小鼠胚胎细胞的多路复用单细胞mRNA测序分析

摘要

在这里，我们提出了一种多路复用单细胞mRNA测序方法，用于分析小鼠胚胎组织中的基因表达。基于滴滴的单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）方法与多路复用策略相结合，可以同时分析来自多个样品的单个细胞，从而显著降低试剂成本并最大限度地减少实验批次效应。

摘要

单细胞mRNA测序在过去几年中取得了显著进展，已成为发育生物学领域的重要工具。它已成功用于识别稀有细胞群、发现新的标记基因以及解码空间和时间发育信息。单细胞方法也在过去两到三年中从基于微流体的Fluidigm C1技术发展到基于液滴的解决方案。在这里，我们以心脏为例，演示如何使用基于滴的scRNA-Seq方法分析小鼠胚胎组织细胞。此外，我们还将两种策略集成到工作流中，以在单个实验中分析多个样本。使用一种集成方法，我们同时从 8 个心脏样本中剖和分析了 9，000 多个细胞。这些方法将有价值的发育生物学领域，提供一个具有成本效益的方法，同时分析来自不同遗传背景，发育阶段或解剖位置的单个细胞。

引言

在胚胎发育期间，每个细胞的转录特征因细胞群而异。虽然单分子原位杂交可用于可视化少量基因¹的表达，但单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）提供了一种无偏见的方法来说明单个细胞中基因的全基因组表达模式。自2009^年首次出版以来，scRNA-Seq已应用于研究多个发育阶段的多个组织，在近年^3，4，5。此外，由于人类细胞图集最近启动了以发育为重点的项目，预计在不久的将来将生成更多来自人类胚胎组织的单细胞数据。

心脏作为发育的第一器官在胚胎发育中起着至关重要的作用。心脏由多种细胞类型组成，每种细胞类型的发育在时间和空间上受到严格调控。在过去几年中，心脏细胞在早期发育阶段的起源和细胞系一直以⁶为特征，这为了解先天性心脏病发病机制以及开发更先进的方法刺激心肌细胞再生提供了巨大的有用的导航工具^。

scRNA-Seq在最近几年经历了迅速的扩张，8、9、10。随着新开发的方法，单细胞实验的设计和分析已经变得更加可实现11，12，13，14。这里介绍的方法是基于液滴溶液（见材料表^）15，16的商业程序。该方法在微流体控制系统的控制下，在油水乳液液滴中捕获电池和一组唯一条形码的珠子。细胞加载到液滴的速率极低，因此大多数液滴乳液只含有一个细胞^17。该程序的巧妙设计来自单细胞分离成滴乳液，与条形码同时发生，这使得使用RNA-Seq在异质种群上对单个细胞进行并行分析。

多路复用策略的整合是传统单单元工作流程^13、14的重要补充之一。这种添加在丢弃细胞双子项，降低实验成本，并消除批处理效应^18，19非常有用。基于脂质的条形码策略和基于抗体的条形码策略（见材料表）是两种最常用的多路复用方法。特定条形码用于在这两种方法中标记每个样本，然后混合标记的样本以进行单个单元捕获、库制备和排序。之后，通过分析条形码序列（图1）19，可以分离集合测序数据。但是，这两种方法之间存在显著差异。基于脂质的条形码策略基于脂质修饰寡核苷酸，尚未发现任何细胞类型偏好。而基于抗体的条形码策略只能检测出表达抗原蛋白^{的细胞19、20。}此外，染色脂质大约需要10分钟，而染色抗体需要40分钟（图1）。此外，脂质修饰寡核苷酸比抗体结合的寡核苷酸便宜，但在撰写本文时没有市售。最后，基于脂质的策略可以在一个实验中多路复用96个样本，但基于抗体的策略目前只能多路复用12个样本。

在单个实验中，建议多路复用的细胞数应低于2.5 x 10^4，否则，将导致高百分比的细胞双子数和潜在的环境mRNA污染。通过多路复用策略，单个细胞捕获、cDNA生成和多个样品的库制备成本将降低到一个样本的成本，但测序成本将保持不变。

