多维共培养系统模拟肺鳞状细胞癌进展

摘要

建立了一种体外模型系统，用于在与癌症相关成纤维细胞（CAFs）的三维（3D）共培养中捕获肺鳞状细胞癌（LUSC）进展过程中的组织结构变化。该类器官系统为研究多种肿瘤细胞内在和外在变化在调控肿瘤表型中的作用提供了独特的平台。

摘要

肿瘤与间质之间的相互作用在肺鳞状细胞癌（LUSC）的发生发展中起着关键作用。然而，由于缺乏合适的模型，目前仍难以理解这些动态相互作用如何导致肿瘤发生过程中所观察到的组织结构改变。在本实验方案中，我们描述了一种利用LUSC原代细胞系TUM622构建三维共培养模型的方法。TUM622细胞系来源于LUSC患者来源的异种移植瘤（PDX），具有在基底膜基质中接种后形成类似腺泡结构的独特特性。我们证明，在三维共培养条件下，TUM622细胞形成的腺泡结构能够重现LUSC进展过程中组织结构的关键特征，以及LUSC细胞与肿瘤微环境（TME）组分（包括细胞外基质（ECM）和癌症相关成纤维细胞（CAFs））之间的动态相互作用。我们进一步对核心的三维培养方案进行优化，展示了该系统可用于多种下游分析。总体而言，该类器官模型构建了一个生物学信息丰富且可灵活调整的平台，有助于深入理解在癌变进展过程中导致上皮结构破坏的细胞内在与外在机制，并将推动新治疗靶点和诊断标志物的发现。

引言

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因。肺鳞状细胞癌（LUSC）是第二常见的非小细胞肺癌（NSCLC）类型，约占所有肺癌的30%，常在晚期被诊断，预后较差¹。目前针对LUSC患者的治疗选择仍存在重大未满足的临床需求，而深入理解驱动LUSC肿瘤发生的细胞和分子机制有望改善这一现状。

与大多数人类癌症一样，肺鳞状细胞癌（LUSC）的发病机制以完整且有序的上皮组织结构遭到破坏为特征²。在此过程中，细胞正常的顶端-基底极性、细胞间连接以及细胞与基质间的相互作用逐渐丧失，导致肿瘤细胞不受控制地增殖并表现出侵袭性行为。目前普遍认为，癌细胞的恶性特征若缺乏癌细胞与其局部肿瘤微环境（TME）之间的重要相互作用，将无法显现³。肿瘤微环境中的关键组分，包括细胞外基质（ECM）、癌症相关成纤维细胞（CAFs）、内皮细胞以及浸润的免疫细胞，均积极参与塑造TME并推动肿瘤发生⁴。然而，目前对于肿瘤细胞与TME中这些关键组分如何相互作用以驱动LUSC进展过程中的组织结构改变，仍知之甚少。

三维（3D）培养是研究细胞内在和外在变化在调控正常及病变组织结构改变中的生物学活性的重要工具⁵。与传统的二维（2D）培养相比，3D培养提供了更合适的结构和功能环境。这类系统在细胞生理和细胞行为的多个方面（包括增殖、分化、迁移、蛋白质表达以及对药物处理的反应）更接近体内组织的真实情况。近年来，多个实验室的研究推动了正常肺组织及非小细胞肺癌（NSCLC）体外3D模型的建立^6,7,8。然而，目前尚缺乏一种能够同时模拟肺鳞状细胞癌发生过程中动态组织结构变化并整合关键间质成分的模型。

