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实体瘤的预测性免疫建模

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DOI：

10.3791/60645

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2020年2月25日

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1Cofactor Genomics

本文内容

摘要

本文通过分子与信息学实验方案，描述了利用基于RNA的方法对实体瘤组织进行定量免疫谱分析，并借助临床队列开展肿瘤免疫学生物标志物发现的研究策略。

摘要

免疫疗法在肿瘤患者治疗中展现出良好前景，但肿瘤微环境的复杂异质性使得治疗反应的预测具有挑战性。解析肿瘤组织内及周围免疫细胞相对群体的能力已被证明在理解治疗反应方面具有临床相关性，但传统技术如流式细胞术和免疫组织化学（IHC）存在局限性，包括所需组织量大、缺乏准确的细胞类型标志物以及诸多技术和操作上的障碍。一种检测方法（例如ImmunoPrism免疫分析检测）克服了这些挑战，能够兼容少量且高度降解的RNA，而这正是从临床存档的实体瘤组织中提取RNA的常见特征。该检测通过试剂盒和基于云的信息学平台实现，为Illumina测序平台提供端到端、定量、高通量的免疫谱分析解决方案。研究人员仅需使用两片福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片或20–40 ng总RNA（取决于样本质量）即可启动实验，该方案可生成一份免疫谱报告，定量分析八种免疫细胞类型和十个免疫逃逸基因，全面呈现肿瘤微环境的特征。所得数据无需额外的生物信息学分析即可直接使用。在具备适当样本队列的情况下，该方案还可用于在特定患者群体中识别具有统计学意义的生物标志物。

引言

在临床研究中，对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人类实体瘤组织样本中肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）及其他免疫相关分子进行定量分析已展现出重要价值1,2,3。流式细胞术和单细胞核糖核酸（RNA）测序等常用技术适用于新鲜组织和血液样本4，但由于无法从FFPE材料中制备出有活性的单细胞悬液，因而不适用于此类样本的分析。目前用于在FFPE组织中定量这些细胞的方法仍面临重大挑战。免疫组织化学（IHC）及其他类似的成像工作流程依赖特异性抗体检测细胞表面蛋白，而这些抗体在不同实验室间的标准化难度较大，难以实现可重复的定量分析5。nCounter系统等平台依赖单一基因的表达来定义关键免疫细胞6，限制了检测的灵敏度与特异性。尽管已有较为通用的RNA测序方法结合独立软件工具可供使用，但在实际应用前通常需要大量的优化与验证工作7,8,9,10,11,12。近年来，激光捕获显微切割（LCM）与RNA测序结合用于FFPE组织的技术已显示出潜力；然而，在旨在发现可靠生物标志物的转化研究中，仍亟需一种更高通量、即用型的解决方案13,14。在精准医学与免疫治疗时代，构建多维生物标志物的方法——例如预测性免疫建模（Predictive Immune Modeling）——能够高精度、高统计显著性地定义患者群体，包括治疗应答者、癌症亚型或生存结局，其重要性日益凸显15,16。

为满足这一需求，开发了一种免疫谱型分析方法，利用标准化的RNA测序试剂和基于云的信息学技术，实现对石蜡包埋（FFPE）实体瘤组织中免疫细胞的高灵敏度和特异性定量。该方案除了能够处理来自FFPE组织的降解RNA外，还可适用于来自有限组织样本的RNA，例如穿刺活检组织、细针抽吸物以及显微或宏观解剖分离的组织。每个样本的RNA数据将与一个名为“免疫健康表达模型”（immune Health Expression Models）的免疫细胞基因表达模型数据库进行比对，从而以占样本中总细胞数的百分比形式定量免疫细胞。简而言之，这些模型通过机器学习方法构建，从经纯化的免疫细胞群体（使用经典细胞表面标志物分离）获得的全转录组数据中识别出独特的多基因表达模式17,18。该技术所依赖的多维健康表达模型使本检测能够将每种免疫细胞在异质性细胞混合物中以占总细胞数的百分比形式进行定量，从而使研究人员能够开展样本间和样本内的免疫细胞比较分析，此类分析已被证明具有临床价值19,20。其他应用包括治疗前后免疫应答的定量分析，如代表性结果中所述。该检测可报告肿瘤及肿瘤微环境中多种免疫结构特征，包括八种免疫细胞类型的绝对百分比（基于基因表达模型得出）：CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD56+ 自然杀伤细胞、CD19+ B细胞、CD14+ 单核细胞、调节性T细胞（Tregs）、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。此外，该检测还报告十个免疫逃逸相关基因的表达水平（以每百万转录本数，即TPM表示）：PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、TIM-3、BTLA、ICOS、CD47、IDO1 和 ARG1。

该试剂盒用于制备高质量文库，适用于Illumina测序平台，采用基于杂交捕获的文库构建方法，如图1所示。如果研究人员所在实验室没有Illumina测序平台，可将样本送至核心实验室进行测序。测序数据生成后将上传至Prism门户网站进行自动化分析，系统会返回每个样本的综合性、定量分析结果，即免疫报告（图2A）。用户也可在Prism门户网站中自定义样本分组，以生成生物标志物报告（图2B），突出显示在两组患者队列间具有统计学显著差异的生物标志物。重要的是，该试剂盒生成的数据仅用于科研目的，不得用于临床诊断。

RNA测序工作流程；cDNA合成、PCR、杂交；流程图示意图
图1：工作流程概览。 在本实验方案中，首先将RNA转化为cDNA。连接测序接头后，通过PCR扩增并加上条形码，以构建捕获前文库。随后，生物素标记的探针与特定的cDNA靶标杂交，并利用链霉亲和素磁珠进行富集捕获。通过洗涤去除未结合的非靶标cDNA。最后通过PCR进一步富集，获得可用于测序的捕获后文库。*总RNA必须来源于人类样本；可以是完整RNA或降解RNA（如FFPE样本）。请点击此处查看该图的放大版本。

ImmunoPrism 分析、免疫细胞类型图表、预测准确性图、生物标志物分析。
图 2：代表性免疫分析报告。 该工作流程生成两份报告：一份针对每个处理样本的个体免疫报告（A），以及一份针对特定患者队列的生物标志物报告（B）。请点击此处查看该图的放大版本。

该方案从总RNA提取到构建完成可用于测序的文库，大约需要16小时的准备时间；然而，方案中已注明多个可选的暂停步骤。本检测利用转录组学丰富且动态的特性，突破传统单分析物生物标志物的局限，转向多维基因表达模型，从而借助标准化试剂和易于使用的软件工具，对组织样本进行全面的生物学表征。该技术使研究人员能够在自身实验室中应用现代技术，通过机器学习算法以及健康基因表达模型数据库，对珍贵的临床样本获得更准确、定量的免疫谱型，并发现具有完整统计分析的多维RNA生物标志物。