方案

动物程序符合匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）。

1. 小鼠胚胎心脏解剖和单细胞悬浮准备

注:此步骤可能需要几个小时，具体取决于要解剖的胚胎数量。

1. 为了获得E18.5胚胎心脏，通过_CO2给给使怀孕的CD1小鼠安乐死。使用剃须刀去除腹部区域不需要的头发，用70%乙醇对皮肤进行消毒。
2. 使用消毒剪刀切割腹部皮肤，仔细解剖胚胎，并迅速将它们放入冰上冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
3. 在立体显微镜下用钳子和剪刀将心脏从每个胚胎中小心地分离出来，在一个10厘米的盘子中装满了冷PBS。
   注:通过用心脏解剖肺，保持四个腔室完好无损，不要直接用手术器械抓住/拉心脏。
4. 将 +10 颗心转移到一个新的 10 厘米的盘中，里面装满了冷的 PBS，并将心脏微碎到左心房、右心房、左心室和右心室。
   注: 假定每个样本产生超过 1 x 10⁶个细胞。我们建议从每个样本至少从 1 x 10⁵个单元格开始。
5. 将4个腔室组织中的每一个转移到1.5 mL管中，并用剪刀将其切成碎片。在300 x g下离心3分钟，收集组织。
6. 吸洗上清液后，在每个管中加入1 mL的0.25%胰蛋白酶/EDTA，在37°C水浴中孵育10分钟。使用P1000移液器轻轻上下7-8次。
7. 如果胚胎阶段早于E11.5，加入10mg/mL胶原酶A/B混合物的1mL，并在37°C孵育10-20分钟。
8. 将细胞转移到15 mL管中，加入8 mL汉克的平衡盐溶液（HBSS）来稀释酶。以300 x g旋转细胞5分钟，将细胞悬浮在1mL的PBS中，并将其转移到1.5 mL管中。通过40μm细胞过滤器过滤细胞。
9. 从每个样品中抽取15μL的体积，用相同量的0.04%试盘蓝混合。在细胞计数室上加载，并在单元格计数器中计数单元格。
   注:要生成高质量的结果，建议细胞活力高于 95%。

2. 单单元复用条形码

注: 此步骤至少需要 40 分钟，具体取决于处理的样本数量。预放大步骤（步骤 2.11 到 3.11）需要使用 RNase 去污溶液处理的清洁工作台区域，放大后步骤需要单独的清洁工作台区域（3.11 之后的步骤）。

1. 基于脂质的条形码程序（可选程序 1）
   1. 根据细胞浓度，每个样本保持少于5 x 10⁵个细胞。确保细胞悬架没有碎屑和细胞聚集物。
   2. 为每个样品准备 2 个 μM 锚点/条形码库存溶液和 2 个 μM 共锚库存溶液（表 1）。
      注:主播和共同锚由Zev J. Gartner博士实验室赠送。为了合成这些脂质修饰寡核苷酸，DNA序列与脂肪酸结合在固体支持上，并通过逆转相高性能液相色谱（HPLC）18、19进行纯化。
   3. 用PBS洗涤细胞两次，在300 x g下收集细胞5分钟，在180μL的PBS中悬浮细胞。
   4. 加入20 μL的锚/条形码库存溶液，上下轻轻移液混合。在冰上孵育5分钟。
   5. 加入20 μL的共锚股票溶液，上下轻轻移液混合，然后在冰上孵育5分钟。
   6. 加入1 mL的冷PBS，带1%BSA，在300 x g下加入离心机，在4°C下5分钟。在 PBS 中用冰冷的 1% BSA 至少再洗 2 次。
   7. 将所有样品混合在一起，通过40μm细胞过滤器进行过滤。计数细胞，并保持细胞悬浮在冰上使用在第3节。
2. 基于抗体的条形码程序（可选程序2）
   1. 将每个样品（从步骤1.8）的1 x 10^6-2x 10⁶个细胞在300 x g下离心5分钟，并将其悬浮在100μL染色缓冲液中（表1）中的1.5 mL低结结管。
   2. 加入10μL Fc阻断试剂，在4°C下孵育10分钟。
   3. 在2-8°C下在14，000 x g下离心10分钟，制备抗体（见材料表）。
   4. 将1μg的每个寡聚抗体加入50μL的细胞染色缓冲液中，使抗体染色溶液^20.在每个样品管中加入一个抗体染色溶液。在4°C下孵育30分钟。
   5. 用1 mL的PBS清洗细胞3次，在4°C下在350 x g下旋转5分钟。
   6. 将所有样品以所需的比例在1 mL的染色缓冲液中汇集，在4°C下以350 x g旋转5分钟。
   7. 以适当的浓度（高达1，500个细胞/μL）在PBS中重新悬浮细胞，并通过40μm细胞过滤器过滤细胞。立即继续下一步。