本文描述了一种利用原代PDX来源的肺鳞状细胞癌细胞（称为TUM622）和癌症相关成纤维细胞（CAFs）建立新型三维（3D）共培养系统的方法^9,10。TUM622细胞和CAFs均来源于患有低分化肿瘤的非小细胞肺癌（NSCLC）患者¹⁰。当以单细胞形式包埋于细胞外基质（ECM）中时，TUM622细胞中的极少数亚群能够形成具有腺泡样结构的类器官，并表现出正确的顶端-基底极性。这些腺泡样结构呈增生性，表达干细胞样和分化标志物的异质性模式，与原始肿瘤相似，但仍保持非侵袭性，因而模拟了肺鳞状细胞癌（LUSC）发育的最早阶段。重要的是，我们发现通过小分子抑制剂阻断细胞内在信号通路，或在ECM中添加关键组分（如CAFs），均可改变腺泡样结构的组织架构；其中，CAFs的加入可促进腺泡形成，并在近距离条件下进一步诱导其转变为侵袭性结构。综上所述，这些结果表明，该LUSC类器官的3D共培养系统为研究LUSC细胞与肿瘤微环境（TME）之间的动态相互作用提供了有价值的平台，并可进一步适用于监测LUSC细胞对药物治疗的反应¹¹。

方案

1. 二维培养中 TUM622 细胞和 CAF 的传代与培养

1. 传代与培养 TUM622 细胞
   1. 将 TUM622 细胞的 3D 培养基和细胞解离试剂（参见材料表）在 37 °C 下预热。
   2. 当 TUM622 细胞在 2D 培养瓶中达到 80% 汇合度时进行传代。通常在传代后 1 周发生。
   3. 弃去 T75 培养瓶中的旧培养基，并用 6 mL HEPES 缓冲液洗涤一次。避免将液体直接吹打到细胞上。
   4. 吸除 HEPES 缓冲液。加入 4 mL 胰蛋白酶/EDTA（0.25 mg/mL，参见材料表）快速冲洗，随后弃去胰蛋白酶/EDTA。
   5. 加入 2 mL 胰蛋白酶/EDTA，在 37 °C 下孵育 5 分钟。将培养瓶从孵育箱中取出，轻敲培养瓶以松动细胞，避免产生气泡，然后将培养瓶放回孵育箱继续孵育 5 分钟。
      注意：长时间暴露于胰蛋白酶会不可逆地损伤细胞并改变其表型，因此建议尽量缩短细胞接触胰蛋白酶的时间。
   6. 在光学显微镜下（4x 或 10x）确认细胞已脱离并解离。加入 4 mL 中和缓冲液（TNS 缓冲液）（参见材料表中的传代试剂信息），随后加入 10 mL 3D 培养基（参见材料表）。
   7. 使用 10 mL 移液器轻轻吹打数次以进一步解离细胞。将细胞悬液通过 40 µm 细胞筛过滤至 50 mL 锥形管中。
   8. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞数量。
   9. 在 20 mL 3D 培养基中接种 0.8 × 10⁶ 个细胞/T75 培养瓶（参见材料表）。
   10. 每隔一天换液一次，用新鲜培养基替换一半的旧培养基。
2. 传代与培养 CAFs
   1. 当 CAFs 细胞达到汇合状态时进行传代。通常在以 1:2 比例传代后培养 5 天时发生。
   2. 使用 RPMI 基础培养基配制 CAF 培养基，添加 20% 热灭活胎牛血清、1% L-谷氨酰胺和 1% 青霉素/链霉素。将培养基预热至 37 °C。
   3. 在 T75 培养瓶中，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗 CAFs 一次，然后加入 2 mL 胰蛋白酶/EDTA，在 37 °C 下孵育 5 分钟。
   4. 在光学显微镜下观察（4x 或 10x），确保细胞已在培养瓶中解离。若未完全解离，可延长孵育时间 2–3 分钟。
   5. 待细胞完全脱离并解离后，加入 10 mL 3D 培养基以中和胰蛋白酶/EDTA，并反复吹打数次以进一步解离 CAFs。
   6. 将细胞悬液转移至 50 mL 锥形管中，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
   7. 弃去上清液，将沉淀重悬于适量体积的 3D 培养基中（参见材料表），并传代至两个新的 T75 培养瓶中。

