方法文章

小鼠胚胎细胞的多路复用单细胞mRNA测序分析

DOI：

10.3791/60647

⸱

2020年1月7日

 ,  , 
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们提出了一种多路复用单细胞mRNA测序方法，用于分析小鼠胚胎组织中的基因表达。基于滴滴的单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）方法与多路复用策略相结合，可以同时分析来自多个样品的单个细胞，从而显著降低试剂成本并最大限度地减少实验批次效应。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单细胞mRNA测序在过去几年中取得了显著进展，已成为发育生物学领域的重要工具。它已成功用于识别稀有细胞群、发现新的标记基因以及解码空间和时间发育信息。单细胞方法也在过去两到三年中从基于微流体的Fluidigm C1技术发展到基于液滴的解决方案。在这里，我们以心脏为例，演示如何使用基于滴的scRNA-Seq方法分析小鼠胚胎组织细胞。此外，我们还将两种策略集成到工作流中，以在单个实验中分析多个样本。使用一种集成方法，我们同时从 8 个心脏样本中剖和分析了 9，000 多个细胞。这些方法将有价值的发育生物学领域，提供一个具有成本效益的方法，同时分析来自不同遗传背景，发育阶段或解剖位置的单个细胞。

引言

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在胚胎发育期间，每个细胞的转录特征因细胞群而异。虽然单分子原位杂交可用于可视化少量基因1的表达，但单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）提供了一种无偏见的方法来说明单个细胞中基因的全基因组表达模式。自2009年首次出版以来，scRNA-Seq已应用于研究多个发育阶段的多个组织，在近年3，4，5。此外，由于人类细胞图集最近启动了以发育为重点的项目，预计在不久的将来将生成更多来自人类胚胎组织的单细胞数据。

心脏作为发育的第一器官在胚胎发育中起着至关重要的作用。心脏由多种细胞类型组成，每种细胞类型的发育在时间和空间上受到严格调控。在过去几年中，心脏细胞在早期发育阶段的起源和细胞系一直以6为特征，这为了解先天性心脏病发病机制以及开发更先进的方法刺激心肌细胞再生提供了巨大的有用的导航工具。

scRNA-Seq在最近几年经历了迅速的扩张，8、9、10。<....

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方案

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动物程序符合匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）。

1. 小鼠胚胎心脏解剖和单细胞悬浮准备

注:此步骤可能需要几个小时，具体取决于要解剖的胚胎数量。

  1. 为了获得E18.5胚胎心脏，通过CO2给给使怀孕的CD1小鼠安乐死。使用剃须刀去除腹部区域不需要的头发，用70%乙醇对皮肤进行消毒。
  2. 使用消毒剪刀切割腹部皮肤，仔细解剖胚胎，并迅速将它们放入冰上冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
  3. 在立体显微镜下用钳子和剪刀将心脏从每个胚胎中小心地分离出来，在一个10厘米的盘子中装满了冷PBS。
    注:通过用心脏解剖肺，保持四个腔室完好无损，不要直接用手术器械抓住/拉心脏。
  4. 将 +10 颗心转移到一个新的 10 厘米的盘中，里面装满了冷的 PBS，并将心脏微碎到左心房、右心房、左心室和右心室。
    注: 假定每个样本产生超过 1 x 106个细胞。我们建议从每个样本至少从 1 x 105个单元格开始。
  5. 将4个腔室组织中的每一个转移到1.5 mL管中，并用剪刀将其切成碎片。在300 x g下离心3分钟，收集组织。
  6. 吸洗上清液后，在每个管中加入1 mL的0.25%胰蛋白酶/EDTA，在37°C水浴中孵育10分钟。使用P1000移....

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结果

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在这项研究中，我们以小鼠胚胎心脏为例，展示如何同时进行多路复用单细胞mRNA测序，以同时处理来自器官不同部位的不同样本。E18.5 CD1 小鼠心脏被分离并解剖到左心房 （LA）、右心房 （RA）、左心室 （LV） 和右心室 （RV）。然后，心房和心室细胞使用基于脂质的条形码程序独立地进行条形码处理，并在 GEM 生成和逆转录前混合在一起。原理图概述如图1所示。我们在库构建前量化了 cDNA 浓度 （图 2A）。从标准scRNA-Seq执行多路复用scRNA-Seq的一个区别是，内源性cDNA库和样本条形码cDNA库在cDNA扩增和纯化后分别获得（步骤4.2.1和4.2.2.2）。这两个库在我们的实验中也符合条件（图2B，C）。下一代测序和数据分析随后进行了库建和质量控制。

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讨论

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在这项研究中，我们演示了分析单细胞转录配置文件的协议。我们还在scRNA-Seq工作流程中提供了两种可选方法，用于多路复用样品。这两种方法已证明在各种实验室是可行的，并提供了解决方案，运行一个经济高效和无批次效果的单细胞实验18，26。

在通过协议时，应仔细执行几个步骤。理想的单细胞悬浮液应具有>90%的活细胞，细胞密度也应在27特定范围内。获得高质量的细胞以最小化细胞聚集物、碎屑和纤维的存在至关重要。细胞聚合体对样品多路复用有负面影响，并存在堵塞滴产生机17的潜在风险。一般来说，30-40 μm细胞滤网是去除大块和碎屑，同时保留细胞样本的理想选择，因为大多数细胞在分离后会收缩到30μm以下。如果细胞直径大于30μm，建议使用单细胞核。在早期胚胎阶段，所有类型的小鼠细胞的细胞大小应小于30μm。然而，在后期阶段，心脏的心肌细胞、大脑的神经元、四肢的肌肉细胞以及一些脂肪细胞.......

