利用结构DNA改变分析和患者来源异种移植模型测试癌症靶向治疗

摘要

本文介绍了一种基于肿瘤基因组特征选择靶向治疗方案并评估其疗效的实验流程。该方案描述了结构型DNA重排的鉴定与验证、将患者肿瘤组织移植至小鼠体内，以及对相应药物治疗反应的检测方法。

摘要

本文介绍了一种整合性方法，用于评估靶向治疗的疗效，该方法结合了下一代测序技术、治疗靶点分析以及利用患者来源的异种移植模型（PDX）进行药物反应监测。该策略以卵巢肿瘤为例进行了验证。采用配对末端下一代测序（MPseq）方案识别结构变异，并进一步分析其中可能具有靶向治疗潜力的变异。将人类肿瘤移植至免疫缺陷小鼠体内，随后根据基因组分析结果选择相应药物进行治疗。结果显示，PDX模型中观察到的治疗反应与预测结果具有良好的相关性。该方法可用于评估联合治疗方案的疗效，并有助于为复发性癌症患者提供个体化治疗，特别是在标准治疗失败、需要超说明书使用药物的情况下。

引言

患者来源的异种移植模型（PDX）是通过将患者的肿瘤组织植入免疫缺陷小鼠体内而建立的，现已成为一种强大的临床前模型，有助于实现个体化抗癌治疗。PDX模型已成功应用于多种人类恶性肿瘤，包括乳腺癌和卵巢癌、恶性黑色素瘤、结直肠癌、胰腺导管腺癌以及非小细胞肺癌^1,2,3,4,5。肿瘤组织可进行原位或异位移植。原位移植被认为更准确但技术难度较高，其将肿瘤组织直接移植至肿瘤来源器官。由于肿瘤处于“天然”的微环境，这类模型被认为能更精确地模拟原始肿瘤的组织学特征^6,7。例如，将肿瘤组织原位移植至小鼠卵巢囊中，可导致肿瘤向腹腔扩散并产生腹水，这与卵巢癌的典型表现一致⁸。类似地，将乳腺肿瘤移植至胸部而非腹部乳腺组织，会影响PDX模型的建立成功率及肿瘤行为⁹。然而，原位模型通常需要复杂的影像系统来监测肿瘤生长。实体瘤的异位移植通常通过将组织植入小鼠皮下侧腹部位实现，该方法便于监测肿瘤生长，且成本较低、耗时较短

方案

根据梅奥诊所机构审查委员会（IRB）批准的方案，在减瘤手术期间收集了签署知情同意书的卵巢癌患者的鲜活组织。本方案中使用的所有动物实验操作和处理均经梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循动物护理指南。

1. 配对末端测序及分析

注意：Mate pair（MPseq）测序必须使用新鲜或速冻组织。石蜡包埋材料不适用，因其含有断裂的DNA。

1. 从冷冻的肿瘤组织中分离DNA。使用从手术材料或活检获得的原始人类样本³⁶。
2. 使用1000 ng DNA构建MPseq文库，并在下一代测序仪上以每泳道两个样本进行测序（参见材料表）³⁶。
3. 利用一组算法分析数据，以检测大片段染色体异常（缺失、插入、扩增、倒位和易位），方法如前所述^36,37。

2. 治疗靶点的选择

1. 使用开放获取的 Panda 工具（通路与注释）或类似工具来识别可靶向的改变（http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda）。 ....

结果

根据机构审查委员会（IRB）的指导原则，收集减瘤手术期间切除的卵巢肿瘤组织，并用于：1）基因组学表征分析，以及 2）移植至免疫缺陷小鼠体内（图1）。采用配对末端测序方案^36,37 鉴定DNA中的结构变异，包括缺失、扩增和拷贝数增加。一个代表性基因组图谱展示了某一肿瘤（编号为OC101）中基因组改变的整体情况，如 图2 所示。该肿瘤属于高级别浆液性亚型，典型特征为存在多个拷贝数增加（蓝色线条）和缺失（红色线条），表明基因组高度不稳定；同时还观察到染色体水平的丢失与获得，提示存在非整倍体现象。在高级别浆液性亚型肿瘤中，通常可检测到总计300–700个基因组变异⁴⁵。进一步分析发现，其中少数DNA变异可能可通过临床上已有药物进行靶向干预。在OC101肿瘤中，优先级最高的可干预变异是位于17号染色体上涉及ERBB2的扩增（.......