2. 在细胞外基质中接种 TUM622 细胞以进行三维培养

1. 实验前一天，将基底膜基质小瓶置于4 °C冰箱中过夜解冻。将塑料移液器（2 mL）和枪头于-20 °C预冷过夜。
   注意：并非所有批次的基底膜基质均具有相同的TUM622细胞三维生长支持能力。因此，有必要采购并测试多个批次的基底膜基质，以筛选出能够有效支持腺泡结构形成的批次。通常，此类基质需要较高的蛋白浓度（16–18 mg/mL）。
2. 实验当天，将三维培养基、HEPES缓冲液、胰蛋白酶/EDTA和胰蛋白酶中和缓冲液（TNS）置于37 °C水浴中预热。在准备培养前立即从冰箱中取出已解冻的基底膜基质，并将小瓶置于冰上。
3. 将组织培养板放置于置于冰上的金属平台冷却器上进行预冷。将离心管置于冰上的金属冷却架上预冷。
4. 使用来自步骤1.1.7的TUM622细胞，计算铺板所需的细胞数量。通常，每孔24孔板需要15,000–300,000个细胞。较低密度适用于成像和定量分析，而较高密度则更适合用于RNA提取或Western印迹等需收集细胞的实验。
5. 将细胞悬液转移至预冷的离心管中（每管包含用于三复孔铺板的细胞量），在4 °C条件下，使用水平转子离心机以300 × g离心5分钟。
6. 使用连接无滤芯枪头（20 µL）的抽吸移液器小心吸除上清液，保留约100 µL培养基在管内（可参考管壁刻度作为参考）。
7. 轻轻敲击管壁侧面，使细胞沉淀松动并充分解离，随后将离心管放回冷却架上。
8. 使用预冷的2 mL移液器，在保持小瓶始终接触冰的条件下，通过上下吹打数次轻柔混匀基底膜基质。吹打时应保持均匀且适中的速度，避免在此过程中引入气泡。
9. 将适量体积的基质转移至各离心管中。若在24孔板中进行三复孔铺板，则每管加入1.1 mL基底膜基质。
10. 使用预冷的枪头，将每管中的基质上下吹打约10次，以形成均匀的细胞悬液。
11. 将310 µL细胞/基质悬液转移至预冷的24孔板的每一孔中。移液时保持移液器与板表面呈90°角，并将悬液加至孔中央。悬液应能自然铺展并覆盖整个孔底，无需倾斜培养板。
12. 为便于后续免疫荧光分析，可将细胞/基质悬液平行接种至2孔板腔载玻片中。将100 µL细胞/基质悬液加至2孔板腔载玻片的孔中央（见材料表）。此较小体积有助于基质形成类穹顶状结构。
13. 将培养板和腔载玻片放回组织培养孵箱，孵育30分钟以使基质凝固。在光学显微镜下检查板或载玻片，确保单个细胞在基质中均匀分布（使用4×或10×物镜）。
14. 向每孔中加入1 mL预热的三维完全培养基，向腔载玻片的每孔中加入1.5 mL三维培养基，随后放回孵箱继续培养。

3. 在细胞外基质中对 TUM622 细胞和 CAFs 进行三维共培养

1. 根据第2节步骤制备TUM622和CAFs的细胞悬液。
2. 取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，计数CAFs的细胞密度。
3. 将混合液各10 µL加入血细胞计数板的两个计数室，进行细胞计数并计算细胞密度。
   注意：CAFs形态不规则，在自动细胞计数仪上可能无法准确计数。
4. 将TUM622细胞与CAFs共包埋于基底膜基质中
   1. 根据细胞密度信息，计算铺板所需的细胞数量。CAFs以TUM622细胞数量的2:1比例接种。例如，若接种30,000个TUM622细胞，则共包埋60,000个CAFs。
   2. 将适量体积的TUM622细胞悬液和CAFs细胞悬液转移至同一离心管中，并按照步骤2.5–2.11操作接种至24孔板。如用于免疫荧光实验，则按照步骤2.12所述，将60 µL TUM622/CAFs混合液转移至腔室载玻片中。
5. 在基底膜基质中将TUM622与上层接种的CAFs共培养（参见材料表）
   1. 按照步骤2.5–2.13建立TUM622单层培养体系。
   2. 将CAFs细胞悬液的体积设为所接种TUM622细胞数量的两倍，转移至离心管中，在室温下以300 × g 离心5分钟。
   3. 吸除上清液，将CAFs重悬于1 mL 3D培养基中。
   4. 将1 mL CAFs悬液转移至含有已包埋TUM622细胞的孔中。