方案

此处代表性结果所使用的 人体组织样本购自一家信誉良好的机构（TriStar Technology Group），并已获得供体知情同意，允许用于学术和商业研究，同时获得了相应伦理委员会的批准。

第一部分：捕获前文库制备

1. RNA 定量与定性

  1. 使用荧光定量法测定RNA含量，以确定实验所需的合适上样量。通过电泳评估输入RNA的质量，以确定RNA完整性数值（RIN）和片段所占百分比 >200 个核苷酸（DV200）值。
    1. 对于完整样本（RIN > 7）或部分降解的RNA样本（RIN = 2 至 7）请从步骤 2.1 开始，按照高质量/完整RNA的文库构建步骤进行操作。RNA质量对于在热循环仪程序#1中选择正确的片段化时间至关重要补充表2).
    2. 对于高度降解的样本（例如，RIN = 1 至 2 或 FFPE），确定 DV200 这些样品无需片段化，将按照降解RNA的操作说明从步骤2.2开始进行。
  2. 根据每个样本所需总量，通过将20 ng RNA（RIN值较高的高质量/完整RNA）稀释，制备适量的总RNA > 2）或 40 ng RNA（DV 值降解/FFPE RNA）200 > 20%）至5 µL的无核酸酶水中。使用DV处理样品200 < 不推荐使用20%。对于试剂盒中提供的对照RNA样本，取1 µL相应的RNA加入4 µL无核酸酶的水中进行稀释。对照样本的处理方法与标签所示的高质量（完整）或降解（FFPE）RNA材料相同。参见 补充表1 对于试剂盒中包含的所有试剂。

2. RNA 片段化与引物设计

  1. 按照步骤 2.1.1 处理高质量/完整 RNA，要求 RIN > 2。
    1. 对于高质量 RNA，在无核酸酶的 PCR 管中，于冰上按照表 1组装片段化和引物退火反应体系。
      1. 通过反复吹打数次充分混匀。然后，在微量离心机中短暂离心收集样品
        注意：本方案中所有离心步骤均建议在 ≥ 1,000 × g 条件下离心至少 3 秒。
      2. 将样品放入热循环仪中，并使用程序 #1（补充表 2）。
      3. 立即将反应管转移至冰上，并进入高质量 RNA 的第一链 cDNA 合成（步骤 3.1）。若需同时处理高质量 RNA 和 FFPE RNA，可在片段化孵育期间开始 FFPE RNA 的制备（步骤 2.2）。
片段化与引物混合液体积 (µL)
完整或部分降解的 RNA (20 ng)5
第一链合成反应缓冲液4
随机引物1
总体积10

表1：高质量RNA的片段化与引物反应。 高质量RNA的片段化与引物反应组分应根据所示体积在冰上配制并混合。可预先配制第一链合成反应缓冲液与随机引物的混合液，再加入RNA样品中。

  1. 对于 DV200 > 20% 的降解/FFPE RNA，请遵循步骤 2.2.1。
    1. 对于高度降解（FFPE）且无需片段化的 RNA，按照表 2所述配制引物反应体系。对于完整 RNA，请务必遵循步骤 2.1。
      1. 通过反复吹打数次充分混匀，然后在微量离心机中短暂离心收集样品。
      2. 将样品放入热循环仪中，并使用程序 #2（补充表 2）。
      3. 将反应管转移至冰上，随后进行高度降解（FFPE）RNA 的第一链 cDNA 合成（步骤 3.2）。
预变性反应体积 (µL)
FFPE RNA (40 ng)5
随机引物1
总体积6

表2：针对高度降解RNA的随机引物反应。 针对高度降解RNA的引物反应组分应在无核酸酶的PCR管中冰上配制。

3. 第一链 cDNA 合成

  1. 按照步骤 3.1.1 操作，获得 RIN > 2 的高质量/完整 RNA。
    1. 对于完整 RNA（高质量），根据表 3，在无核酸酶的 PCR 管中于冰上配制第一链合成反应体系。
      1. 保持反应体系在冰上，通过反复吹打数次充分混匀。在微量离心机中短暂离心，随后立即进行第一链合成孵育（步骤 4）。
第一链合成体积 (µL)
已片段化并加引物的 RNA（步骤 2.1.3）10
第一链合成特异性试剂8
第一链合成酶混合液2
总体积20

表3：高质量RNA的第一链合成反应。 应根据指定体积在冰上配制并混合高质量RNA的片段化与引物反应组分。可预先配制第一链合成特异性试剂和第一链合成酶混合液的主混合液，并将其加入已片段化并加有引物的RNA样品中。

  1. 对于 DV200 > 20% 的降解/FFPE RNA，请按照步骤 3.2.1 操作。
    1. 对于高度降解的 RNA（FFPE），请在冰上、无核酸酶的 PCR 管中，根据表 4配制第一链合成反应体系。
      1. 保持反应体系处于冰上，通过反复吹打数次充分混匀。短暂离心收集样品后，立即进入第一链合成孵育（步骤 4）。
第一链合成体积 (µL)
已加引物的 RNA（步骤 2.2.3）6
第一链合成反应缓冲液4
第一链特异性试剂8
第一链合成酶混合物2
总体积20

表4：高度降解RNA的cDNA第一条链合成反应。 高度降解RNA的片段化与引物反应组分应根据所示体积在冰上配制并混合。可预先配制cDNA第一条链合成反应缓冲液、cDNA第一条链合成特异性试剂和cDNA第一条链合成酶混合液的主混合液，并将其加入已加引物的RNA样品中。

4. 第一链合成孵育

  1. 将离心管保持在冰上，通过反复吹打混匀数次。在微量离心机中短暂离心以收集样品。按照程序 #3（补充表 2）在预热的热循环仪中孵育样品。

5. 第二条链 cDNA 合成

  1. 在冰上配制第二链 cDNA 合成反应体系，加入 表 5 所列组分，包括第 4.1 步获得的第一链反应产物。
第二链合成反应体积 (µL)
第一链合成产物（步骤 4.1）20
第二链合成反应缓冲液8
第二链合成酶混合物4
无核酸酶水48
总体积80

表5：第二链合成反应。 应根据所示体积在冰上配制并混合第二链cDNA合成反应的各组分。可预先配制第二链合成反应缓冲液、第二链合成酶混合物和无核酸酶水的总混合液，并将其加入第一链合成产物中。

