本方案描述了原位胰腺肿瘤的手术建立方法以及新鲜分离的小鼠胰腺肿瘤的快速消化过程。消化后，可获取具有活性的免疫细胞群体，用于后续分析，包括 离体 通过流式细胞术检测细胞内细胞因子的T细胞刺激。
本文内容
摘要
摘要
体内胰腺癌模型为研究疾病动态、免疫细胞浸润以及新的治疗策略提供了不可估量的工具。原位小鼠模型可同时在大量免疫功能健全的小鼠中进行，成本相对较低，并能保留相应的组织微环境。对原位肿瘤内T细胞浸润程度及细胞毒性活性的定量分析，可作为评估抗肿瘤免疫反应的有效指标。
本方案描述了通过将少量重悬于5 µL基底膜中的同源肿瘤细胞直接注射到胰腺内，以手术方式构建原位胰腺肿瘤的方法。携带原位肿瘤的小鼠大约需要30天达到实验终点，此时可收获肿瘤并进行处理，以表征肿瘤浸润性T细胞的活性。利用胶原酶和DNase进行快速酶消化，可从肿瘤组织中获得单细胞悬液。所提取肿瘤内免疫细胞的存活率和细胞表面标志物均得以良好保存，因此适用于多种下游应用，包括流式辅助的免疫细胞分选用于培养或RNA提取，以及免疫细胞群体的流式细胞术分析。本文中，我们描述了T细胞群体的体外（ex vivo）刺激方法，通过检测细胞内细胞因子（IFNγ和TNFα）的产生以及脱颗粒活性（CD107a）来评估其总体细胞毒性。将整块肿瘤消化所得细胞用佛波酯（phorbol myristate acetate）和离子霉素（ionomycin）刺激5小时，并在抗-CD107a抗体存在下促进细胞因子产生和脱颗粒。在最后4小时加入布雷菲德菌素A（brefeldin A）和莫能菌素（monensin），以阻断胞外运输并最大化细胞内细胞因子的检出。随后对细胞进行胞外和胞内染色，用于流式细胞术分析，定量检测IFNγ+、TNFα+以及CD107a+的CD4+和CD8+ T细胞的比例。
该方法为全面分析肿瘤微环境提供了基础起点。
引言
该方法详细描述了从头到尾的手术流程，用于利用极少量细胞材料建立原位胰腺肿瘤，并对已形成的肿瘤进行快速解离，以全面开展流式细胞术分析肿瘤内免疫细胞群体，包括 离体 T细胞功能分析
胰腺导管腺癌（PDAC）是一种侵袭性极强的癌瘤，仅有8%的患者能够存活5年1。由于不到20%的患者适合接受手术切除2，可用于研究的新鲜患者样本难以获取，因此体内模型成为研究该疾病的重要工具。目前已有多种小鼠PDAC模型：原位移植、皮下移植、转基因、静脉注射以及患者来源的异种移植（PDX）模型，这些模型在此处已有广泛描述3。本文所述的原位模型允许将同源PDAC细胞注射到免疫功能健全小鼠的胰腺中。该模型可在大量野生型或突变型小鼠中实施，因而为治疗药物的比较提供了成本较低且结果一致的实验体系。重要的是，原位模型为肿瘤细胞生长提供了相应的微环境，并且在本实验室及其他实验室的研究中均能向临床相关部位（如肝脏）发生转移4，因此相较于皮下移植或化学诱导模型，其临床相关性更高。原位肿瘤表现出PDAC的关键特征，例如强烈的促结缔组织增生反应，伴有大量成纤维细胞浸润和细胞外基质沉积5。转基因PDAC模型是小鼠模型中的金标准，其中最常用的是KPC模型，该模型在胰腺特异性Pdx-1-Cre启动子驱动下表达突变型KrasG12D/+和Trp53R172H/+6。其他KPC及多种体内PDAC模型在此处已有综述7。KPC小鼠可自发形成胰腺肿瘤，其疾病进展过程高度模拟人类PDAC的特征6。然而，与其他所有转基因模型一样，其繁育成本较高，肿瘤进展存在变异性，因此通常需要使用大量小鼠。PDX模型采用患者来源的肿瘤细胞或组织碎片，将其在免疫缺陷小鼠体内进行原位或更常见的皮下移植生长。异种移植模型在治疗化合物筛选方面具有实用价值，并能反映患者的异质性。但其缺乏完整的免疫微环境，从而限制了其应用范围8,9。
一旦建立，原位肿瘤通常需要大约1个月或更长时间生长（具体时间取决于所使用的细胞系），并形成较大的肿瘤，可通过超声或磁共振成像（MRI）轻松观察，以追踪肿瘤进展并评估治疗效果4,5,10。然而，一旦进入指数生长期，肿瘤生长的最后阶段可能非常迅速，因此大多数治疗方案通常在较早阶段即开始（例如第14天）11,12。免疫系统在肿瘤发生发展中起着关键作用，胰腺导管腺癌（PDAC）即为一例，其特征是存在免疫抑制性的肿瘤浸润，T细胞相对稀少，而髓系细胞则频繁出现13。PDAC中T细胞浸润程度较高通常提示预后较好14,15。然而，作为单一制剂，能够解除T细胞免疫抑制的免疫检查点抑制剂（如抗CTLA-416和抗PD-L117）在PDAC患者中尚未显示出临床获益，这很可能是因为整体T细胞反应性极低。然而，能够启动T细胞应答的制剂（如抗CD40抗体）可克服对抗PD-L1/CTLA-4治疗的耐药性18,19，而使用分泌GM-CSF的同种异体PDAC疫苗（GVAX）进行接种则可增强PDAC肿瘤的免疫原性20，表明增强T细胞应答是一条重要的治疗途径。
抗肿瘤T细胞反应的关键在于T细胞受体（TCR）对肿瘤来源抗原的识别，以及随后细胞毒性细胞因子和颗粒的产生。尽管可通过TCR测序来确定T细胞对抗原的识别情况，但该方法成本高且耗时。然而，对肿瘤浸润性T细胞亚群的定量分析可有效反映抗肿瘤免疫反应的程度。进一步评估T细胞活性 离体 在脱颗粒、细胞因子产生及其他细胞毒性因子方面提供更深入的功能分析。这些检测可在新鲜肿瘤样本上进行，并可通过流式细胞术快速测量T细胞功能的多个参数。