4. 收集 TUM622 腺泡用于 RNA/蛋白质提取和荧光激活细胞分选（FACS）

1. 根据3D细胞收获试剂盒说明书，在前一天配制洗涤缓冲液和细胞收获缓冲液，并于4 °C过夜预冷。
2. 开始提取前，将培养板置于板式冷却器上，其他试剂置于冰上。
3. 从3D培养孔中吸除培养基，避免接触基质，然后每孔加入1 mL洗涤缓冲液，轻柔清洗3次。
4. 吸除最后一次洗涤液，每孔加入1 mL细胞收获缓冲液。
5. 使用P1000移液器吸头刮下各孔中的基质。
6. 上下吹打以进一步解离基质。
7. 将1 mL混合液转移至预冷的15 mL锥形管中。向同一孔中再加入1 mL收获缓冲液。
8. 重复步骤4.5–4.7，将同一孔中的全部混合液收集至同一个15 mL锥形管中。
9. 盖紧管盖，在4 °C轻轻摇动30分钟。
10. 每管加入预冷的PBS至总体积10 mL，然后在4 °C以300 × g离心5分钟。
11. 小心吸除上清液，避免触碰沉淀。上清液中可能含有基质碎片，但类球体应全部沉淀于管底。
12. 加入预冷的PBS进行第二次洗涤，轻轻倒置数次以重悬沉淀。在4 °C以300 × g离心5分钟。
13. 离心过程中，配制用于蛋白和RNA提取的裂解缓冲液。
14. 小心吸除上清液，加入裂解缓冲液进行后续处理以提取蛋白或RNA。或者，细胞也可重悬用于流式分析/FACS分选或连续传代。

5. TUM622 腺泡的免疫荧光染色

1. 配制免疫荧光缓冲液（IF缓冲液：含0.1%牛血清白蛋白（BSA）、0.2% Triton X-100和0.05% Tween-20的PBS），一抗封闭缓冲液（含10%山羊血清的IF缓冲液），二抗封闭缓冲液（在一抗封闭缓冲液中加入20 µg/mL山羊抗小鼠F(ab')₂）
2. 从2孔培养腔载玻片中吸除培养基，用PBS冲洗一次，并将载玻片置于冰上的金属板冷却器上。整个实验过程中，腔室载玻片应始终保持在冰上金属板冷却器上。
3. 加入预冷的4%多聚甲醛（PFA）固定腺泡结构，冰上孵育20分钟。
4. 去除4% PFA，每次用2 mL预冷PBS轻轻振荡洗涤5分钟，共洗涤3次。
5. 吸除PBS，加入1.5 mL预冷的含0.5% Triton X-100的PBS进行透化处理，孵育20分钟。此步骤结束后，类圆顶结构将变得松散。
6. 小心从腔室载玻片中吸除透化缓冲液，避免样本损失。可通过在吸管上安装细尖吸头（20 µL），并将吸头轻压至腔室角落完成。
7. 每次用2 mL预冷PBS轻轻振荡洗涤5分钟，共洗涤3次。
8. 在冰上用一抗封闭缓冲液封闭样本1小时。
9. 去除一抗封闭缓冲液，加入二抗封闭缓冲液，封闭30分钟。
10. 将一抗用一抗封闭缓冲液稀释后加入，4 °C孵育过夜。
    注意：此处使用的一抗浓度应高于常规二维细胞培养染色所用浓度。本研究中大多数一抗按1:100稀释（参见材料表）。
11. 去除一抗，用2 mL冷IF缓冲液洗涤样本3次。
    注意：样本可能较为松散，吸液时需格外小心。
12. 将样本在含二抗的原封闭缓冲液中室温孵育1小时。推荐使用高度交叉吸附的二抗以降低背景染色。本研究中大多数二抗按1:200稀释。
13. 去除二抗，用2 mL冷IF缓冲液洗涤样本3次。
    注意：样本可能较为松散，吸液时需格外小心。
14. 在最后一次洗涤时加入含DAPI（1:1,000稀释）的PBS对细胞核进行染色，随后再用PBS洗涤2次。
15. 在共聚焦显微镜下于3天内完成样本成像。
    注意：由于类器官体积较大以及物镜工作距离的限制，通常使用10×或20×放大倍数进行成像。