3. 滴生成和 mRNA 逆转录

注:此步骤需要大约 90 分钟进行多路复用反应。

1. 将凝胶珠（见材料表）与室温平衡30分钟。从凝胶乳化（GEMs）试剂盒中取下试剂（见材料表），并保持在指示温度。
2. 将芯片 B 组装到芯片支架中（参见材料表）。
3. 在第1排未使用的井中加入75μL的50%甘油溶液;第 2 行中 40 μL;第 3 行中 280 μL。请勿在芯片顶行的任何回收井中添加甘油。
4. 根据表1在冰上准备主混合物。根据细胞悬浮液体积计算器表^17，加入适当体积的细胞悬浮液和无核酸酶水，以主混合，并轻轻移液混合。将 75 μL 的电池混合物分配到第 1 行中样品底部中心，而不会引入气泡。
5. 使用涡旋适配器将凝胶珠涡涡30s，并在第2排凝胶珠的底中心缓慢地将40μL的凝胶珠分到凝胶珠的底部中心，而不会引入气泡。
   注意:在添加细胞和凝胶珠之间等待30s以避免润湿失败至关重要。
6. 对于第 3 排的隔断油井，通过井的侧壁分配 280 μL 的隔断油。
   注: 装载少于 270 μL 的分区油将导致生成 GEM 异常。
7. 将垫片连接到芯片上，不要向下压压垫片并保持水平，以免弄湿垫片。
8. 将组装的芯片与铬控制器中的垫片一起加载，并运行铬单单元 B 程序（参见材料表），程序完成后立即执行下一步。
9. 拿出芯片并丢弃垫片。将盖子折回以在 45° 处露出井，检查液位，确保不存在堵塞。
10. 从恢复的最低点缓慢吸出 100 μL 的 GE，并检查 GEM 的均匀性。将 GEM 分配到新的聚合酶链反应 （PCR） 管的冰上，移液器尖端对管的侧壁。
    注:如果观察到过量水层，建议重新制备样品。重要的是，当 GEM 仍在移液器提示中时，拍摄混合物的照片。此图片可以判断是否存在润湿故障、部分乳化的 GEM 和试剂堵塞。该照片还可用作证据，以从试剂公司获得更换试剂和芯片的补偿。
11. 将管子放入热循环器中，执行反向转录程序（表2）。
    注: 请在此处停止或继续执行下一步。PCR 产品可在 -20°C 下存储长达一周。