CD8+ 和 CD4+ T 细胞可产生如 IFNγ 和 TNFα 等细胞因子，以增强免疫应答21。IFNɣ 可诱导靶细胞上 MHCI 的上调，促进免疫细胞的分化与募集，并促进细胞死亡。CD8+ T 细胞分泌 IFNγ 已被充分证实是抗肿瘤免疫应答的一部分，并与肿瘤消退相关22,23。TNFα 是另一种由 CD8+ 和 CD4+ T 细胞产生的促炎性细胞因子，它可增强 TCR 依赖性的 T 细胞活化及其增殖，从而促进抗肿瘤免疫应答。在 TCR 被激活后，细胞毒性 CD8+ T 细胞可发生脱颗粒过程，即含有细胞毒性分子的预先形成的分泌性溶酶体被释放至免疫突触中，导致靶细胞的降解21。这些分子包括穿孔素（Perforin），该蛋白可结合靶细胞膜并形成孔道，破坏膜的完整性，从而促进其他细胞毒性分子（如颗粒酶 B）向靶细胞胞质的扩散21 或内吞24。颗粒酶 B 是一种蛋白酶，可介导靶细胞内多种蛋白的降解，最终导致细胞死亡21。这些分子的释放依赖于内体向细胞表面的胞吐作用，此过程中内体标志物 CD107a（亦称 LAMP-1）会短暂地整合入细胞膜中25。
检测T细胞分泌细胞因子需要通过流式辅助细胞分选或磁珠分离法对其进行分离，而这些方法难以同时处理大量样本。然而，细胞内细胞因子的检测无需预先分离细胞，可同时对多个样本进行操作，从而实现高通量分析。由于T细胞会迅速分泌细胞因子，其细胞内水平可能极低而无法检测，因此需要对T细胞进行刺激以提高基础细胞因子的产生。为了评估抗原驱动的细胞因子生成，必须在体外通过活化的抗原呈递细胞（APC）向T细胞呈递T细胞受体（TCR）所识别的抗原。当抗原特异性未知时，则需要采用广谱刺激策略。可通过抗CD3/CD28磁珠模拟TCR刺激，该方法可同时提供TCR激活信号和共刺激信号，从而诱导细胞因子产生和细胞增殖。然而，更经济有效的替代方法是使用佛波酯（PMA）和离子霉素（ionomycin），二者共同激活广泛的信号通路，促进细胞内细胞因子的合成与释放。具体而言，PMA激活蛋白激酶C（PKC），而离子霉素提高细胞内Ca2+浓度，从而增强细胞内信号传导。为了保留细胞内细胞因子含量，可在刺激过程中联合使用蛋白质转运抑制剂布雷菲德菌素A（brefeldin A）和莫能菌素（monensin），它们可阻断蛋白质在高尔基体中的转运，防止细胞因子释放到胞外。PMA/离子霉素刺激T细胞是一种成熟可靠的方法，细胞外释放的细胞因子与细胞内检测到的细胞因子水平之间具有高度相关性26。使用PMA和离子霉素刺激T细胞还可促进溶酶体向细胞膜的转运，从而使CD107a短暂地整合至细胞表面，随后被回收进入细胞内部。在刺激过程中加入抗CD107a抗体，即可将其作为脱颗粒活性的标志物进行检测25。
该方法可快速消化肿瘤组织，获得单细胞悬液。此时，可直接对单个细胞群体进行染色以用于流式细胞术分析，或通过后续方法进行纯化：流式细胞分选或磁珠分离。制备用于流式细胞术分析的单细胞悬液，可实现对多种免疫细胞群体及其表型标志物的高通量分析，从而准确定量免疫细胞的数量和表型。
最后，本文所述的消化方案可防止细胞表面标志物的丢失，并维持免疫细胞的活性，从而允许免疫细胞根据需要进行进一步的细胞纯化步骤和培养。然而，该方法尚未经过验证是否可用于从该消化过程中获取上皮细胞。
方案
原位胰腺肿瘤的构建方法如前所述10，并严格遵循英国动物实验与科学程序法案（U.K. Home Office Animal and Scientific Procedures Act 1986）以及欧盟指令2010/63/EU。所有小鼠在围手术期均需监测疼痛或痛苦的迹象，包括但不限于体重减轻（> 72小时内超过15%或任何时间段内超过20%）、毛发竖立、眼裂变窄、步态抬高、蜷缩姿态，以及伤口感染的征象，如出血、红肿和溃疡。通过触诊监测肿瘤生长情况，同时监测呼吸困难、黄疸和四肢发冷等其他临床症状，以评估是否已达到实验终点。所有操作均应在无菌条件下进行。用于流式细胞术染色前的所有试剂也须在无菌条件下配制。
1. 注射用肿瘤细胞的制备
- 从-20 °C取出一份基底膜，置于冰上并在4 °C过夜。
注意：基底膜浓度可能因批次而异；因此，必须对特定批次的基底膜进行测试 体内 为确保可重复性，将新的一批基底膜置于冰上，在4°C过夜解冻，然后在冰上按用户自定义的分装量进行分装，并于-20°C保存备用。此方法可最大限度减少使用基底膜时的移液操作以及冻融次数。- 将无菌 PBS 置于 4 °C 冰箱中过夜预冷。
- 将无菌的 200 µL 和 1000 µL 移液器吸头置于 -20 °C 冰箱中过夜预冷。
- 使用无支原体污染的肿瘤细胞，在冻存复苏后至少传代2-10代，并在收获前处于对数生长期。本实验方案采用雌性小鼠C57BL/6 KPC来源的细胞系TB32048，由David Tuveson实验室惠赠。
- 当需要收获肿瘤细胞时，从培养瓶中移除培养基，并用预热至 37 °C 的 PBS 洗涤细胞两次。
- 向培养瓶中加入预热至37 °C的2倍体积胰蛋白酶，在37 °C孵育10分钟（对于T175培养瓶，加入5 mL）。
