方法文章

多维共培养系统模拟肺鳞状细胞癌进展

DOI：

10.3791/60644

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2020年3月17日

 ,  ,  , 
1Oncology R&D group, Pfizer Worldwide Research and Development

本文内容

摘要

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建立了一种体外模型系统，用于在与癌症相关成纤维细胞（CAFs）的三维（3D）共培养中捕获肺鳞状细胞癌（LUSC）进展过程中的组织结构变化。该类器官系统为研究多种肿瘤细胞内在和外在变化在调控肿瘤表型中的作用提供了独特的平台。

摘要

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肿瘤与间质之间的相互作用在肺鳞状细胞癌（LUSC）的发生发展中起着关键作用。然而，由于缺乏合适的模型，目前仍难以理解这些动态相互作用如何导致肿瘤发生过程中所观察到的组织结构改变。在本实验方案中，我们描述了一种利用LUSC原代细胞系TUM622构建三维共培养模型的方法。TUM622细胞系来源于LUSC患者来源的异种移植瘤（PDX），具有在基底膜基质中接种后形成类似腺泡结构的独特特性。我们证明，在三维共培养条件下，TUM622细胞形成的腺泡结构能够重现LUSC进展过程中组织结构的关键特征，以及LUSC细胞与肿瘤微环境（TME）组分（包括细胞外基质（ECM）和癌症相关成纤维细胞（CAFs））之间的动态相互作用。我们进一步对核心的三维培养方案进行优化，展示了该系统可用于多种下游分析。总体而言，该类器官模型构建了一个生物学信息丰富且可灵活调整的平台，有助于深入理解在癌变进展过程中导致上皮结构破坏的细胞内在与外在机制，并将推动新治疗靶点和诊断标志物的发现。

引言

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肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因。肺鳞状细胞癌（LUSC）是第二常见的非小细胞肺癌（NSCLC）类型，约占所有肺癌的30%，常在晚期被诊断，预后较差1。目前针对LUSC患者的治疗选择仍存在重大未满足的临床需求，而深入理解驱动LUSC肿瘤发生的细胞和分子机制有望改善这一现状。

与大多数人类癌症一样，肺鳞状细胞癌（LUSC）的发病机制以完整且有序的上皮组织结构遭到破坏为特征2。在此过程中，细胞正常的顶端-基底极性、细胞间连接以及细胞与基质间的相互作用逐渐丧失，导致肿瘤细胞不受控制地增殖并表现出侵袭性行为。目前普遍认为，癌细胞的恶性特征若缺乏癌细胞与其局部肿瘤微环境（TME）之间的重要相互作用，将无法显现3。肿瘤微环境中的关键组分，包括细胞外基质（ECM）、癌症相关成纤维细胞（CAFs）、内皮细胞以及浸润的免疫细胞，均积极参与塑造TME并推动肿瘤发生4。然而，目前对于肿瘤细胞与TME中这些关键组分如何相互作用以驱动LUSC进展过程中的组织结构改变，仍知之甚少。

三维（3D）培养是研究细胞内在和外在变化在调控正常及病变组织结构改变中的生物学活性的重要工具5。与传统的二维（2D）培养相比，3D培....

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方案

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1. 二维培养中 TUM622 细胞和 CAF 的传代与培养

  1. 传代与培养 TUM622 细胞
    1. 将 TUM622 细胞的 3D 培养基和细胞解离试剂（参见材料表）在 37 °C 下预热。
    2. 当 TUM622 细胞在 2D 培养瓶中达到 80% 汇合度时进行传代。通常在传代后 1 周发生。
    3. 弃去 T75 培养瓶中的旧培养基，并用 6 mL HEPES 缓冲液洗涤一次。避免将液体直接吹打到细胞上。
    4. 吸除 HEPES 缓冲液。加入 4 mL 胰蛋白酶/EDTA（0.25 mg/mL，参见材料表）快速冲洗，随后弃去胰蛋白酶/EDTA。
    5. 加入 2 mL 胰蛋白酶/EDTA，在 37 °C 下孵育 5 分钟。将培养瓶从孵育箱中取出，轻敲培养瓶以松动细胞，避免产生气泡，然后将培养瓶放回孵育箱继续孵育 5 分钟。
      注意：长时间暴露于胰蛋白酶会不可逆地损伤细胞并改变其表型，因此建议尽量缩短细胞接触胰蛋白酶的时间。
    6. 在光学显微镜下（4x 或 10x）确认细胞已脱离并解离。加入 4 mL 中和缓冲液（TNS 缓冲液）（参见材料表中的传代试剂信息），随后加入 10 mL 3D 培养基（参见材料表）。
    7. 使用 10 mL 移液器轻轻吹打....