  1. 保持离心管置于冰上，通过反复吹打数次充分混匀。按照程序 #4（补充表 2）在热循环仪中进行孵育。

6. 使用 SPRI（固相可逆固定化）磁珠进行 cDNA 纯化

  1. 使用前将SPRI磁珠置于室温下至少30分钟使其充分回温，然后涡旋振荡约30秒以充分重悬磁珠。
  2. 向第二链合成反应液（约80 µL）中加入144 µL重悬的磁珠。通过移液器上下吹打至少10次以充分混匀，室温孵育5分钟。
  3. 短暂离心试管，然后将试管置于磁力架上，使磁珠与上清液分离。待溶液澄清后，小心移除并弃去上清液。注意不要扰动含有DNA的磁珠。
  4. 将试管保持在磁力架上，加入180 µL新鲜配制的80%乙醇。室温孵育30秒，然后小心移除并弃去上清液。
  5. 重复步骤6.4一次，共完成2次洗涤步骤。
  6. 彻底去除残留乙醇。将试管保持在磁力架上，打开管盖，室温空气干燥磁珠约3分钟，或直至磁珠明显干燥。切勿过度干燥，以免导致DNA回收率降低。
  7. 将试管从磁力架上取下，向磁珠中加入53 µL 0.1x TE缓冲液（试剂盒中提供，参见补充表1）。用移液器上下吹打至少10次以充分混匀，室温孵育2分钟。
  8. 将试管放回磁力架上，待磁珠完全与上清液分离后，将50 µL上清液转移至洁净的无核酸酶PCR管中。注意不要扰动磁珠。此步骤为本实验流程中的可选暂停点，cDNA样品可于-20 °C保存。

7. cDNA文库的末端修复

  1. 将步骤6.8中获得的第二条链合成产物与表6中列出的组分在冰上混合，组装末端修复反应体系。
末端修复反应体积 (µL)
第二链合成产物（步骤 6.8）50
末端修复反应缓冲液7
末端修复酶混合物3
总体积60

表6：末端修复反应。 应根据所示体积在冰上配制并混合末端修复反应的各组分。可先配制末端修复反应缓冲液和末端修复酶混合液的预混液，然后将其加入第二链合成产物中。

  1. 将移液器调至 50 µL，然后将全部液体上下吹打至少 10 次，以充分混匀。短暂离心，使管壁上的所有液体收集至管底。充分混匀至关重要。少量气泡的存在不会影响实验效果。
  2. 将样品放入热循环仪中，按照程序 #5（补充表 2）进行孵育。

8. 连接接头

  1. 在设置连接反应之前，按照表7所示，用预冷的接头稀释缓冲液对接头进行稀释，稀释时乘以所需样本数再增加10%的余量。稀释后的接头应置于冰上保存。
连接反应稀释体积 (µL)
接头0.5
接头稀释缓冲液2
总体积2.5

表7：接头稀释。 应根据所示体积，用接头稀释缓冲液在冰上稀释接头。

  1. 按照表8中列出的顺序，将各组分依次加入第7.3步的末端修复反应产物中，在冰上组装连接反应。注意，连接主混合液（Ligation Master Mix）和连接增强剂（Ligation Enhancer）可预先混合，该混合物在4 °C下至少稳定8小时。在进行接头连接步骤前，切勿提前将连接主混合液、连接增强剂与接头（Adaptor）预先混合。
连接反应体积 (µL)
末端处理后的 DNA（步骤 7.3）60
稀释后的接头（步骤 8.1）2.5
连接增强剂1
连接主混合液30
总体积93.5

表8：连接反应。 应按照所示顺序和体积在冰上配制接头连接反应的各组分。可预先配制连接增强剂和连接主混合液的主混合液，然后将其加入末端修复后的DNA与稀释后的接头混合物中。在与末端修复后的DNA混合之前，切勿将稀释后的接头与连接主混合液或连接增强剂预先混合。

  1. 将移液器调至 80 µL，然后将全部液体上下吹打至少 10 次，以充分混匀。短暂离心，使管壁上的所有液体沉至管底。连接反应主混合液（Ligation Master Mix）黏度较高，需特别注意确保连接反应充分混匀，混匀不充分会导致连接效率降低。少量气泡的存在不会影响反应性能。
  2. 按照程序 #6（补充表 2）进行孵育，然后从PCR仪中取出连接反应液，加入 3 µL 接头处理酶（Adaptor Processing Enzyme），终体积为 96.5 µL。
  3. 上下吹打数次以充分混匀，随后立即按照程序 #7（补充表 2）进行孵育，接着进入连接反应的纯化步骤。

9. 使用 SPRI 磁珠纯化连接反应

  1. 使用前将SPRI磁珠置于室温下至少30分钟使其充分回温，然后涡旋振荡约30秒以充分重悬磁珠。
  2. 向样品中加入87 µL重悬的SPRI磁珠，通过移液器上下吹打至少10次充分混匀。室温孵育10分钟。
  3. 短暂离心试管，随后将试管置于磁力架上以分离磁珠与上清液。待溶液澄清后（约5分钟），小心移除并弃去上清液，切勿丢弃磁珠。
  4. 在磁力架上向试管中加入180 µL新鲜配制的80%乙醇。室温孵育30秒后，小心移除并弃去上清液。重复本步骤一次，共进行两次洗涤。
  5. 彻底去除残留乙醇。将试管保持在磁力架上，打开管盖，室温下空气干燥磁珠约3分钟，或直至磁珠明显干燥。切勿过度干燥，以免导致DNA回收率降低。
  6. 将试管从磁力架上取下，向磁珠中加入17 µL 0.1x TE缓冲液。通过移液器上下吹打至少10次以充分混匀。室温孵育2分钟，然后将试管放回磁力架，使磁珠完全与上清液分离。
  7. 将15 µL上清液转移至洁净的无核酸酶PCR管中，注意避免扰动磁珠。此步骤为本实验流程中的可选暂停点，接头连接的DNA可在-20 °C条件下保存。

10. 适配子连接DNA的PCR富集

  1. 按照表9所述设置PCR反应。可配制包含Pre-Capture PCR主混合液和通用引物的主混合液，并将其加入接头连接的DNA中。对于多重测序，每个反应应使用独特的索引引物，并分别加入各个样本中。
PCR 富集体积 (µL)
接头连接的 DNA（步骤 10.1）15
捕获前 PCR 预混液25
通用 PCR 引物5
Index (X) 引物5
总体积50

表9：连接接头的DNA的PCR扩增。 应根据所示体积在冰上配制并混合连接接头的DNA进行PCR扩增所需的各组分。可预先配制Pre-Capture PCR主混合液与通用PCR引物的混合液，并将其加入到连接了接头的DNA中。对于多重测序，每个样本应使用唯一的Index引物。