- 10分钟后，向培养瓶中加入等体积的完全培养基（含10% FBS、1×青霉素、1×链霉素的DMEM），轻轻敲击培养瓶使细胞解离，并充分重悬于培养基中。
- 将细胞转移至离心管中，在300 x g条件下离心5分钟 g 以及室温（RT）。
- 吸除上清液，用完全培养基重悬细胞以进行细胞计数。
- 再次以 300 x g 离心细胞 5 分钟 g 以及室温孵育，并移除上清液。
- 在预冷的 PBS 中重悬细胞，调整细胞浓度至 1×10⁶ 个/mL6 cells/mL
注意：该储备浓度的制备旨在实现每5 µl注射液中含有1000个细胞的终浓度。我们发现，以较低注射体积注入较少数量的细胞可最大限度减少细胞渗漏，从而提高实验重复性；然而，肿瘤生长可能依赖于细胞系，因此使用者应对每种细胞系进行优化。
- 同时，将一份预先分装的基底膜提取物置于冰上，并放入生物安全柜中。
- 用于注射的基底膜终溶液、PBS 和 PBS 中的肿瘤细胞的比例为 5:3:2。因此，使用预冷的 1000 µL 移液枪头，向 500 µL 基底膜中加入 300 µL 预冷的 PBS。
- 将 PBS 直接加入基底膜等分试样中，以尽量减少移液操作。
- 保持移液器设定在300 µL，重悬PBS和基底膜，确保将离心管置于冰上以维持基底膜的液态。
- 当完成从p1000枪头中推出所有基底膜成分后，将枪头保留在管内，使任何残留的基底膜/PBS液体顺枪头流下。
- 5–10 分钟后，将更多基底膜从 p1000 枪头中排出，返回至管中，并将管置于冰上静置。
- 取200 µL用PBS重悬的肿瘤细胞，使用预冷的200 µL枪头直接加入基底膜中。
- 取一个新的预冷p1000移液枪吸头，将移液枪体积调至300 µL，上下吹打重悬30–40次。建议使用较大的吸头并在较低体积下操作，因为基底膜在重悬过程中可能随吸头上升并接触移液枪吸头滤膜。
- 肿瘤细胞已准备好用于注射。手术期间，将肿瘤细胞/基底膜置于冰上保存。
2. 肿瘤细胞的原位注射
- 将小鼠在动物实验室内适应性饲养7天。
- 手术前约2小时，剃除左侧腹部和背部的毛发，然后在颈背部皮下注射术前镇痛药（每千克体重50-100 µg的丁丙诺啡）。
- 准备手术区域，放置加热垫用于安放小鼠，并用手术巾覆盖周围设备及小鼠。对所有手术器械进行灭菌，并为每只小鼠准备足够套数的器械。
- 将小鼠置于含5%异氟烷的氧气中2 直至失去意识。
- 将小鼠仰卧置于加热垫上，并通过面罩维持麻醉，通常使用较低浓度的异氟烷（2-3%）。
- 确认深度麻醉状态，表现为夹捏后肢足垫时屈足反射消失，且呼吸频率保持稳定。
- 用手术巾覆盖小鼠身体，仅暴露已剃毛的区域。确保小鼠牢固地置于麻醉面罩中。
- 使用无菌棉签，将碘溶液以同心圆方式从剃毛区域的中心向外周涂抹。更换新的棉签和碘溶液，重复此过程一次。
- 使用手术刀在胰腺/脾脏位置（左上象限）正上方做一道1 cm的切口。如需要，也可使用无菌剪刀进行切口。
- 用镊子将皮肤拉开。换用新的镊子，找到腹膜壁，用剪刀在腹膜壁上再剪开一个1厘米的切口。
- 使用第二把镊子从体内取出可能连带脾脏的胰腺。
- 轻轻翻转肿瘤细胞/基底膜小瓶数次以混匀。
- 用玻璃注射器准备含有1,000个肿瘤细胞的基底膜成分，总体积为5 µL，并将其置于加热垫上数秒以使其升温。
注意：短暂加热注射器可使基底膜开始凝固，从而更易于注射且防止泄漏。然而，加热时间必须短暂，若放置过久，基底膜将完全凝固而无法注射。使用玻璃注射器可实现微量液体的精确注射。 - 握住胰腺尾部以将其拉直，将针头直接插入胰腺中心，针头方向与胰腺走向平行，注意避开可见的血管。
注意：胰腺中心区域较大，最易于注射。然而，如有需要，也可选择性地注射胰腺头部或尾部。 - 缓慢注入5 µL基底膜至胰腺中，注射后将针头在胰腺内保持静止至少30秒，以使基底膜充分凝固并防止泄漏。基底膜应可见为形成的小透明泡；但有时可能不可见。
注意：可注射更大体积的肿瘤细胞/基底膜；但必须预先测试确切体积，以确保不会发生渗漏。 - 将针头从胰腺移除，等待以确认无出血发生。轻柔地将胰腺重新放回腹腔内，注意避免触碰基底膜气泡。
- 将腹壁拉拢，行单个缝合，必要时可做两个间断缝合。
- 将皮肤切口两侧拉拢，根据需要进行多个间断缝合，或放置两个外科缝合夹。
- 在颈背部皮下再次注射一次丁丙诺啡。
- 将小鼠转移至预热至37 °C的笼子中，术后至少保温30分钟，以维持体温，然后再转移至新的笼子中。
- 准备笼内可获取的糊状饮食，以确保动物充分补水并维持体重。
- 根据建议重新给予术后镇痛药物，并密切观察伤口裂开、疼痛、感染及体重下降的迹象。若使用手术缝合钉，可在术后7-10天使用取钉器拆除。
- 大约14天后，瘢痕组织将充分愈合，可开始触诊腹部。通过触诊密切监测肿瘤大小，直至小鼠达到实验终点。
- 实验终点时，通过颈椎脱位法处死小鼠，随后进行断头。使用剪刀切开皮肤和腹膜腔，用镊子夹住胰腺肿瘤，剪刀剥离周围组织，将肿瘤切除。
3. 胰腺肿瘤的消化
- 将解剖获得的胰腺肿瘤、转移灶肿瘤或健康的胰腺组织置于预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并置于冰上保存。
- 使用镊子将肿瘤转移至培养皿中。