4. cDNA扩增

注:此步骤大约需要 150 分钟。

1. 后单细胞逆转录清理
   1. 从 GEM 试剂盒中拿出 cDNA 扩增试剂（参见材料表），并将其保持在指示温度。
   2. 在室温下向样品中加入125μL的回收剂，以获得双相混合物。不应观察到不透明液体，避免移液或涡流混合物。
   3. 等待 60 s 后，从管底部缓慢取出 125 μL 的回收剂。
   4. 涡旋磁珠（见材料表）彻底30s，并立即使用它准备珠清理混合物（表1）。试剂应按顺序添加。
   5. 涡珠清除混合物，向样品中加入200μL。将混合物移液10次，然后在室温下孵育10分钟。
   6. 按表 1中列出的顺序添加试剂以制备洗脱溶液，并按如下方式洗脱 cDNA。
      1. 将样品放在磁铁（高位置）上（参见材料表），直到溶液清除，然后取出上清液。
      2. 在颗粒中加入 200 μL 的 80% 乙醇。等待 30 s，然后取出乙醇。
      3. 重复步骤 4.1.6.2 再重复 2 次。离心，并放置在磁铁上（低位置）。小心地取出剩余的乙醇，并晾干2分钟。
         注:不要超过空气干燥超过2分钟，否则洗脱效率会降低。
      4. 从磁铁中取出样品。加入35.5 μL的洗脱溶液和移液器混合15次。在室温下孵育2分钟。
      5. 将样品放在磁铁上（高位置），直到溶液清除。将 35 μL 样品转移到新的管条中。
         注:此纯化程序也用于步骤 4.2.1.6、4.2.2.3、5.8、6.1.10 和 6.2.6。注意磁珠的浓度和EB缓冲液/超纯水的体积，用于在每一步洗出样品。
   7. 使用自动电泳仪器^21（见材料表）量化洗脱的cDNA的大小、浓度和完整性（图2）。
2. cDNA扩增
   1. 使用基于脂质的条形码策略进行cDNA扩增（可选程序1）
      1. 在冰上制备扩增反应混合物 （表 1） .
      2. 将扩增反应混合物加入35 μL的cDNA样品中（从步骤4.1.6.7开始）。移液混合物，并短暂离心。按照cDNA扩增程序在热循环器中孵育混合物（表2）。
      3. 彻底涡旋后，将120μL的选择试剂和100μL的超纯水加入100μL的样品中，以获得0.6倍浓度的精选试剂（见材料表）。将混合物移液15次。
      4. 在室温下孵育5分钟，然后将样品放在磁铁上，直到溶液变清楚。
         注:珠分数中的内源性cDNA和多路复用条形码cDNA位于上清。
      5. 在步骤 6.1 中将上液转移到 1.5 mL 低绑定管中，用于多路复用条形码 cDNA 库结构。
      6. 按照 4.1.6 中的步骤清洁内源性 cDNA，并用 40 μL 的 EB 缓冲液将其洗脱。
      7. 在自动电泳仪器上运行1μL的纯化cDNA样品（参见材料表），以分析/量化cDNA。
      8. 将10μL的cDNA加入新的PCR管中，用于内源库结构。
         注: 请在此处停止或继续执行下一步。其余样品可在-20°C中储存长达4周，以便在需要时生成其他库。
   2. 基于抗体的条形码策略中的cDNA扩增（可选程序2）
      1. 在50μL的扩增反应混合物中加入2pmolHTO和ADT添加剂引基和15μL的cDNA引基剂（表1），用cDNA扩增程序执行cDNA扩增（表2）。
      2. 使用 0.6 倍选择试剂分离内源性 cDNA（珠子分数）和多路复用条形码 cDNA（上清）。请记住保存上清液，以在步骤 6.2 中执行条形码库构造。
      3. 按照 4.1.6 中的步骤，净化和洗脱内源转录本 cDNA，对库进行质量控制 （QC），并将 10 μL 的等分插入新的 PCR 管中，用于内源库结构。

5. 内生抄本库准备

注:此步骤大约需要 120 分钟。

1. 将基因表达库结构试剂分别保存在库试剂盒（见材料表）的指定温度下。
2. 在冰上准备碎裂混合物（表1），移液器进行短暂混合和离心机。
3. 将 25 μL EB 缓冲液加入 10 μL 纯化的 cDNA 样品（从步骤 4.2.1.8 或 4.2.2.3 起），然后将新制备的 15 μL 分片混合物添加到样品中，在冰上将混合物移液 15 次，然后短暂地在离心机上移液。
4. 将样品转移到预冷却的热循环器中，并启动 PCR 程序进行碎裂、端部维修和 A 尾化（表 2）。
5. 涡旋选择试剂以悬浮磁珠，并连续使用0.6倍和0.8倍选择试剂，根据用户指南^17、22进行双面尺寸选择。使用 50 μL 的 EB 缓冲液来洗脱 DNA。
6. 准备适配器结扎混合物（表1），然后彻底移液混合物，并短暂地离心。
7. 将50μL的适配器结扎混合物加入50μL样品中，移液器再次混合15次，然后短暂离心。在热循环器中根据协议执行适配器连接（表 2）。
8. 使用 0.8x 选择试剂净化结扎产物，并使用 30 μL EB 缓冲液洗脱纯化样品（参见步骤 4.1.6）。
9. 制备样品指数PCR混合物（表1），并将60μL添加到纯化样品中。将10μL的样品指数加入样品中，移液器上下混合5次，并短暂离心，按照样品指数协议（表2）在热循环器中孵育。
   注: 请在此处停止或继续执行下一步。如果使用多个井，请为每个井选择一个特定的样本索引（参见材料表）。请记住记录用于每个井的索引 ID，并确保多路复用排序运行中没有重叠。
10. 先后使用0.6倍和0.8倍选择试剂进行双面尺寸选择，获得35μL的纯化内源细胞库^DNA17。
11. 在测序前对内源性细胞库进行QC（图2）。