  1. 轻轻吹打混合10次。在微量离心机中短暂离心，然后放入热循环仪中，使用程序#8（补充表2）进行PCR扩增。

11. 使用 SPRI 磁珠纯化 PCR 反应产物

  1. 使用前将SPRI磁珠置于室温下至少30分钟使其充分回温，然后涡旋振荡约30秒以充分重悬磁珠。
  2. 向每个PCR反应体系（约50 µL）中加入45 µL重悬的磁珠。通过移液器上下吹打至少10次以充分混匀，随后在室温下孵育5分钟。
  3. 短暂离心样品管，然后将样品管置于磁力架上，使磁珠与上清液分离。待溶液澄清后（约5分钟），小心移除并弃去上清液。注意不要扰动含有DNA的磁珠。
  4. 将样品管保持在磁力架上，向管中加入180 µL新鲜配制的80%乙醇。室温孵育30秒后，小心移除并弃去上清液。重复步骤11.4一次，共完成两次洗涤步骤。
  5. 彻底去除残留的乙醇。将样品管保持在磁力架上，打开管盖，在空气中干燥磁珠约3分钟，或直至磁珠明显干燥。切勿过度干燥，以免导致DNA回收率降低。
  6. 将样品管从磁力架上取下，向磁珠中加入23 µL 0.1x TE缓冲液。通过移液器上下吹打至少10次以充分混匀，室温孵育2分钟。
  7. 将样品管放回磁力架上，待磁珠完全与上清液分离后，将20 µL上清液转移至洁净的无核酸酶PCR管中。操作时注意不要扰动磁珠。此步骤为本实验方案的可选暂停点，捕获前文库可于-20 °C保存。

12. 验证并定量前捕获文库

  1. 使用荧光计和高敏检测试剂盒测定捕获前文库的浓度。文库产量至少达到 200 ng 时，方可进入第二部分：杂交与捕获。
    1. 取 1 µL 文库样品在数字电泳系统上运行。如有必要，根据制造商的操作说明建议稀释样品，以避免高灵敏度芯片过载。
    2. 检查电泳图谱是否显示一个狭窄的分布峰，峰大小约为 250–400 bp（参见代表性结果中的图 3和图 4）。
    3. 若在Bioanalyzer图谱中可见128 bp峰（接头二聚体），且其信号强度 ≥ 250–400 bp文库信号的强度（参见代表性结果中的图 5），则将样品体积（来自步骤11.7）用0.1x TE缓冲液补至50 µL，并重复SPRI磁珠纯化步骤（步骤11）。本步骤为本实验方案中的可选暂停点，捕获前文库可在-20 °C条件下保存，随后再进入第二部分：ImmunoPrism杂交与捕获。

第二部分：杂交与捕获

13. 混合封闭寡核苷酸、Cot-1 DNA、捕获前文库DNA并进行干燥

  1. 将第11步制备并在第12步定量的条形码文库与Cot-1 DNA和阻断寡核苷酸在无核酸酶的PCR管或1.5 mL微量离心管中混合，如表10所示。
试剂数量/体积
来自步骤 10.10 的带条形码文库200 ng
Cot-1 DNA2 μg
封闭寡核苷酸2 µL

表10：杂交准备及样品干燥。 为准备杂交反应而进行文库干燥时，应按照表中所示用量混合相应组分。

  1. 使用真空浓缩仪在30-45 °C下干燥管内物质。此步骤为本实验方案中的可选暂停点。干燥后，离心管可在室温（15-25 °C）下保存过夜，或在-20 °C下长期保存。

14. 将DNA捕获探针与文库杂交

  1. 在室温下解冻2×磁珠洗涤缓冲液、杂交缓冲液、杂交缓冲液增强剂、ImmunoPrism探针组、10×洗涤缓冲液1、10×洗涤缓冲液2、10×洗涤缓冲液3以及10×严格洗涤缓冲液。使用前检查杂交缓冲液中是否有盐类结晶。若存在结晶，将管子置于65 °C加热，并间歇振荡，直至缓冲液完全溶解。
  2. 在室温下，在离心管中配制杂交主混合液。根据样本数量乘以相应体积，并额外增加10%，具体参见表11。
杂交主混合液体积 (µL)
杂交缓冲液8.5
杂交缓冲液增强剂2.7
ImmunoPrism 探针面板5
无核酸酶水0.8
总体积17

表11：杂交主混合液。 杂交主混合液的组分应按照所示体积在室温下配制并混合。

  1. 涡旋振荡或吹打混匀。然后，向每管含干燥DNA的样品中加入17 µL杂交主混合液。密封各管，并在室温下孵育5分钟。
  2. 涡旋振荡样品，确保充分混匀，随后在微量离心机中短暂离心。如适用，将各样品从1.5 mL微量管转移至无核酸酶的PCR管中。
  3. 将样品放入热循环仪中，运行程序#9（补充表2）。
    1. 孵育期间，准备洗涤缓冲液（步骤15）和链霉亲和素磁珠（步骤16），确保有足够时间预热缓冲液并平衡链霉亲和素磁珠。

15. 准备洗涤缓冲液

注意：洗涤缓冲液以2倍浓度（Bead Wash Buffer）或10倍浓度（所有其他洗涤缓冲液）的浓缩液形式提供。

  1. 杂交孵育期间，根据表12，将2倍浓度的磁珠洗涤缓冲液和10倍浓度的洗涤缓冲液稀释，配制成1倍工作液，乘以所需样本数量并额外增加10%。如果10倍浓度的洗涤缓冲液1出现浑浊，需将瓶子置于65 °C水浴或加热块中加热，以重新溶解沉淀物。冷冻的1倍洗涤缓冲液在解冻后应充分混匀。
洗涤缓冲液浓缩缓冲液 (µL)无核酸酶水 (µL)总量 (µL)
磁珠洗涤缓冲液150150300
洗涤缓冲液 125225250
洗涤缓冲液 215135150
洗涤缓冲液 315135150
严格洗涤缓冲液30270300

表12：洗涤缓冲液稀释。 应根据表中所示体积，用无核酸酶水在室温下稀释浓缩洗涤缓冲液。

  1. 将1×洗涤缓冲液分装至无核酸酶的PCR管中，并按照表13所示置于相应的温度条件下。确保分装体积足够，以补偿移液过程中的损耗。对于需要加热的缓冲液，使用预热至65 °C的PCR仪，且仪器盖温度设为70 °C。
洗涤缓冲液保存温度每管体积（µL）每样本管数
Bead Wash Buffer室温（15–25 °C）1003
Wash Buffer 165 °C1001
Wash Buffer 1室温（15–25 °C）1501
Wash Buffer 2室温（15–25 °C）1501
Wash Buffer 3室温（15–25 °C）1501
Stringent Wash Buffer65 °C1502

表13：稀释后的洗涤缓冲液。 应根据所示每份样品的体积和试管数量，将稀释后的洗涤缓冲液分装至不同的试管中。使用前，洗涤缓冲液必须置于指定温度下保存。

  1. 按照 表14 所示，在室温下配制磁珠重悬混合液，根据所需样本数量进行倍数放大，并额外增加10%。
磁珠重悬混合液体积 (µL)
杂交缓冲液8.5
杂交缓冲液增强剂2.7
无核酸酶水5.8
总体积17

