一。在脊椎动物宿主体内，尽管巨噬细胞具有防御机制，这些寄生虫仍可在其内生存。已有许多研究采用体外巨噬细胞感染实验，以评估不同条件下寄生虫的感染能力。然而，体外方法仅限于孤立的细胞系统，忽略了整个机体的免疫应答。本文整合了一种体内小鼠感染方法，可系统性地反映宿主与寄生虫相互作用的生理状态。以下为C57BL/6小鼠体内感染的详细实验方案 L. amazonensis 包括寄生虫向感染性无鞭毛体的分化、小鼠足垫皮肤接种、病灶形成及寄生虫负荷量测定。我们推荐这一成熟的方法作为研究宿主对皮肤利什曼病免疫与代谢反应生理学的最适宜方法。

引言

利什曼病是全球流行的寄生虫性传染病，在发展中国家构成重要挑战，被世界卫生组织认定为最重要的被忽视热带病之一^1,2。利什曼病的临床表现包括皮肤型、黏膜型和/或内脏型。皮肤利什曼病通常由L. amazonensis、L. mexicana、L. braziliensis、L. guyanensis、L. major、L. tropica和L. aethiopica引起³。由于可诱导保护性细胞免疫反应，该病在人体中通常可自愈。然而，细胞免疫反应可能失效，导致疾病进展为播散性皮肤利什曼病^4,5。由于Leishmania物种的多样性以及宿主遗传背景的差异，目前尚无可用疫苗^6,7。治疗选择也十分有限，因为目前大多数可用药物价格昂贵、具有毒性，和/或需要长期治疗^8,9。此外，已有针对现有疗法产....

方案

所有实验操作均经圣保罗大学生物科学研究所动物护理与使用委员会批准（CEUA 342/2019），并遵循圣保罗州《实验动物护理与使用政策和建议》（州法 11.977，2005年8月25日）以及巴西政府相关规定（联邦法 11.794，2008年10月8日）。第1至第5节中所述的所有步骤均应在层流柜内以无菌方式操作。处理活体Leishmania寄生虫时应使用个人防护装备。

1. L. amazonensis 前鞭毛体在体外非寄生条件下向无鞭毛体的分化^{15,20,35,36,37,38}

注意：L. amazonensis（MHOM/BR/1973/M2269）（La）寄生虫用于本实验。根据研究目的的不同，感染性寄生虫形态可通过密度梯度法纯化前循环型获得，方法如前所述¹⁴，或通过将前鞭毛体体外分化为无菌型无鞭毛体，具体步骤如下....

结果

Leishmania 原虫寄生虫在其无脊椎动物和脊椎动物宿主中的生活史中存在两种发育形态：前鞭毛体（promastigotes），即存在于雌性白蛉肠腔内的增殖形态；以及无鞭毛体（amastigotes），即存在于哺乳动物宿主细胞内含虫空泡中的增殖形态。前鞭毛体具有长约20 µm、宽约1.5 µm的细长体形，通常从其前端伸出一根鞭毛。无鞭毛体呈圆形或卵圆形，大小范围为长2–6 µm、宽1.5–3 µm，具有一根不明显的鞭毛^12,13（图1A）。当无脊椎宿主（属于 Psychodidae 科的吸血昆虫）吸血时，会摄入含有 Leishmania 无鞭毛体的巨噬细胞。一旦这些细胞进入白蛉的消化道，无鞭毛体即被释放，并分化为前循环前鞭毛体（procyclic promastigotes）（图1

讨论

本方案中描述的体内感染实验可使任何研究人员在系统性情境下，结合宿主与寄生虫的相互作用，评估体内皮肤利什曼病。许多研究团队已采用过此类实验^{22,24,27,29,31,32,34,49}，本文在此整合了一套标准化的分步操作流程，同时考虑了部分研究团队可能面临的基础设施限制。该方案还可用于通过体内生物成像技术评估转基因Leishmania寄生虫的毒力^50,51,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	Greiner bio-one	655180	用于有限稀释实验的平底板
腺嘌呤	Sigma	A8626	添加至M199细胞培养基中的补充剂
卡尺	Mitutoyo	700-118-20	用于测量足垫厚度的卡尺
细胞培养瓶	Corning	353014	体积为25 cm2的细胞培养瓶，用于培养利什曼原虫
离心机	Eppendorf	5804R	用于根据密度分离样品的设备
CO2 培养箱 34 °C	Thermo Scientific	3110	用于无鞭毛体分化的培养箱
乙醇	Merck	K50237083820	用于一般物品的消毒剂
胎牛血清	Gibco	12657-029	添加至M199细胞培养基中的补充剂
玻璃组织研磨管	Thomas Scientific	3431 E04	用于收集并破碎感染足垫组织的管子
葡萄糖	Synth	G1008.01.AH	添加至M199细胞培养基中的补充剂
GraphPad Prism 软件	GraphPad		用于绘制数据图表并计算统计学显著性的软件
血红素	Sigma	H-2250	添加至M199细胞培养基中的补充剂
HEPES	Promega	H5303	添加至M199细胞培养基中的补充剂
培养箱 25 °C	Fanem	347CD	用于前鞭毛体培养的培养箱
倒置显微镜	Nikon	TMS	用于直观分析前鞭毛体和无鞭毛体培养物的设备
异氟烷			用于小鼠的吸入性麻醉剂（3-5%）
层流柜	Veco	VLFS-09	用于无菌操作区域的生物安全柜
M199细胞培养基	Gibco	31100-035	用于利什曼原虫培养的细胞培养基
微量离心管	Axygen	MCT150C	用于样品收集、处理和储存的微量管
多通道移液器	Labsystems	F61978	用于有限稀释实验的多通道移液器
NaHCO3	Merck	6329	添加至M199细胞培养基中的补充剂
NaOH	Sigma	S8045	添加至M199细胞培养基中的补充剂
血球计数板	HBG	2266	用于计数寄生虫悬液的血细胞计数器
光学显微镜	Nikon	E200	用于计数寄生虫的光学设备
封口膜	Bemis	349	一种柔韧且耐久的塑料膜，用于密封培养板
青霉素/链霉素	Gibco	15140122	添加至M199细胞培养基中的补充剂
培养皿	TPP	93100	用于解剖足垫组织的无菌培养皿
移液器套装	Gilson	F167360	包含四支移液器（P2、P20、P200、P1000）的微量移液器套装
电子天平	Quimis	BG2000	用于称量采集的足垫病灶组织的设备
手术刀	Solidor	10237580026	用于切割和采集足垫组织的手术刀
10 mL 血清移液管	Nest	327001	用于转移毫升体积液体的无菌移液管
移液枪头	Axygen		用于转移微升级别液体的移液器枪头
台盼蓝	Gibco	15250-061	用于计数活寄生虫的染料
胰蛋白胨	Merck		添加至M199细胞培养基中的补充剂
结核菌素注射器	BD	305945	带有27G针头的注射器，用于接种寄生虫悬液