6. 为免疫组织化学准备3D培养样品

1. 从2孔培养板中吸除培养基，并用PBS冲洗一次。
2. 在37 °C条件下，用4%多聚甲醛固定3D培养物过夜。
3. 去除4%多聚甲醛，用2.5 mL组织学样本凝胶（见材料表）包围培养物，将载玻片置于4 °C环境中至少1小时，使其充分凝固。
4. 将被组织学样本凝胶包围的样品转移至组织包埋盒中，并在自动组织处理仪中过夜处理。
5. 将样品包埋于石蜡中，并准备切片¹²。

7. 化合物筛选的三维细胞毒性检测（以一个96孔板为例）

1. 实验开始前，将96孔板置于板式冷却器上，25 mL储液槽置于储液槽冷却器上，15 mL离心管置于冰上。
2. 在预冷的15 mL聚丙烯离心管中，通过向细胞中加入适量基底膜基质，制备TUM622细胞的基质悬浮液。TUM622细胞的理想密度为每70–75 µL基底膜基质中含10,000个细胞。用移液器上下吹打数次，使细胞在基质中均匀混合。
3. 将带板式冷却器的96孔板和带储液槽冷却器的储液槽从冰上移至干燥台面，避免在转移过程中基底膜基质接触冰。
4. 将细胞-基质混合物转移至冷却的储液槽中，避免产生气泡。
5. 使用机械多通道移液器（10–300 µL），将70–75 µL混合细胞液转移至96孔板的各个相应孔中。
6. 将96孔板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育30分钟，使基底膜基质凝固。
7. 向所有孔中加入100 µL培养基，然后将96孔板放回培养箱。
8. 根据实验目的，从次日或更晚时间开始加入化合物处理。
9. 可通过8孔或12孔真空抽滤装置移除旧培养基，并更换含或不含目标化合物的新鲜培养基，每2–3天对类球体进行换液和重新给药，最长可持续10天。
10. 可依据仪器制造商的操作说明，使用3D成像仪对TUM622类球体数量进行定量分析。

结果

二维培养中的 TUM622 细胞和 CAFs
图 1 展示了二维培养条件下 TUM622 细胞和癌相关成纤维细胞（CAFs）的典型形态。TUM622 细胞呈圆形，具有较大的细胞核，而 CAFs 则呈扁平且细长的形态。TUM622 细胞在培养中可达到 80%–90% 的汇合度；进一步增殖会导致细胞数量增多但体积变小，并聚集成不相互直接接触的细胞集落。相比之下，CAFs 更倾向于在较高细胞密度下生长，只要营养充足，即使达到完全汇合仍会持续增殖。

3D ECM中TUM622腺泡的生长与形态
图2展示了一项TUM622细胞在三维培养条件下接种的时间过程实验。数据显示，单个TUM622细胞在包埋后能够形成具有腺泡样形态的类器官。在接种后的第5至第7天之间，腺泡样...