6. 多路复用样本条形码cDNA库的准备

注:此步骤至少需要 120 分钟。

1. 基于脂质多路复用策略的样本条形码库生成（可选程序 1）
   1. 从步骤 4.2.1.5 向条形码 cDNA 添加 520 μL 选择试剂和 360 μL 异丙醇，以获得 3.2 倍选择试剂浓度。将混合物移液10次，在室温下孵育5分钟。
   2. 将管子放在磁性机架上，等待溶液清除。然后丢弃上清液。
   3. 使用 500 μL 的 80% 乙醇在磁铁上清洗珠子两次，每次洗涤后等待 30 s。
   4. 将珠子短暂离心并放置在磁铁上。用P10微移液器取出剩余的乙醇，并留下珠子2分钟。
   5. 从磁铁机架上取下管子，在 50 μL EB 缓冲液中重新悬浮磁珠。上下移液，彻底混合。在室温下孵育2分钟。
   6. 将管子返回到磁铁中，等待溶液清除。将上清液（样本条形码 cDNA）转移到新的 PCR 管中。小心不要转移任何珠子。
   7. 量化样本条形码^cDNA23的浓度。
   8. 制备脂质条形码库混合物（表1），加入3.5 ng的纯化条形码cDNA（从步骤6.1.6）和无核酸酶水，总体积为50μl。
   9. 在基于脂质的条形码库 PCR （表 2 ）之后将其保存在热循环器中。
   10. 使用1.6倍选择试剂纯化PCR产物，用25μL的EB缓冲液洗脱DNA（参见步骤4.1.6）。
   11. 使用高灵敏度DNA分析方法²⁴从初始稀释1:5（图2）对库浓度进行量化。
2. 基于抗体的多路复用策略的样本条形码库生成（可选程序 2）
   1. 将选择试剂的额外1.4倍反应体积添加到从步骤4.2.2.3获取的含有样品条形码的上清液中，以获得2倍选择试剂比。
   2. 按照 4.1.6 中的步骤，用 80% 乙醇清洗珠子，用超纯水洗去条形码 cDNA。
   3. 第二次使用 2x 选择试剂执行选择协议，并使用超纯水进行洗净。
   4. 制备抗体条形码库混合物（表1），并从最后一步加入45μL的纯化条形码cDNA。
   5. 在抗体条形码库PCR（表^2）20之后，在热循环器中孵育。
   6. 使用 1.6x 选择试剂纯化 PCR 产品，并使用 30 μL 的超纯水洗脱纯化样品（参见步骤 4.1.6）。

7. 库排序

注: 多个下一代排序平台（如 HiSeq 4000 和 NovaSeq）可用于对内源记录库和多路复用条码库进行排序。

1. 使用选择的下一代排序平台对内源抄录库和多路复用条码库进行排序。
2. 根据测序公司或测序设施专家的建议，稀释库。建议内源脚本库每个单元至少读取 20，000 次，条码库建议至少 3000 次读取。

8. 数据分析

注: 使用基于云的资源 BaseSpace 或在 UNIX 服务器上运行 bcl2fastq 包来对排序数据进行多路复用。

1. 内源转录组数据分析
   1. 使用从去复用软件生成的 fastq 数据，在市售数据分析管道上运行"mkfastq"（参见材料表），以进一步消除每个 GEM 条形码的复用。
   2. 运行"计数"以执行对齐、筛选、条形码计数和 UMI 计数。
   3. 或者，运行"aggr"以聚合单个实验中的多个排序通道。
   4. 使用"细胞浏览器"（见材料表）来可视化数据、聚类细胞、识别不同表达的基因，并生成tSNE或基因表达热图图。
   5. 或者，使用维护良好的基于 R 的平台^25（参见材料表）来规范化和缩放数据，识别不同表示的基因，并生成 tSNE/UMAP 图和基因表达热图（图 3）。
2. 多路复用条码数据分析
   1. 基于脂质的条形码策略数据分析
      1. 使用市售数据分析管道或 deMULTIplex R 包（https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq） 将样本条形码 FASTQ 文件转换为样本条形码 UMI 计数矩阵。
      2. 将条形码 UMI 计数矩阵与内源转录组数据一起加载到基于 R 的平台（参见材料表），以便进行集成分析（图 3）。
   2. 基于抗体的条形码策略数据分析
      1. 使用市售数据分析管道中的"计数"来映射条形码，通过提供库 CSV 文件和井号标签功能参考 CSV 文件。
      2. 将输出统一特征条形码矩阵（包含基因表达计数以及每个细胞条形码的特征条形码计数）加载到基于 R 的平台进行下游分析。