- 向50 mL离心管中加入5.0 mL消化液（2 mg/mL胶原酶，0.025 mg/mL DNase RPMI），并置于冰上以防止酶活性提前启动。
注：本方案使用V型胶原酶，其活性为≥1单位/mg FALGPA且>125胶原消化单位（CDU）/mg固体。胶原酶和DNase分装后可于-20 °C保存，使用前在冰上解冻。两者完全溶于无菌RPMI培养基后，可通过0.2 µm滤器去除污染物。过滤前必须确保胶原酶完全溶解，以避免材料损失。 - 取少量该溶液覆盖培养皿中的肿瘤组织。
- 使用无菌手术刀和镊子将肿瘤切成小块，每块长度约小于3 mm。
- 用刮刀将肿瘤碎片刮入离心管中，并轻轻颠倒混匀，直至所有组织块均浸没于消化液中。若需批量处理其他肿瘤样本，可暂时置于冰上保存。
- 将离心管置于摇床上，在37 °C孵育20分钟。确保所有肿瘤组织块均浸没于液体中，未粘附在管壁边缘。若无法摇动，则每5分钟涡旋震荡一次以促进消化。
4. 消化后肿瘤组织单细胞悬液的制备
- 消化步骤完成后，立即将离心管置于冰上以减缓酶活性。
- 加入EDTA，使其终浓度达到20 mM，并短暂涡旋混匀。这将进一步减缓酶活性。
- 打开管盖，用新鲜的RPMI培养基冲洗管盖内壁，以去除残留的肿瘤消化物。
- 在冰上将一个70 µm细胞筛置于50 mL开口离心管上（可根据需要调整细胞筛的µm规格）。
- 用培养基预先润湿滤膜。
- 使用25 mL移液管或更大规格的移液管重悬消化后的细胞，并冲洗管壁。移液管的宽口设计对于顺利转移黏稠的消化液至关重要。
- 使用25 mL移液管将全部消化液转移至细胞筛上。
- 使用1 mL注射器活塞在滤膜表面碾压肿瘤组织。仅进行垂直上下碾压，以尽量减少对细胞的剪切力损伤。
- 持续用RPMI培养基冲洗，使细胞通过滤膜。确保施加足够的冲洗力度以推动细胞通过筛网。
- 若仍有组织残留需要碾压，但RPMI无法继续流过滤网，则表明滤网已饱和。此时应将样品转移至新的滤网中并继续操作。
注：最终仅细胞外基质成分会留在滤膜上，所有单细胞均应已通过滤网。
- 在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。
- 小心地用完全RPMI培养基重悬细胞沉淀，并直接通过另一个滤网，以去除任何无法充分重悬的细胞外基质或大块细胞团。
- 此时，若无需进行刺激处理，可跳至步骤6.1，立即对分离的细胞进行流式细胞术染色分析。或者，将细胞重悬于冻存液（含10% DMSO的FBS）中，先在-80 °C保存，随后转入液氮中长期保存。
注：冻存步骤可允许在后续时间纯化免疫细胞；然而，免疫细胞亚群的定量可能需要优化，以确认冻融过程未影响细胞数量和表型。ex vivo T细胞刺激最好使用新鲜肿瘤样本进行。此时，如需要，还可通过磁珠法去除死细胞或进行免疫细胞富集实验对样本进一步纯化。
5. 细胞准备 离体 刺激
- 用完全培养基（RPMI 含 10% FBS、1× 青霉素和 1× 链霉素）将细胞调整至浓度为 2 × 106/100 µL。
注意：接种较高数量的总细胞可确保样本中含有足够数量的 T 细胞用于分析。然而，具体细胞数量可根据样本可获得性及目标 T 细胞亚群的稀有程度进行相应调整。- 将 100 µL 细胞悬液接种于 U 型底 96 孔板中。
- 加入 100 µL 含有 2× 配制浓度的 PMA/离子霉素的完全培养基（终浓度分别为 0.081 µM 和 1.34 µM，按生产商推荐浓度），
注意：若需检测脱颗粒/胞吐作用，还需在培养基中加入荧光标记的抗小鼠 CD107a 抗体。同时必须设置不加 CD107a 的对照样本。 - 将培养板置于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
- 加入 20 µL 10× 配制浓度的布雷菲德林 A（brefeldin A）和莫能菌素（monensin），使其在完全培养基中的终浓度分别为 1.06 µM 和 2.0 µM（按生产商推荐浓度）。
注意：布雷菲德林 A 和莫能菌素为蛋白质转运抑制剂，可阻断细胞因子等物质向胞外释放，从而使其能在细胞内被流式细胞术检测。若拟通过 ELISA 或类似方法检测上清液中的细胞因子释放，则可省略此步骤。 - 将培养板继续置于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中孵育 4 小时。
6. 流式细胞术的胞外和胞内染色
- 取出培养板，重悬各孔细胞，将所有材料转移至置于冰上的V型底板中。
注意：上皮细胞、巨噬细胞及其他贴壁细胞可能无法通过重悬完全回收。但由于后续分析仅针对T细胞，因此不影响实验结果。- 6.1.1 将板在300 × g 条件下离心5分钟，温度为4 °C（除非另有说明，后续步骤均使用此条件）。
- 通过快速翻转板子一次，将上清液甩出。
- 用50 µL预先配制在冰上预冷PBS中的可固定活力染料重悬细胞。重悬时，将移液器设定为较低体积，以避免产生气泡。
- 在4 °C避光孵育20分钟。
- 洗涤步骤：加入100 µL FACS缓冲液，离心后弃去上清液。
- 用50 µL含抗CD16/CD32抗体（2.5 µg/mL）的FACS缓冲液（含0.5% BSA、2.0 mM EDTA的PBS）重悬各孔细胞，以阻断检测抗体与Fc受体的非特异性结合。