表14：磁珠重悬混合液。 应在室温下根据所示体积配制并混合磁珠重悬混合液的各组分。

16. 准备链霉亲和素磁珠

  1. 使用前将链霉亲和素磁珠在室温下平衡至少30分钟。涡旋振荡15秒使磁珠充分混匀，并将50 µL磁珠分装至无核酸酶的PCR管中，每管用于一次捕获。
  2. 向每根PCR管中加入100 µL 1×磁珠洗涤缓冲液（按步骤15.1配制）。轻轻吹打混匀10次。将PCR管置于磁力架上，使磁珠完全与上清液分离。
  3. 小心移除并弃去澄清的上清液，注意不要扰动磁珠沉淀。
  4. 进行以下洗涤步骤：
    1. 从磁力架上取下PCR管。向每根含有磁珠的PCR管中加入100 µL 1×磁珠洗涤缓冲液，然后轻轻吹打10次以充分混匀。
    2. 将PCR管放回磁力架，使磁珠完全与上清液分离。
    3. 小心移除并弃去澄清的上清液。
  5. 重复步骤16.4一次，共完成两次洗涤。
  6. 从磁力架上取下PCR管。向每根PCR管中加入17 µL来自步骤15.3的磁珠重悬混合液。反复吹打数次以充分混匀，确保磁珠未粘附在管壁上。如有需要，可短暂离心以使磁珠完全沉降至管底。

17. 将杂交后的靶标结合到链霉亲和素磁珠上

  1. 4小时杂交孵育完成后，从热循环仪中取出样本，并将热循环仪温度设置为65 °C，加热盖设置为70 °C进行孵育。
  2. 使用多通道移液器，将17 µL充分混匀的磁珠转移至样本中。通过上下吹打10次，彻底混匀。
  3. 将管子放入热循环仪中，按照程序#10（补充表2）进行操作，使DNA结合到磁珠上。在孵育过程中，每10–12分钟短暂取出排管，轻轻涡旋3秒，以确保磁珠保持悬浮状态。也可通过多次上下吹打进行混匀。随后立即进行链霉亲和素磁珠洗涤（步骤18）。

18. 洗涤链霉亲和素磁珠以去除未结合的DNA

  1. 使用步骤 15.2 中的 1 倍洗涤缓冲液，并在洗涤过程中将加热后的缓冲液存放于热循环仪中。
  2. 向步骤 17.3 中的离心管加入 100 µL 预热的 1 倍洗涤缓冲液 1。通过上下吹打 10 次彻底混匀。将离心管置于磁力架上，使磁珠完全与上清液分离。
  3. 用移液器吸出并弃去含有未结合 DNA 的上清液。从磁力架上取下离心管。
  4. 进行以下 65 °C 严格洗涤步骤：
    1. 加入 150 µL 预热的 1 倍严格洗涤缓冲液。
    2. 通过上下吹打至少 10 次彻底混匀，移液过程中避免产生气泡。务必确保所有离心管中的磁珠完全重悬。
    3. 在热循环仪中 65 °C 孵育 5 分钟。
    4. 将离心管置于磁力架上，使磁珠完全与上清液分离。用移液器吸出并弃去含有未结合 DNA 的上清液。从磁力架上取下离心管。
    5. 重复步骤 18.4，共进行两次严格洗涤。
  5. 进行第一次室温洗涤：
    1. 加入 150 µL 室温的 1 倍洗涤缓冲液 1。
    2. 上下吹打 10 至 20 次，使磁珠完全重悬。
    3. 密封离心管，孵育 2 分钟，期间交替进行 30 秒轻柔涡旋振荡和 30 秒静置。务必确保所有孔中的磁珠在整个孵育过程中始终保持完全重悬状态。
    4. 短暂离心离心管。
    5. 将离心管置于磁力架上，使磁珠完全与上清液分离。用移液器吸出并弃去上清液。
    6. 密封离心管并短暂离心。放回磁力架，使用 10 µL 移液器去除残留的洗涤缓冲液。
  6. 进行第二次室温洗涤：
    1. 加入 150 µL 室温的 1 倍洗涤缓冲液 2。
    2. 上下吹打 10 至 20 次，使磁珠完全重悬。
    3. 密封离心管，孵育 2 分钟，期间交替进行 30 秒轻柔涡旋振荡和 30 秒静置。务必确保所有孔中的磁珠在整个孵育过程中始终保持完全重悬状态。
    4. 短暂离心离心管。
    5. 将重悬于洗涤缓冲液 2 中的全部磁珠转移至洁净的无核酸酶 PCR 管中。重要提示：将磁珠转移至新管中对于避免脱靶污染至关重要。
    6. 将离心管置于磁力架上，使磁珠完全与上清液分离。用移液器吸出并弃去上清液。
    7. 密封离心管并短暂离心。放回磁力架，使用 10 µL 移液器去除残留的洗涤缓冲液。
  7. 进行第三次室温洗涤：
    1. 加入 150 µL 室温的 1 倍洗涤缓冲液 3。
    2. 上下吹打 10 至 20 次，使磁珠完全重悬。
    3. 密封离心管，孵育 2 分钟，期间交替进行 30 秒轻柔涡旋振荡和 30 秒静置。务必确保所有孔中的磁珠在整个孵育过程中始终保持完全重悬状态。
    4. 短暂离心离心管。
    5. 将离心管置于磁力架上，使磁珠完全与上清液分离。用移液器吸出并弃去上清液。
    6. 密封离心管并短暂离心。放回磁力架，使用 10 µL 移液器去除残留的洗涤缓冲液。
    7. 从磁力架上取下离心管，向磁珠中加入 20 µL 无核酸酶水。
    8. 上下吹打 10 次，确保粘附在管壁上的磁珠均被重悬。
  8. 重要提示：切勿弃去磁珠。在步骤 19 中使用全部 20 µL 含捕获 DNA 的重悬磁珠。

19. 进行最终的捕获后 PCR 富集

  1. 根据下表配制捕获后 PCR 主混合液，按照所需样本数量乘以相应倍数，并额外增加 10%，具体参见表 15。
捕获后 PCR 主混合液组分体积 (µL)
捕获后 PCR 主混合液25
捕获后 PCR 引物混合液1.25
无核酸酶水3.75
总体积30

表15：捕获后PCR主混合液。 捕获后PCR主混合液的组分应根据所示体积在冰上配制并混匀。

  1. 向每个样本中加入 30 µL 捕获后 PCR 预混液，使最终反应体系体积为 50 µL。通过移液器上下吹打 10 次，充分混匀。
  2. 将 PCR 管放入热循环仪中，按照程序 #11（补充表 2）进行孵育。