结果

在这项研究中，我们以小鼠胚胎心脏为例，展示如何同时进行多路复用单细胞mRNA测序，以同时处理来自器官不同部位的不同样本。E18.5 CD1 小鼠心脏被分离并解剖到左心房 （LA）、右心房 （RA）、左心室 （LV） 和右心室 （RV）。然后，心房和心室细胞使用基于脂质的条形码程序独立地进行条形码处理，并在 GEM 生成和逆转录前混合在一起。原理图概述如图1所示。我们在库构建前量化了 cDNA 浓度 （图 2A）。从标准scRNA-Seq执行多路复用scRNA-Seq的一个区别是，内源性cDNA库和样本条形码cDNA库在cDNA扩增和纯化后分别获得（步骤4.2.1和4.2.2.2）。这两个库在我们的实验中也符合条件（图2B，C）。下一代测序和数据分析随后进行了库建和质量控制。

讨论

在这项研究中，我们演示了分析单细胞转录配置文件的协议。我们还在scRNA-Seq工作流程中提供了两种可选方法，用于多路复用样品。这两种方法已证明在各种实验室是可行的，并提供了解决方案，运行一个经济高效和无批次效果的单细胞实验^18，26。

在通过协议时，应仔细执行几个步骤。理想的单细胞悬浮液应具有>90%的活细胞，细胞密度也应在²⁷特定范围内。获得高质量的细胞以最小化细胞聚集物、碎屑和纤维的存在至关重要。细胞聚合体对样品多路复用有负面影响，并存在堵塞滴产生机¹⁷的潜在风险。一般来说，30-40 μm细胞滤网是去除大块和碎屑，同时保留细胞样本的理想选择，因为大多数细胞在分离后会收缩到30μm以下。如果细胞直径大于30μm，建议使用单细胞核。在早期胚胎阶段，所有类型的小鼠细胞的细胞大小应小于30μm。然而，在后期阶段，心脏的心肌细胞、大脑的神经元、四肢的肌肉细胞以及一些脂肪细胞...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% Tween-20	Bio-Rad	1610781
10x 芯片支架	10x Genomics	120252 330019
10x 铬控制器	10x Genomics	120223
10x 磁分离器	10x Genomics	120250 230003
10x 涡旋适配器	10x Genomics	330002,120251
10x 涡旋夹	10x Genomics	120253 230002
4200 TapeStation 系统	Agilent	G2991AA
Agilent 高灵敏度 DNA 试剂盒	Agilent	5067-4626	匹兹堡大学健康科学测序
条形码 寡核苷酸	集成 DNA 技术	单链 DNA	25 nmol
缓冲液 EB	Qiagen	19086
CD1 小鼠	Chales River	菌株代码 022	订购的怀孕小鼠
离心机 5424R	Appendorf	2231000214
铬芯片 B 单细胞试剂盒，48 次反应	10x Genomics	1000073	在环境温度下储存
Chromium i7 多重试剂盒，96 次反应	10x Genomics	120262	储存在 -20 °C;C
铬单细胞 3' GEM 试剂盒 v3,4 反应	10x Genomics	1000094	储存温度为 -20 °C;C
铬单细胞 3' 文库试剂盒 v3	10x Genomics	1000095	储存在 -20 °;C
铬单细胞 3' v3 凝胶珠	10x Genomics	2000059	储存温度为 -80 °C;C
胶原酶 A	Sigma/Millipore	10103578001	将粉末储存在 4 °C，储存在 -20 °C 溶解
胶原酶 B	Sigma/Millipore	后 11088807001	将粉末储存在 4 °C;C，储存在 -20 °C 溶解后
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582	匹兹堡大学健康科学测序
DNA LoBind 管微量离心管、1.5 mL	Eppendorf	022431021
DNA LoBind 管微量离心管、2.0 mL	Eppendorf	022431048
Dynabeads MyOne SILANE	10x Genomics	2000048	储存在 4 °C，用于磁珠净化混合物（表 1）
DynaMag-2 磁架	Theromo Scientific	12321D
乙醇，纯（200 标准，无水）	Sigma	E7023-500mL
Falcon 15mL 高透明度 PP 离心管	康宁 Cellgro	14-959-70C
Falcon 50mL 高透明度 PP 离心管	康宁 Cellgro	14-959-49A
胎牛血清，合格，美国	费舍尔科学	26140079	Store 在 -20 °C
Finnpipette F1 多通道移液器，10-100&μ;l	Theromo Scientific	4661020N