- 在4 °C避光孵育15分钟。
- 直接向每孔加入2×母液，其中包含荧光素偶联的抗小鼠CD45、CD3、CD4和CD8抗体（可根据需要添加其他细胞表面标记物），溶于FACS缓冲液中。
- 在4 °C避光孵育30分钟。
- 洗涤步骤：加入100 µL FACS缓冲液，离心后弃去上清液。
- 加入100 µL 1×胞内（IC）固定缓冲液，在室温避光孵育30分钟。
- 将离心机预热至室温。
- 加入100 µL FACS缓冲液，在300 × g 条件下室温离心5分钟，弃去上清液。随后用1×破膜缓冲液重复洗涤一次，同样在300 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。
- 加入50 µL 1×母液，其中包含溶于1×破膜缓冲液的荧光素偶联抗小鼠IFNγ、TNFα及其他胞内标记物抗体。
- 在室温避光孵育1小时。
- 加入100 µL破膜缓冲液进行洗涤，然后在300 × g 条件下室温离心5分钟，弃去上清液。
- 加入100 µL FACS缓冲液洗涤，在300 × g 条件下室温离心5分钟，弃去上清液。
- 完成最后一次离心后，将细胞重悬于适合流式细胞仪检测的体积中。具体体积可能因FACS管大小而异。
- 将该体积转移至合适的FACS管中用于上机检测。
- 避光并置于冰箱中保存，并在24小时内完成样本检测。
结果
将1000个TB32048细胞注射到胰腺后，原位肿瘤大约需要30天形成（图1A,B）。手术过程中若发生基底膜泄漏，可能导致大肿瘤直接在腹膜壁上形成，并可通过皮肤明显观察到（图1C）。此类小鼠将被剔除出研究。然而，凭借良好的手术技术，可将泄漏的发生率降至最低。终点时收获的原位肿瘤在C57BL/6野生型小鼠体内可生长至相当大的体积（图1D）。收获的原位肿瘤需用胶原酶/DNase消化20分钟，以获得单细胞悬液（图2）。此时，可将肿瘤来源的细胞以每孔2 × 106个细胞的密度接种于U型底培养板中。接种的细胞数量可根据样本中T细胞的丰度进行调整；若T细胞密度较高，可适当减少细胞数量。对照组的脾脏或淋巴结样本也可在此时接种用于刺激。每孔均使用PMA和离子霉素刺激5小时，孵育1小时后加入布雷菲德菌素A和莫能菌素，以阻断细胞因子的胞外释放（图2）。孵育结束后，对样本进行细胞外表位和细胞内细胞因子染色，用于流式细胞术分析（图2）。
通过流式细胞术分析荷有原位肿瘤的小鼠的脾脏和肿瘤样本。脾脏和原位肿瘤的流式细胞术分析所采用的设门策略，首先利用FSC-A和SSC-A排除碎片，通过FSC-A/FSC-H与SSC-A/SSC-W排除双联体，再通过可固定的活力染料阳性信号排除死细胞或凋亡细胞（图3A）。随后将免疫细胞设门为CD45+，T细胞进一步设门为CD3+，并从中界定CD4+和CD8+亚群（图3A）。通过荧光减一（FMO）对照确定设门时的背景荧光水平，并使用仅含布雷菲德菌素A/莫能菌素的对照组确定细胞因子的基础分泌水平（图3B-D）。
对于IFNγ，在脾脏和肿瘤样本中，加入布雷菲德菌素A/莫能菌素后，IFNγ水平相较于FMO对照组均未出现升高。然而，加入PMA和离子霉素后，脾脏来源和肿瘤来源的CD4+与CD8+ T细胞中可检测到的胞内IFNɣ百分比均有所增加。
作为阳性对照，脾脏 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的 IFNγ 产生水平相对高于肿瘤浸润性 T 细胞亚群，其平均值分别为 6.60 ± 1.5% 和 12.97 ± 3.4%，而肿瘤浸润性 T 细胞亚群分别为 4.81 ± 1.0% 和 4.13 ± 1.3%，表明肿瘤微环境中存在免疫抑制现象（图 3B 和 4A）。采用相同的策略检测 TNFα，我们发现较高比例的脾脏 CD4+ T 细胞胞内 TNFα 呈阳性（65.93 ± 2.3%），而肿瘤浸润性 CD4+ T 细胞的比例为 22.45 ± 5.4%。脾脏与肿瘤浸润性 CD8+ T 细胞产生的 TNFα 水平相近，分别为 25.15 ± 3.7% 和 19.91 ± 5.1%（图 3C、图 4B）。
最后，CD107a 是一种内体标志物，在细胞毒性颗粒和细胞因子胞吐过程中短暂表达于细胞表面，因此被用作细胞毒性的替代标志物。在刺激过程中对 CD107a 进行染色的优点在于，所有短暂表达于细胞表面的 CD107a 均可被荧光抗体捕获。仅用布雷菲德菌素 A/莫能菌素处理的细胞显示了 CD107a 的基础表达水平。对于脾脏 CD8+ T 细胞，经 PMA/离子霉素刺激后，检测到的 CD107a 水平升高，在 CD8+ 细胞中上调最为显著，达到 23.95 ± 3.5% CD107a+，而肿瘤浸润性 CD8+ 细胞中仅为 5.8 ± 1.9%，表明脾脏 CD8+ T 细胞的脱颗粒速率更高。另一方面，脾脏和肿瘤浸润性 CD4+ T 细胞表达的 CD107a 水平相近，分别为 9.37 ± 1.5% 和 11.50 ± 1.8%（图 3D 和 4C）。
总体而言，这些结果表明，通过向胰腺注射极低数量（1,000个）的肿瘤细胞即可生成原位肿瘤。这些肿瘤可被快速消化，以分离T细胞用于后续实验 离体 刺激。可检测细胞内细胞因子，从而揭示浸润性T细胞相较于次级淋巴器官中的T细胞所具有的基础水平免疫抑制状态。