讨论

我们描述了在PDX模型中开展“临床试验”所采用的方法和方案，该方法利用基因组测序获得的肿瘤分子特征，以确定最适合测试的药物。目前有多种测序平台可用于原发性肿瘤的基因组表征，包括全基因组测序、RNA测序（RNAseq）以及定制基因 panel。对于高级别浆液性卵巢癌，MPseq在识别结构变异、DNA重排和拷贝数改变方面尤为有用，因为此类肿瘤表现出高度的基因组不稳定性。MPseq平台的第二个优势在于其覆盖整个基因组，但成本显著低于其他综合性测序技术。然而，MPseq不适合检测点突变，因其碱基覆盖深度不足，仅能达到8–10x。单独使用MPseq进行肿瘤基因组表征的一个局限性在于，肿瘤中可能存在复杂的聚集性染色体重排，而对此类重排的分析无法预测受影响目标基因的表达情况。MPseq检测到的某个连接位点可能通过PCR在DNA水平上验证为潜在的融合基因，但由于移码突变或启动子区域的小片段缺失和插入，该融合基因可能并不表达。类似地，对于潜在治疗靶点的染色体获得和扩增，应通过RNA或蛋白质水平进行仔细评估和验证，以确保目标基因的实际表达。

尽管肿瘤在小鼠体内传代数代后其分子组成在很大程度上得以保留，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3M Vetbond	3M, Co.	1469SB
抗AKT抗体	Cell Signaling Technologies, Inc.	9272
抗GAPDH抗体(G-9)	Santa Cruz Biotech. Inc.	sc-365062
抗MAPK抗体	Cell Signaling Technologies, Inc.	9926
抗磷酸化AKT抗体	Cell Signaling Technologies, Inc.	9271
抗mTOR抗体	Cell Signaling Technologies, Inc.	2972
抗磷酸化mTOR抗体	Cell Signaling Technologies, Inc.	2971
抗磷酸化S6抗体	Cell Signaling Technologies, Inc.	4858
抗Rictor抗体	Cell Signaling Technologies, Inc.	2114
抗S6抗体	Cell Signaling Technologies, Inc.	2217
Captisol	ChemScene, Inc.	cs-0731
卡铂	NOVAPLUS, Inc.	61703-360-18
DMEM	Mediatech, Inc.	10-013-CV
Easy-A Hi-Fi PCR克隆酶	Agilent, Inc.	600404-51
润滑剂	Cardinal Healthcare	82-280
Matrigel	Corning, Inc.	356234
McCoy's培养基	Mediatech, Inc.	10-050-CV
MK-2206	ApexBio, Inc.	A3010
MK-8669	ARIAD Pharmaceuticals, Inc.	AP23573
Nair敏感肌肤脱毛膏	Church & Dwight Co.	Nair Hair Remover Shower Power Sensitive
NOD/SCID小鼠	Charles River, Inc.	NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl
紫杉醇	NOVAPLUS, Inc.	55390-304-05
PEG400	Millipore Sigma, Inc.	88440-250ML-F
Perjeta	Genetech, Co.	Pertuzumab
利妥昔单抗	Genetech, Co.	Rituxan
RPMI1640	Mediatech, Inc.	10-040-CV
SCID小鼠	Harlan Laboratories, Inc.	C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg
SLAx 13-6MHz线阵探头	FUJIFILM SonoSite, Inc	HFL38xp
SonoSite S系列超声设备	FUJIFILM SonoSite, Inc	SonoSite SII
吐温80	Millipore Sigma, Inc.	P4780-100ML