20. 纯化捕获后 PCR 片段

  1. 使用前将SPRI磁珠置于室温下至少30分钟使其充分回温，然后涡旋振荡约30秒以充分重悬磁珠。
  2. 向每个PCR扩增后的捕获产物（50 µL）中加入75 µL重悬的磁珠。用移液器反复吹打至少10次以充分混匀。链霉亲和素磁珠不会干扰SPRI磁珠的纯化过程。室温孵育5分钟。
  3. 短暂离心管子后，将管子置于磁力架上以分离磁珠与上清液。待溶液澄清后，小心移除并弃去上清液。注意不要扰动含有DNA的磁珠。
  4. 将管子保持在磁力架上，加入180 µL新鲜配制的80%乙醇。室温孵育30秒，然后小心移除并弃去上清液。
  5. 重复步骤20.4一次，共完成两次洗涤步骤。
  6. 彻底去除残留的乙醇。将管子留在磁力架上，打开管盖在空气中干燥3分钟，或直至磁珠明显干燥。切勿过度干燥磁珠，否则可能导致DNA回收率降低。
  7. 将管子从磁力架上取下。加入22 µL 0.1x TE缓冲液以洗脱DNA。用移液器反复吹打数次以充分混匀。室温孵育2分钟。再将管子放回磁力架，直至溶液澄清。
  8. 吸取20 µL上清液转移至新的无核酸酶的PCR管中，注意避免扰动磁珠。此步骤为本实验流程中的可选暂停点，文库可在-20 °C条件下保存。

21. 验证并定量文库

  1. 使用荧光计和高灵敏度检测试剂盒测定捕获文库的浓度。
  2. 使用数字电泳高灵敏度DNA芯片测定捕获文库的平均片段长度，并利用系统软件计算每个文库的平均片段大小。平均片段长度应在约250-400 bp范围内（参见代表性结果中的图6和图7）。此步骤为本实验方案中的可选暂停点，已完成的文库可保存于-20 °C。

22. 测序平台上的测序

  1. 测序时，将文库稀释至 2 nM，并按照测序仪制造商的指南进行上样和操作。对文库进行测序，至少获得 1500 万条长度不少于 50 bp 的单端读长。

23. 利用基于云的信息学工具 Prism Portal 分析测序数据以生成免疫谱并发现生物标志物

  1. 访问 https://prism.cofactorgenomics.com/ 创建 Prism 账户
  2. 登录后，可在 Prism 任意页面的顶部工具栏中点击 提交新项目，以上传已解复用的 FASTQ 测序文件，或上传存储在 BaseSpace 中并关联至 Prism 账户的文件。
  3. 填写新项目表单，包括项目名称以及按组或队列划分的样本。样本分组及其对应的分组名称对于生成生物标志物发现报告是必需的。请注意，每组至少需要 3 个样本才能生成生物标志物发现报告。点击 启动应用 按钮提交表单；若提交成功，将显示确认页面。
  4. 登录状态下，可在 Prism 任意页面的顶部工具栏点击 查看结果。Prism 允许用户查看已提交项目的分析状态，并按项目查看样本报告和生物标志物报告。页面将显示用户在 Prism 上创建的所有项目列表，该列表包含状态、项目名称和提交日期三列。
    注意：每个项目的状态可能为：
    • "运行中"，表示项目分析正在进行中；或
    • "成功"，表示项目分析已完成，报告已可查看。
  5. 若项目已完成分析（状态显示为 "成功"），可查看各单一样本报告及生物标志物发现报告。请注意，只有当项目中每组包含至少三个样本时，生物标志物发现报告才可用。
    1. 要访问这些报告，请返回项目列表并点击项目名称。在该项目页面中，将显示一个包含项目中每个样本的表格。点击每行中 报告 列下的链接，可查看对应样本的个体报告。在表格下方，点击生物标志物发现报告的链接即可查看。如果该页面无任何链接，则表示您的项目尚未完成分析。

结果

在整个实验流程中设有多个检测点，可供使用者评估所获得材料的质量与数量。在完成方案中描述的第12步后，将生成如图3所示的电泳图谱，该图谱代表了完整RNA样本（RIN = 7.8）在捕获前文库中的典型情况。

电泳分析图，DNA分离，荧光单位与碱基对，峰值数据。
图3：完整RNA样本的典型捕获前文库Bioanalyzer图谱。 捕获前文库在250-400碱基对（bp）范围内呈现为一个宽峰。 请点击此处查看此图的放大版本。

应注意避免过度扩增，如图4所示，该图是来自FFPE RNA样本（DV200 = 46）的捕获前文库的代表性电泳图谱，显示在约1,000 bp处出现第二个峰。如果该峰相对于主峰（如图所示，位于约250-400碱基对（bp））较小，则不会干扰后续步骤或分析。如果该第二峰相对于250-400 bp峰较大，可减少PCR循环次数重新制备捕获前文库，以降低过度扩增。

DNA片段分析的电泳图谱，显示峰强度与片段大小（bp标度）的关系。
图4：福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本的典型捕获前文库生物分析仪图谱。 在约1,000 bp处出现的第二个峰提示存在扩增过度现象。如果该峰相对于主峰（位于约250–400 bp处，如图所示）较小，则不会干扰后续步骤或分析结果。如果该峰相对于250–400 bp处的主峰较大，可通过减少PCR扩增循环数重新制备捕获前文库，以降低过度扩增的程度。 请点击此处查看该图的放大版本。

如步骤12.1.3所述，应评估接头二聚体的存在情况，以确定是否需要进行额外纯化。图中所示的电泳图谱 图5 代表不可接受的（图5A，DV200 = 33）且可接受（图5B，DV200 接头二聚体的水平，表现为约128 bp处的尖锐峰。

显示吸收峰的光谱图对比；化学成分分析。
图5：捕获前文库的Bioanalyzer电泳图谱。 接头二聚体在约128 bp处表现为一个尖锐的峰。(A) 该电泳图中存在过量的接头二聚体。(B) 该图谱中接头二聚体水平处于可接受范围。两条图谱均显示出轻微过量扩增的迹象，但这不会影响ImmunoPrism检测的进行。请点击此处查看该图的高清版本。

在测序前完成本方案后，需再次通过数字电泳对最终文库进行评估。由FFPE RNA构建的文库通常比由完整RNA构建的文库具有更小的平均片段分布。对于完整RNA样本，所得电泳图谱应类似于图6（RIN = 9.5）；对于降解或FFPE RNA样本，所得电泳图谱应类似于图7（DV200 = 36）。