讨论

肿瘤是由癌细胞与基质细胞（如癌症相关成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞）在细胞外基质（ECM）中共存而构成的异质性组织。这些不同组分之间相互交流，影响肿瘤微环境，并在肿瘤发生过程中发挥积极作用，该过程涉及肿瘤结构的渐进性改变。理想的体外肿瘤发育模型应能够捕捉到人体肿瘤体内所观察到的动态组织结构变化，反映肿瘤微环境中多种细胞类型之间的复杂相互作用，同时允许对肿瘤细胞及肿瘤微环境（TME）中的组分进行实验操控。尽管近年来三维癌症模型已取得显著进展，但适用于肺鳞状细胞癌（LUSC）的模型仍难以获得。迄今为止报道的大多数模型仅部分涵盖上述重要特征。本文报道了一种肺鳞状细胞癌（LUSC）的三维共培养系统，该系统可同时再现LUSC发展过程中关键的组织结构变化，以及肿瘤细胞与TME主要组分（包括ECM和CAFs）之间的动态相互作用。

该系统能够更准确地模拟组织结构变化，其基础在于TUM622细胞在三维EC基质中嵌入后可形成具有腺泡样形态的类器官这一独特特性。每个腺泡由一个自我更新的单细胞发育而来，由单层细胞围绕一个中空腔隙构成。该单层细胞表现出顶-基底极性，且保持非侵袭性，类似于肺上皮组织的结构特征...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
支气管上皮细胞生长培养基	Lonza	CC-3170	BEGM
40 µm 细胞筛	ThermoFisher	352340	用于 TUM622 细胞过滤
裂解型 Caspase 3 抗体	Cell Signaling Technology	9661 (RRID:AB_2341188)	兔源
CoolRack CFT30	Biocision	BCS-138	用于三维培养
CoolSink XT96F	Biocision	BCS-536	用于三维培养
Cultrex 三维细胞收获试剂盒	Bio-Techne	3448-020-K
Cultrex（共培养首选）	Bio-Techne	3443-005-01	用于三维培养
CXCR4 抗体	Abcam	Ab124824 (RRID:AB_10975635)	兔源
E-钙黏蛋白抗体	BD Biosciences	610182 (RRID:AB_397581)	鼠源
GelCount	Oxford Optronix		用于腺泡计数与测量
GM130 抗体	BD Biosciences	610822 (RRID:AB_398141)	鼠源
山羊血清	Vector Labs	S1000 (RRID:AB_2336615)	用于免疫荧光
热灭活胎牛血清	Gibco	10082-147	用于癌相关成纤维细胞（CAFs）
组织学样本凝胶	Richard Allan Scientific	HG-4000-012	用于免疫荧光
整合素 α6 抗体	Millipore Sigma	Mab1378 (RRID:AB_2128317)	大鼠源
兜甲蛋白抗体	Abcam	Ab68 (RRID:AB_305656)	鼠源
Ki67 抗体	Abcam	Ab15580 (RRID:AB_443209)	兔源
Lab-Tec II 带腔室 #1.5 德国盖玻片系统	Nalge Nunc International	155379 (2)	用于三维培养
Lab-Tec II 带腔室 #1.5 德国盖玻片系统	Nalge Nunc International	155409 (8)	用于三维培养
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-081	用于癌相关成纤维细胞（CAFs）
Matrigel（单培养首选）	Corning	356231	用于三维培养
p63 抗体	Cell Signaling Technology	13109 (SRRID:AB_2637091)	兔源
青霉素-链霉素（Pen/Strep）	Gibco	15140-122	用于癌相关成纤维细胞（CAFs）
ReagentPack 传代试剂	Lonza	CC-5034	用于 TUM622 细胞解离
RPMI 培养基	ThermoFisher	11875-093	用于癌相关成纤维细胞（CAFs）
Sox2 抗体	Cell Signaling Technology	3579 (RRID:AB_2195767)	兔源
TrypLE Express	Gibco	12604-021	用于癌相关成纤维细胞解离
Vi-Cell	Bechman Coulter		自动细胞计数仪
波形蛋白抗体	Abcam	Ab92547 (RRID:AB_10562134)	兔源
β-连环蛋白抗体	Cell Signaling Technology	2677s (RRID:AB_1030943)	鼠源