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披露

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提交人没有利益冲突可披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢Zev J. Gartner博士实验室的大卫·帕特森和克里斯托弗·麦金尼斯，他们提供了基于脂质的条形码试剂，并就实验步骤和数据分析提出了建议。这项工作是由国家卫生研究院（HL13347202）创立的。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% Tween-20Bio-Rad1610781
10x 芯片支架10x Genomics120252 330019
10x 铬控制器10x Genomics120223
10x 磁分离器10x Genomics120250 230003
10x 涡旋适配器10x Genomics330002,120251
10x 涡旋夹10x Genomics120253 230002
4200 TapeStation 系统AgilentG2991AA
Agilent 高灵敏度 DNA 试剂盒Agilent5067-4626匹兹堡大学健康科学测序
条形码 寡核苷酸集成 DNA 技术单链 DNA25 nmol
缓冲液 EBQiagen19086
CD1 小鼠Chales River菌株代码 022订购的怀孕小鼠
离心机 5424RAppendorf2231000214
铬芯片 B 单细胞试剂盒，48 次反应10x Genomics1000073在环境温度下储存
Chromium i7 多重试剂盒，96 次反应10x Genomics120262储存在 -20 °C;C
铬单细胞 3' GEM 试剂盒 v3,4 反应10x Genomics1000094储存温度为 -20 °C;C
铬单细胞 3' 文库试剂盒 v310x Genomics1000095储存在 -20 °;C
铬单细胞 3' v3 凝胶珠10x Genomics2000059储存温度为 -80 °C;C
胶原酶 ASigma/Millipore10103578001将粉末储存在 4 °C，储存在 -20 °C 溶解
胶原酶 BSigma/Millipore后 11088807001将粉末储存在 4 °C;C，储存在 -20 °C 溶解后
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582匹兹堡大学健康科学测序
DNA LoBind 管微量离心管、1.5 mLEppendorf022431021
DNA LoBind 管微量离心管、2.0 mLEppendorf022431048
Dynabeads MyOne SILANE10x Genomics2000048储存在 4 °C，用于磁珠净化混合物（表 1）
DynaMag-2 磁架Theromo Scientific12321D
乙醇，纯（200 标准，无水）SigmaE7023-500mL
Falcon 15mL 高透明度 PP 离心管康宁 Cellgro14-959-70C
Falcon 50mL 高透明度 PP 离心管康宁 Cellgro14-959-49A
胎牛血清，合格，美国费舍尔科学26140079Store 在 -20 °C
Finnpipette F1 多通道移液器，10-100&μ;lTheromo Scientific4661020N
Finnpipette F1 多通道移液器，1-10μlTheromo Scientific4661000N
Flowmi 细胞过滤器SigmaBAH136800040孔隙率 40 &μ;m，适用于 1000 μL 移液器吸头，每包 50
甘油（甘油），50% （v/v）Ricca Chemical Company3290-32
HBSS，无钙，无镁Thermo Fisher Scientific14170112
人 TruStain FcX（Fc 受体阻断溶液）BioLegend422301添加 5 &微量;每 100 万个细胞中 l 人 TruStain FcX 的含量 &l 染色体积
异丙醇 （IPA）Fisher ScientificA464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix （2X）Fisher ScientificNC0295239Store at -20 °C，用于脂质标记的条形码文库混合物（表 1）
脂质条形码引物（Multi-seq 引物）集成 DNA 技术链 DNA100 nmol
低 TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0,0.1 mM EDTA）Thermo Fisher Scientific12090-015
MasterCycler ProEppendorf950W
无核酸酶水 （Ambion）Thermo Fisher ScientificAM9937
PCR 管 0.2 ml 8 联排Eppendorf951010022
磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 1X，不含钙和镁Corning Cellgro21-040-CV
磷酸盐缓冲盐水 （PBS），含 10% 牛白蛋白（Thermo Fisher 产品替代品）Sigma-AldrichSRE0036
吸管 4 包 （0.1–2.5&亩;L， 0.5-10μL， 10–100亩;L， 100–1,000&亩;L 可变容量移液器Fisher Scientific05-403-151
选择试剂（SPRIselect 试剂盒）Beckman CoulterB23318 （60ml）
模板开关寡核苷酸10x 基因组学3000228储存在 -20 度;C，用于预混液（表 1）
基于抗体的条形码策略也称为细胞哈希
细胞浏览器是 Loup Cell Browser10x Genomicshttps://support.10xgenomics。com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
步骤 8.1 中的市售分析管道是 Cell Ranger10x Genomicshttps://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/最新/什么是细胞
基于脂质的条形码策略也称为 MULTI-seq
维护良好的 R 平台是 Seurat V3satijalabhttps://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL 超低吸附过滤器移液器吸头USA Scientific1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL 超低吸附滤芯吸头USA Scientific1182-1730
TipOne RPT 200 ul 超低吸附滤芯吸头USA Scientific1180-8710
TotalSeq-A0301 抗小鼠标签 1 抗体BioLegend1558010.1 - 1.0 µg 抗体 100 & 微量;每 100 万个细胞的染色缓冲液
l TotalSeq-A0302 抗小鼠 Hashtag 2 抗体BioLegend1558030.1 - 1.0 µg 抗体 100 & 微量;每 100 万个细胞的染色缓冲液
l TotalSeq-A0302 抗小鼠 Hashtag 3 抗体BioLegend1558050.1 - 1.0 µg 抗体 100 & 微量;每 100 万个细胞的染色缓冲液
TrueSeq RPI 引物集成 DNA 技术单链 DNA100 nmol，用于脂质标记条形码文库混合物（表 1）
台盼蓝溶液，0.4%Fisher Scientific15250061
胰蛋白酶-EDTA （0.25%），酚红Fisher Scientific25200-056
通用 I5集成 DNA 技术单链 DNA100 nmol
核心核心 个单管

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877(2008).
  2. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods

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