图1：原位胰腺肿瘤的构建 (A) 时间表 体内 实验。B腹腔内原位肿瘤的大体外观（左图）及切除后（右图），其中所示肿瘤已被切为两半。C) 手术期间基底膜渗漏的证据可导致肿瘤形成，这些肿瘤可通过皮肤观察到（上图），并在腹膜壁上形成（下图）。D) 小鼠原位胰腺肿瘤重量（小鼠已达到实验终点，n=22）。每个数据点代表一只小鼠，柱状图显示均值 ± 标准误（SEM）。本图数据经修改自先前发表的研究10. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图2：原位肿瘤处理流程示意图 离体 T细胞刺激 收获后，胰腺肿瘤在胶原酶（2 mg/mL）和DNase（0.025 mg/mL）中迅速消化20分钟，于 37 °C随后，将细胞重悬于 2 x 106/mL 完全 RPMI 培养基中，接种于U型底培养板。加入PMA和离子霉素刺激混合物，刺激5小时，在此期间也可同时加入抗小鼠CD107a抗体。孵育1小时后，加入胞内转运阻断剂布雷菲德菌素A和莫能菌素。继续孵育至5小时结束 离体 刺激后，将细胞转移至V型底板中，用可固定的活率染料（溶于PBS）染色20分钟 4 °C细胞用FACS缓冲液洗涤，随后在抗CD16/32（FcR阻断剂）中孵育15分钟（溶于FACS缓冲液），再与细胞外荧光标记抗体在FACS缓冲液中继续孵育30分钟。孵育后，细胞再次用FACS缓冲液洗涤，并重悬于细胞内固定缓冲液中固定20分钟。随后，细胞依次用FACS缓冲液和1×破膜缓冲液各洗涤一次。接着，将细胞重悬于含细胞内荧光标记抗体的1×破膜缓冲液中，室温避光孵育1小时。孵育结束后，细胞依次用1×破膜缓冲液和FACS缓冲液各洗涤一次，最后重悬于FACS缓冲液中，于24小时内上流式细胞仪检测。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：流式细胞术分析 离体 经刺激的脾脏和肿瘤来源的T细胞 (A流式细胞术门控策略用于脾脏（阳性对照）和原位肿瘤样本。首先根据FSC-A/SSC-A区分细胞与碎片，再通过FSC-A/FSC-H和SSC-A/SSC-W圈选单细胞。使用可固定活力染料FVD506排除死细胞或凋亡细胞，随后基于CD45标记免疫细胞。+。随后进行CD3+ T细胞与CD4+ 和 CD8+ 亚群已定义。数据使用 BD Fortessa 获取。（B用于定量IFNγ的设门策略+ CD4+ 和 CD8+ T细胞。使用完全刺激样本（PMA/离子霉素/布雷菲德菌素A/莫能菌素）进行荧光减一（FMO）对照，以确定背景荧光水平。使用仅含布雷菲德菌素A和莫能菌素的对照（B+M仅用）来确定基础细胞因子产生水平。随后利用完全刺激样本计算IFNγ阳性细胞的百分比。+ T细胞。C用于定量TNFα的设门策略+ CD4+ 和 CD8+ T细胞。使用完全刺激样本（PMA/离子霉素/布雷菲德林A/莫能菌素）的FMO对照来确定背景荧光。使用仅含布雷菲德林A和莫能菌素的对照（B+M仅）来确定基础细胞因子产生水平。随后利用完全刺激样本计算TNFα阳性细胞的百分比。+ T 细胞。D用于定义CD107a的设门策略+ CD4+ 和 CD8+ T细胞。使用完全刺激样本（PMA/离子霉素/布雷菲德菌素A/莫能菌素）进行FMO对照，以确定背景荧光。使用仅含布雷菲德菌素A和莫能菌素的对照（B+M仅）来确定基础脱颗粒水平。随后利用完全刺激样本计算CD107a阳性细胞百分比。+ T细胞。所有流式细胞术数据均使用FlowJo Version 10.6.1进行分析。本图中的数据已对先前发表的研究成果进行了修改。10. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：定量分析 离体 脾脏和肿瘤来源的T细胞活性 CD4阳性细胞的比例+ 和 CD8+ T细胞阳性表达（AIFNγ+ (BTNFα+ 以及（CCD107a+ 在原位肿瘤小鼠的脾脏（n=4）和肿瘤组织（n=7）中进行了定量分析。每个数据点代表一只小鼠，误差线表示均值±标准误（SEM）。采用非配对t检验进行统计学显著性分析，其中 * = p<0.05 和 *** = p<0.001。所有数据均使用 Prism 8 进行分析。本图中的数据已对先前发表的研究结果进行了修改10. 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
胰腺癌的体内模型为理解疾病进展和评估新的治疗靶点提供了宝贵的工具3。其中，原位模型尤其具有成本效益高、可重复性强的优点，可同时应用于大量小鼠群体4,27。原位模型还为肿瘤生长提供了相应的微环境和完整的免疫系统，因此相较于皮下移植模型和PDX模型更为合适。然而，我们发现原位模型与KPC小鼠（目前公认的金标准小鼠模型）在某些免疫细胞浸润特征上存在差异10。造成这一现象的原因之一可能是原位模型中肿瘤生长速度较快。此外，已有研究报道原位模型与皮下模型在免疫细胞亚群密度方面也存在进一步差异3,28。因此，尽管转基因KPC模型成本更高且个体间变异性较大6，关键研究结果在条件允许的情况下仍应在小规模KPC小鼠群体中进行验证。