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结果

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二维培养中的 TUM622 细胞和 CAFs
图 1 展示了二维培养条件下 TUM622 细胞和癌相关成纤维细胞（CAFs）的典型形态。TUM622 细胞呈圆形，具有较大的细胞核，而 CAFs 则呈扁平且细长的形态。TUM622 细胞在培养中可达到 80%–90% 的汇合度；进一步增殖会导致细胞数量增多但体积变小，并聚集成不相互直接接触的细胞集落。相比之下，CAFs 更倾向于在较高细胞密度下生长，只要营养充足，即使达到完全汇合仍会持续增殖。

3D ECM中TUM622腺泡的生长与形态
图2展示了一项TUM622细胞在三维培养条件下接种的时间过程实验。数据显示，单个TUM622细胞在包埋后能够形成具有腺泡样形态的类器官。在接种后的第5至第7天之间，腺泡样.......

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讨论

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肿瘤是由癌细胞与基质细胞（如癌症相关成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞）在细胞外基质（ECM）中共存而构成的异质性组织。这些不同组分之间相互交流，影响肿瘤微环境，并在肿瘤发生过程中发挥积极作用，该过程涉及肿瘤结构的渐进性改变。理想的体外肿瘤发育模型应能够捕捉到人体肿瘤体内所观察到的动态组织结构变化，反映肿瘤微环境中多种细胞类型之间的复杂相互作用，同时允许对肿瘤细胞及肿瘤微环境（TME）中的组分进行实验操控。尽管近年来三维癌症模型已取得显著进展，但适用于肺鳞状细胞癌（LUSC）的模型仍难以获得。迄今为止报道的大多数模型仅部分涵盖上述重要特征。本文报道了一种肺鳞状细胞癌（LUSC）的三维共培养系统，该系统可同时再现LUSC发展过程中关键的组织结构变化，以及肿瘤细胞与TME主要组分（包括ECM和CAFs）之间的动态相互作用。

该系统能够更准确地模拟组织结构变化，其基础在于TUM622细胞在三维EC基质中嵌入后可形成具有腺泡样形态的类器官这一独特特性。每个腺泡由一个自我更新的单细胞发育而来，由单层细胞围绕一个中空腔隙构成。该单层细胞表现出顶-基底极性，且保持非侵袭性，类似于肺上皮组织的结构特征.......

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披露

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作者均为辉瑞公司（Pfizer Inc.）的员工及股东。

致谢

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我们感谢辉瑞肿瘤组织病理学与生物标志物团队的 Magali Guffroy、John Kreeger 和 Stephani Bisulco 在病理学/组织学方面的支持，感谢 Michael Arensman 对稿件的审阅。我们还感谢辉瑞博士后项目和肿瘤研究部&D 小组的 Robert Abraham、Puja Sapra、Karen Widbin 和 Jennifer Tejeda，感谢他们对本项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
支气管上皮细胞生长培养基LonzaCC-3170BEGM
40 µm 细胞筛ThermoFisher352340用于 TUM622 细胞过滤
裂解型 Caspase 3 抗体Cell Signaling Technology9661 (RRID:AB_2341188)兔源
CoolRack CFT30BiocisionBCS-138用于三维培养
CoolSink XT96FBiocisionBCS-536用于三维培养
Cultrex 三维细胞收获试剂盒Bio-Techne3448-020-K
Cultrex（共培养首选）Bio-Techne3443-005-01用于三维培养
CXCR4 抗体AbcamAb124824 (RRID:AB_10975635)兔源
E-钙黏蛋白抗体BD Biosciences610182 (RRID:AB_397581)鼠源
GelCountOxford Optronix用于腺泡计数与测量
GM130 抗体BD Biosciences610822 (RRID:AB_398141)鼠源
山羊血清Vector LabsS1000 (RRID:AB_2336615)用于免疫荧光
热灭活胎牛血清Gibco10082-147用于癌相关成纤维细胞（CAFs）
组织学样本凝胶Richard Allan ScientificHG-4000-012用于免疫荧光
整合素 α6 抗体Millipore SigmaMab1378 (RRID:AB_2128317)大鼠源
兜甲蛋白抗体AbcamAb68 (RRID:AB_305656)鼠源
Ki67 抗体AbcamAb15580 (RRID:AB_443209)兔源
Lab-Tec II 带腔室 #1.5 德国盖玻片系统Nalge Nunc International155379 (2)用于三维培养
Lab-Tec II 带腔室 #1.5 德国盖玻片系统Nalge Nunc International155409 (8)用于三维培养
L-谷氨酰胺Gibco25030-081用于癌相关成纤维细胞（CAFs）
Matrigel（单培养首选）Corning356231用于三维培养
p63 抗体Cell Signaling Technology13109 (SRRID:AB_2637091)兔源
青霉素-链霉素（Pen/Strep）Gibco15140-122用于癌相关成纤维细胞（CAFs）
ReagentPack 传代试剂LonzaCC-5034用于 TUM622 细胞解离
RPMI 培养基ThermoFisher11875-093用于癌相关成纤维细胞（CAFs）
Sox2 抗体Cell Signaling Technology3579 (RRID:AB_2195767)兔源
TrypLE ExpressGibco12604-021用于癌相关成纤维细胞解离
Vi-CellBechman Coulter自动细胞计数仪
波形蛋白抗体AbcamAb92547 (RRID:AB_10562134)兔源
β-连环蛋白抗体Cell Signaling Technology2677s (RRID:AB_1030943)鼠源

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
  2. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Ma....

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TUM622

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