Finnpipette F1 多通道移液器，1-10μl	Theromo Scientific	4661000N
Flowmi 细胞过滤器	Sigma	BAH136800040	孔隙率 40 &μ;m，适用于 1000 μL 移液器吸头，每包 50
甘油（甘油），50% （v/v）	Ricca Chemical Company	3290-32
HBSS，无钙，无镁	Thermo Fisher Scientific	14170112
人 TruStain FcX（Fc 受体阻断溶液）	BioLegend	422301	添加 5 &微量;每 100 万个细胞中 l 人 TruStain FcX 的含量 &l 染色体积
异丙醇 （IPA）	Fisher Scientific	A464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix （2X）	Fisher Scientific	NC0295239	Store at -20 °C，用于脂质标记的条形码文库混合物（表 1）
脂质条形码引物（Multi-seq 引物）	集成 DNA 技术	链 DNA	100 nmol
低 TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0,0.1 mM EDTA）	Thermo Fisher Scientific	12090-015
MasterCycler Pro	Eppendorf	950W
无核酸酶水 （Ambion）	Thermo Fisher Scientific	AM9937
PCR 管 0.2 ml 8 联排	Eppendorf	951010022
磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 1X，不含钙和镁	Corning Cellgro	21-040-CV
磷酸盐缓冲盐水 （PBS），含 10% 牛白蛋白（Thermo Fisher 产品替代品）	Sigma-Aldrich	SRE0036
吸管 4 包 （0.1–2.5&亩;L， 0.5-10μL， 10–100亩;L， 100–1,000&亩;L 可变容量移液器	Fisher Scientific	05-403-151
选择试剂（SPRIselect 试剂盒）	Beckman Coulter	B23318 （60ml）
模板开关寡核苷酸	10x 基因组学	3000228	储存在 -20 度;C，用于预混液（表 1）
基于抗体的条形码策略也称为细胞哈希
细胞浏览器是 Loup Cell Browser	10x Genomics		https://support.10xgenomics。com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
步骤 8.1 中的市售分析管道是 Cell Ranger	10x Genomics		https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/最新/什么是细胞
基于脂质的条形码策略也称为 MULTI-seq
维护良好的 R 平台是 Seurat V3	satijalab		https://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL 超低吸附过滤器移液器吸头	USA Scientific	1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL 超低吸附滤芯吸头	USA Scientific	1182-1730
TipOne RPT 200 ul 超低吸附滤芯吸头	USA Scientific	1180-8710
TotalSeq-A0301 抗小鼠标签 1 抗体	BioLegend	155801	0.1 - 1.0 µg 抗体 100 & 微量;每 100 万个细胞的染色缓冲液
l TotalSeq-A0302 抗小鼠 Hashtag 2 抗体	BioLegend	155803	0.1 - 1.0 µg 抗体 100 & 微量;每 100 万个细胞的染色缓冲液
l TotalSeq-A0302 抗小鼠 Hashtag 3 抗体	BioLegend	155805	0.1 - 1.0 µg 抗体 100 & 微量;每 100 万个细胞的染色缓冲液
TrueSeq RPI 引物	集成 DNA 技术	单链 DNA	100 nmol，用于脂质标记条形码文库混合物（表 1）
台盼蓝溶液，0.4%	Fisher Scientific	15250061
胰蛋白酶-EDTA （0.25%），酚红	Fisher Scientific	25200-056
通用 I5	集成 DNA 技术	单链 DNA	100 nmol