制备用于原位手术的肿瘤细胞是本实验方案中的关键步骤。细胞应始终处于对数生长期，并且无支原体污染及其他感染。如果对肿瘤细胞的生长存在任何疑虑，应推迟原位手术。使用基底膜基质有助于提高成瘤率，优于不加基底膜直接注射细胞29，同时可减少细胞渗漏，从而降低腹膜播散的风险27。然而，一旦肿瘤细胞悬浮于基底膜基质中，应尽快完成注射（2小时内），以避免细胞损失。诱导成瘤所需的肿瘤细胞数量可能因细胞系而异，因此应测试不同细胞数量范围（例如，100–100,000个），这可能也会影响达到实验终点所需的时间。每只小鼠注射1,000个细胞时可能存在一定的误差；因此，若手术需分多天进行，应将各组处理均匀分配至各天，以控制批次效应。大多数手术步骤可根据操作习惯进行调整；但在将胰腺复位至腹腔或缝合腹膜壁时，必须注意避免扰动基底膜。基底膜渗漏可能导致肿瘤细胞在腹膜壁上生长，此类肿瘤生长迅速，可能需要提前处死实验动物。
理想情况下，胰腺肿瘤在收获后应迅速进行消化，并立即用于离体（ex vivo）刺激实验。然而，如果需要处理大量肿瘤样本，则可能无法立即完成全部消化；此时应将肿瘤置于冰上保存，并分批进行消化。已有研究表明，消化酶的种类、浓度以及作用时间均会影响免疫细胞表面大量分子的表达30,31,32。此外，消化时间被有意控制得较短，以减少细胞死亡33。消化后的细胞可使用冻存液进行冷冻保存，以实现长期储存；但在解冻过程中会存在一定程度的细胞损失。若在胶原酶孵育前肿瘤组织未被充分剪碎，则消化效果可能不理想，表现为消化后滤膜上仍残留坚硬的肿瘤组织块。若处理的是正常胰腺组织或早期阶段的肿瘤，可适当降低胶原酶浓度；已有文献报道，提取正常胰腺导管细胞时所使用的酶浓度显著更低34。在消化过程中，上皮细胞出现较明显的死亡是预期现象；但免疫细胞应能较好地耐受该过程。此外，也存在其他替代方法可用于分离具有活性的上皮细胞以进行类器官培养35，或用于保留组织结构完整性36。
可根据所需的检测指标和待分析的免疫细胞类型（例如巨噬细胞或B细胞）轻松调整刺激方案。使用广谱刺激试剂PMA/离子霉素不会区分TCR-抗原特异性，因此在抗原未知时尤为适用。然而，IFNɣ的产生与TCR激活密切相关37，且IFNɣ和TNFα的产生在胰腺导管腺癌（PDAC）抗肿瘤免疫应答中具有关键作用38。PMA/离子霉素刺激可反映T细胞产生细胞因子的最大潜能，但这种潜能未必等同于肿瘤微环境中T细胞的实际分泌情况。内源性细胞因子的产生可在无刺激条件下进行检测；然而，其水平可能极低甚至无法检出。此外，还有其他T细胞刺激方法可供选择，例如抗CD3/CD28包被的磁珠，该方法同样无需抗原或其他免疫细胞群体的参与。此方法的优势在于无需细胞分选即可定量特定T细胞亚群的细胞因子产生能力。此外，还可检测其他细胞毒性相关标志物（如颗粒酶B和穿孔素A）、活化标志物（如IL-2）或免疫抑制因子（如IL-10）21。然而，目前尚无高质量的流式细胞术抗体可用于检测所有感兴趣的细胞因子和因子。因此，若需进行其他应用（如ELISA），可在刺激过程中不添加布雷菲德菌素A/莫能菌素，从而使细胞因子释放至培养上清中。但需注意，这种方法将导致所有细胞的细胞因子完全释放，无法确定具体由哪些细胞群体产生。
IFNγ的产生是抗肿瘤T细胞反应的一个主要特征，常被用作TCR-抗原识别的替代指标37,38。其他更准确界定抗原特异性反应的体内方法则利用表达已知抗原（如卵清蛋白或SV40）的肿瘤细胞。该通用抗原随后可在体外用于检测T细胞识别能力，或与TCR限制性宿主小鼠联合使用。 alternatively，当抗原未知时，可通过批量TCR测序，或近年来发展的单细胞TCR测序来量化T细胞克隆扩增39,40。为全面了解肿瘤内T细胞反应的状态，还应检测提示T细胞耗竭或抑制性受体的标志物，包括：CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM3、2B4；以及效应T细胞标志物（CD44hi、CD62lo）和增殖活性标志物Ki67+或CFSE稀释41,42,43,44。总体而言，原位模型为快速测试可能调节抗肿瘤T细胞反应的治疗策略提供了一个有用的平台，这些策略随后可在较小规模的转基因KPC小鼠队列中进行验证。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢动物技术服务中心以及伦敦玛丽女王大学巴茨癌症研究所（英国伦敦）的Alzbeta Talarovicova博士在原位手术过程中提供的帮助。我们还要感谢格拉斯哥英国癌症研究比顿研究所的Jennifer Morton博士在手术技术方面给予的指导，感谢伦敦玛丽女王大学巴茨癌症研究所（英国伦敦）的Cristina Ghirelli博士在肿瘤消化方面的建议，以及感谢伦敦玛丽女王大学巴茨癌症研究所（英国伦敦）的Fabienne McClanahan博士在相关问题上的建议。 离体 T细胞刺激方案。我们还要感谢医学研究理事会（MRC）、胰腺癌研究基金（PCFR）和卵巢癌行动组织（Ovarian Cancer Action）对本研究的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6/0 规格涂层薇乔可吸收缝合线 | Ethicon | W9500T | |