电泳图；毛细管电泳结果；DNA片段分析；峰强度图。
图6：完整RNA样本的最终文库Bioanalyzer检测典型图谱。 最终文库在大小约为250-400碱基对（bp）处呈现为一个宽峰。 请点击此处查看该图的放大版本。

电泳结果；峰分析图；DNA片段分离；FU与bp对比。
图7：FFPE RNA样本文库的典型最终Bioanalyzer检测图谱。 由FFPE RNA构建的文库通常比完整RNA构建的文库具有更小的平均片段大小分布。请点击此处查看本图的放大版本。

如所述，本方案产生的结果可通过两种主要方式加以应用，如图8所示。

个体化及多维免疫谱分析；RNA测序；示意图；生物标志物发现。
图8：本方案的两个应用案例。 本免疫谱分析实验所产生的结果可用于两个关键的转化应用场景。（A）第一个应用案例从人实体瘤组织（包括FFPE存档样本）出发，为样本生成个体化的免疫谱。（B）当一组人源样本的数据生成后，可通过Prism Portal整合数据，生成多维生物标志物及相应的《生物标志物报告》。 请点击此处查看该图的放大版本。

为了展示上述每种应用场景，本文包含了一项小型转化研究的代表性数据21。本研究所用样本来自7名被诊断并接受治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者，均为患者自身匹配的实体瘤组织，取自治疗前和治疗后的活检样本。首先，对各个样本进行分析以生成免疫谱，例如图9所示的示例报告。

ImmunoPrism 报告图表与结果；免疫谱型分析；CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、B 细胞。
图9：NSCLC样本的个体化免疫报告示例。 Prism Portal 分析流程为每个处理的样本生成一份图形化报告，此处展示的是针对一个NSCLC实体瘤样本生成的代表性报告。(A) 报告正面以图形方式展示从FFPE组织中提取的RNA样本所含免疫细胞的组成情况。(B) 报告背面包含免疫细胞（以绝对百分比表示）和免疫逃逸基因表达水平（以每百万转录本数，即TPM表示）的表格，以及该检测的性能说明。请点击此处查看该图的放大版本。

治疗前后的免疫谱可用于理解某种疗法（本研究中为化疗或放疗）对肿瘤微环境的改变情况。图10展示了一个示例，显示单例患者在化疗前后各免疫细胞类型百分比及总免疫细胞含量的变化。

实验前后免疫细胞百分比变化；折线图；CD4+、CD8+ T细胞；免疫学研究。
图10：治疗前后结果示例。 显示来自一名非小细胞肺癌（NSCLC）患者治疗前后样本所生成的个体免疫细胞及总免疫细胞含量数据。本示例中，该患者接受了化疗方案作为治疗。 请点击此处查看该图的放大版本。

可根据临床结局或表型等标准将患者分组进行比较。例如，在图11中，非小细胞肺癌（NSCLC）研究中的样本根据治疗后疾病进展时间进行比较。一部分患者在>18个月后出现疾病复发，另一部分患者进展较快，在≤18个月内即出现进展。通过比较每个样本的中位数Δ值（治疗前与治疗后数值的差异），以识别潜在的疾病进展生物标志物。

不同年龄组免疫细胞百分比柱状图；CD4、CD8 T细胞、B细胞、单核细胞
图11：临床结局比较示例。 通过计算匹配的非小细胞肺癌治疗前与治疗后样本中免疫细胞百分比的定量变化，得出并报告为“delta”值。以黄色突出显示的部分表明生存状态之间的明显信号变化。蓝色条形表示中位 delta 值 >疾病进展前18个月，橙色条形表示疾病进展前≤18个月的中位delta值。 请点击此处查看该图的放大版本。

最后，可使用类似的样本分组，专门分析治疗前样本，通过 Prism Portal 生成生物标志物报告，以识别预测性生物标志物。如图12所示，样本分组由与上述相同的临床表型（疾病进展）定义。在此示例中，两个免疫逃逸基因被鉴定为样本分组之间具有统计学显著差异的区分因子（CD47 和 OX40，见图12A下图）。本例中，由于单个基因生物标志物本身已具有稳健性且统计学意义明确，多维生物标志物并未带来显著的额外预测价值（即图中右上角柱状图标注的 ImmunoPrism，见图12B）。报告背面汇总了完整的数据表格，包括该检测中全部18种分析物的结果、统计分析以及简要的方法学概述。

显示分析物性能数据图表的 ImmunoPrism 生物标志物报告，突出其预测准确性。
图12：非小细胞肺癌样本的生物标志物报告示例。 生物标志物发现流程可生成单个生物标志物的可视化报告以及基于机器学习的多维生物标志物报告，并附有详细的统计信息。（A）在本研究中，该流程鉴定出两个具有统计学意义的单个生物标志物（CD47 和 OX40），可用于界定18个月时间阈值下的疾病进展。（B）报告背面包含方法细节及完整结果。请点击此处查看该图的高清版本。

补充表 1：试剂盒材料。 列出了 ImmunoPrism 试剂盒中包含的材料清单，以及制造商说明书中的对应货号。其他所需设备和材料详见材料表。请访问 https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/ 获取安全数据表（SDS）。请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。

补充表 2：PCR 仪程序。 本方案中引用的推荐 PCR 仪程序汇总如下，便于编程设置。请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。

补充表 3：测序索引指南。 列出了试剂盒中提供的索引引物；每个反应中加入一种独特的引物，用于测序后的数据拆分。同时也提供了推荐的低通量多重组合。请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。

讨论

该实验方案需要20 ng完整RNA或40 ng高度降解的（FFPE）RNA。RNA样品应不含DNA、盐类（如Mg2+或硫氰酸胍盐）、二价阳离子螯合剂（如EDTA、EGTA、柠檬酸盐）或有机溶剂（如苯酚和乙醇）。不建议对DV200 <20%的RNA样品继续操作。强烈推荐使用试剂盒内的对照RNA，因为这些对照可在从文库构建到数据分析的整个流程中评估实验性能。

本方案设计使用0.2 mL的PCR条形管进行操作。如需要，也可使用96孔PCR板中的孔进行实验。只需将96孔PCR板的孔替代方案中所有提及PCR管或条形管的部分即可。仅可使用透明孔的PCR板，因为在磁珠纯化和洗涤步骤中，必须通过肉眼确认磁珠完全重悬。

在整个实验过程中，除非另有说明，所有试剂均需保持冷冻或置于冰上。试剂未完全解冻前不得使用。使用前务必充分混匀所有试剂。

使用前将酶保存在 -20 °C，使用后应立即放回 -20 °C。仅使用分子级无核酸酶的水；不建议使用经 DEPC 处理的水。移液混匀时，应轻柔地反复吸打至少总体积的 50%，直至溶液充分混匀。所有含有酶的预混液均需通过移液器混匀。使用涡旋振荡器混匀酶溶液可能导致酶变性，影响其活性。在磁珠纯化过程中，应使用分子级乙醇新鲜配制的 80% 乙醇溶液。使用非新鲜配制的乙醇溶液可能导致得率降低。避免过度干燥磁珠，否则会降低洗脱效率（过度干燥的磁珠外观会出现裂纹）。