| 70 μm 孔径细胞筛 | Fisher Scientific | 11597522 | |
| 9 mm Clay Adams 夹子 | VetTech Solutions | IN015A | |
| 抗 CD107a PE 抗体（克隆株 1D4B） | Biolegend | 121612 | 按 1:100 比例加入培养基 |
| 抗 CD16/CD32 抗体 | BD Biosciences | 553142 | 终浓度稀释至 1:200 使用 |
| 抗 CD3 PerCP eFluor710 抗体（克隆株 17A2） | Biolegend | 46-0032 | 终浓度稀释至 1:50 使用 |
| 抗 CD4 FITC 抗体（克隆株 GK1.5） | eBioscience | 11-0041 | 终浓度稀释至 1:100 使用 |
| 抗 CD45 Brilliant Violet 605 抗体（克隆株 30-F11） | Biolegend | 103140 | 终浓度稀释至 1:200 使用 |
| 抗 CD8 Brilliant Violet 421 抗体（克隆株 53-6.7） | Biolegend | 100738 | 终浓度稀释至 1:100 使用 |
| 抗 IFN-γ PE/Cy7 抗体（克隆株 XMG1.2） | Biolegend | 505826 | 终浓度稀释至 1:50 使用 |
| 抗 TNF-α Alexa Fluor 647 抗体（克隆株 MP6-X） | Biolegend | 506314 | 终浓度稀释至 1:50 使用 |
| BD Matrigel 基底膜基质高浓度 | BD Biosciences | 354248 | 冰上分装并储存于 -20 °C |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| 细胞刺激剂混合物（500 倍浓度）（佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯（PMA）和离子霉素） | eBioscience | 00-4970-03 | 终浓度为 PMA 0.081 μM，离子霉素 1.34 μM |
| Clay Adams 自动夹施加器 | VetTech Solutions | IN015B | |
| Clay Adams 自动夹移除器 | VetTech Solutions | IN015B | |
| 来自溶组织梭菌的 V 型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C9263 | 培养基中浓度为 2 mg/mL |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
| DMEM 高糖（4.5 g/L）含 L-谷氨酰胺 | PAA | E15-810 | |
| DNase（来自牛胰腺 II-S 型脱氧核糖核酸酶 I），储存液为 10 mg/mL 的 0.15 M NaCl 溶液 | Sigma-Aldrich | D4513 | 消化液中终浓度为 0.025 mg/mL |
| 可固定活力染料 506（FVD506） | eBioscience | 65-0866 | 在 PBS 中按 1:200 使用 |
| 胎牛血清（FCS） | GE Healthcare | A15-104 | 在 RPMI 中占 10% |
| Hamilton 700 系列微量注射器，25 μL 容量，22s 规针头斜面尖端 | Fisher Scientific | 10100332 | |
| 胞内固定缓冲液和胞内通透缓冲液 | eBioscience | 88-8824-00 | 将通透缓冲液用 H2O 稀释至 1x |
| 青霉素/链霉素 | PAA | 15140122 | 青霉素 100 单位/mL，链霉素 100 μg/mL |
| 蛋白转运抑制剂混合物（500 倍浓度）（布雷菲德菌素 A 和莫能菌素） | eBioscience | 00-4980-03 | 终浓度为布雷菲德菌素 A 10.6 μM，莫能菌素 2 μM |
| RPMI-1640（含 0.3 g/L 谷氨酰胺） | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 手术刀片 No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | 终浓度为胰蛋白酶（0.1%）EDTA（0.4%） |
| U 型底 96 孔微孔板 | VWR | 734-2080 | |
| 通用棉签 - 6 英寸 × 100 支 | Medisave | UN982 | |
| V 型底 96 孔微孔板 | VWR | 735-0184 |
参考文献
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