如步骤10所述，需向每个反应中加入独特的索引引物。根据这些索引的序列，在低水平多重测序中，某些索引组合为最优选择。测序后对数据进行去多重化（demultiplexing）时，必须提供这些索引的序列信息。索引序列及推荐的多重组合详见补充表3。在该步骤中需注意，推荐的PCR循环次数取决于所用RNA的质量，可能需要进行一定的优化以避免PCR过度扩增。对于ImmunoPrism完整对照RNA及其他高质量RNA，建议从10个PCR循环开始优化；对于ImmunoPrism FFPE对照RNA及其他高度降解/FFPE来源的RNA，建议从15个PCR循环开始优化。建议使用代表待分析样本类型的RNA制备测试文库，以优化PCR循环数。应采用能够稳定产生足够捕获前文库产量（>200 ng）的最低PCR循环次数。若Bioanalyzer图谱中出现约1000 bp的次要峰，则提示存在过度扩增现象（图4）。应尽量减少过度扩增，但若存在较小的次要峰，不会影响检测结果。

为尽量减少样品损失并避免更换离心管，如果您的真空浓缩仪允许，第13步可在PCR管、条形管或96孔PCR板中进行，而无需使用1.5 mL微量离心管。许多真空浓缩仪可移除转子，从而便于条形管或板放入真空腔内。随后可使用含水干燥模式进行真空浓缩，无需离心。具体操作请参考您所用真空浓缩仪的使用说明书。若样品在条形管或96孔板中被完全干燥，则杂交步骤可在同一容器中直接进行。

在步骤17中，务必每隔10-12分钟涡旋一次，以提高磁珠捕获效率。混匀时应小心握住温育条带管的管盖，防止管子打开。

步骤18中所述的洗涤步骤对于避免非特异性污染至关重要，必须严格遵循。每次洗涤时务必彻底重悬磁珠，完全去除洗涤缓冲液；在使用洗涤缓冲液2进行洗涤时，需将样品转移至新的八联管中（步骤18.6.5）。确保链霉亲和素磁珠在整个孵育过程中始终保持完全重悬状态。液体溅至管盖不会对捕获效果产生负面影响。在室温洗涤过程中，可使用微孔板涡旋振荡器在整个两分钟孵育期间持续振荡样品，以利于磁珠重悬。切勿让链霉亲和素磁珠干燥。如有需要，可适当延长在缓冲液中的孵育时间，以防止磁珠干燥。若使用多个八联管，每次洗涤时应一次只处理一个八联管，其余八联管置于热循环仪中静置，这有助于避免磁珠过度干燥或操作仓促，从而导致重悬不充分或其他不理想的操作。对于初次使用者，不建议同时处理超过8个文库反应。

目前的免疫谱分析技术提供了一系列信息——从需要大量解读的数千个数据点（如RNA测序）到单个离散数据点（单重免疫组化）。本文所述方案介于两者之间，其研究范围较为集中，可实现高灵敏度，但仅捕获一部分临床上相关的转录组数据。由于采用的是总RNA提取方法，该方案无法提供有关免疫细胞与肿瘤微环境之间空间关系的信息，但可通过结合成像技术来补充这一信息。该方案生成的数据具有广泛的应用前景，因为关于癌症作为一种疾病的基本生物学特性以及正在开发的治疗方法，仍有许多待探索之处。如代表性结果所示，个体化免疫报告有助于理解患者免疫谱在疾病进展或治疗等事件发生时可能发生的改变。尽管本文展示的结果仅提供了部分示例性应用场景，但其他应用也同样切实可行，例如探究治疗手段的作用机制，以及识别与无进展生存期和总生存期等临床结局相关的潜在生物标志物。在将该方案用于生物标志物发现研究时，必须注重良好的实验设计，确保分析人群的同质性，纳入足够数量的样本以保证统计学效力，并充分考虑潜在的偏倚来源。由于该检测方法具有目标明确、流程简化的特性，一旦发现有效的生物标志物，未来有望实现其临床验证及后续应用。

披露

所有作者均受雇于 Cofactor Genomics, Inc.，该公司开发并生产本文所使用的 ImmunoPrism 试剂盒及生物信息学工具。ImmunoPrism 检测试剂盒仅用于科研用途，不适用于诊断性操作。

致谢

作者希望感谢 TriStar Technology Group 提供代表性结果所用的生物样本，同时感谢 Cofactor Genomics 公司全体分子、分析、产品和商业团队在技术专长和相关支持方面的贡献。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 mL PCR 8管排USA Scientific1402-2700USA Scientific 0.2 mL PCR 8管排
200 proof 乙醇MilliporeSigmaEX0276-1实验当天用无核酸酶水配制80%乙醇
96孔热循环仪BioRad1861096
固相可逆固定化（SPRI）磁珠Beckman-CoulterA63882Agencourt AMPure XP – PCR纯化磁珠
数字电泳芯片与试剂盒Agilent Technologies5067-4626Agilent 高灵敏度DNA芯片与试剂盒
数字电泳系统Agilent TechnologiesG2939AAAgilent 2100 电泳生物分析仪
链霉亲和素磁珠ThermoFisher Scientific65306Dynabeads M-270 链霉亲和素磁珠
ImmunoPrism试剂盒 – 24反应Cofactor GenomicsCFGK-302Cofactor ImmunoPrism 免疫分析试剂盒 – 24反应
人Cot-1 DNAThermoFisher Scientific15279011Invitrogen品牌
磁力分离架Alpaqua/InvitrogenA001322/12331D96孔磁力环架
微量离心机Eppendorf22620701
微量离心管USA Scientific1415-2600USA Scientific 1.5 mL低吸附微量离心管
NextSeq550IlluminaSY-415-1002本方案可使用任意Illumina测序仪
无核酸酶水ThermoFisher ScientificAM9937
Prism提取试剂盒Cofactor GenomicsCFGK-401Cofactor Prism FFPE提取试剂盒 – 24样本
纯化RNA--从人组织样本中纯化获得
荧光计ThermoFisher ScientificQ33226Qubit 4系统
荧光检测管AxygenPCR-05-C0.5 mL薄壁PCR管配平盖
高灵敏度荧光检测试剂盒Life TechnologiesQ32854Qubit dsDNA HS检测试剂盒
真空浓缩仪Eppendorf22820001VacufugePlus
涡旋混合器VWR10153-838
水浴锅或加热金属块VWR/USA ScientificNA/2510-1102VWR水浴锅/USA Scientific加热金属块

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