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通过向大鼠关节内注射单碘乙酸诱导的骨关节炎疼痛模型

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DOI：

10.3791/60649

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2020年5月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University

本文内容

摘要

本研究描述了在大鼠中进行关节内注射单碘乙酸的方法，并讨论了由此引发的疼痛相关行为及组织病理学变化，为未来应用提供了参考依据。

摘要

目前，骨关节炎（OA）的动物模型可分为自发性模型和诱导性模型，二者均旨在模拟人类骨关节炎的病理生理变化。然而，疼痛作为骨关节炎晚期阶段的主要症状，严重影响患者日常生活，但可用于研究疼痛的模型却较为有限。单碘乙酸钠（MIA）诱导模型是目前应用最广泛的骨关节炎疼痛模型，主要应用于啮齿类动物。MIA 是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的抑制剂，可导致软骨细胞死亡、软骨退变、骨赘形成以及动物行为学的可测量变化。此外，在 MIA 诱导模型中还可检测到基质金属蛋白酶（MMP）以及促炎性细胞因子（IL-1β 和 TNF-α）的表达变化。这些改变与人类骨关节炎的病理生理状况一致，表明 MIA 能够成功诱导出具有可测量指标的骨关节炎疼痛模型。本研究旨在描述在大鼠中进行 MIA 关节内注射的方法学，并探讨由此引发的疼痛相关行为学及组织病理学改变。

引言

骨关节炎（OA）是全球最常见的关节疾病，估计影响成年人群的10-12%1。最常受累的关节是膝关节，且OA在老年人群中发病率更高，尤其是女性2。作为一种慢性疾病，OA在数十年内逐渐进展，最终导致关节功能衰竭，症状包括软骨丢失、滑膜炎症、骨赘形成、功能下降以及慢性疼痛3。根据世界卫生组织（WHO）的数据，OA在女性中是第四大常见疾病，在男性中是第八大常见疾病。到2020年，OA可能成为人类第四大致残性疾病4。然而，目前可用的OA治疗方法仅能缓解症状，并延长关节置换手术所需的时间5。

人类患者中自发性骨关节炎（OA）通常需要较长时间才会出现关节相关疼痛等临床症状6。在OA的早期阶段，疼痛通常为间歇性，随着疾病进展逐渐变得更加频繁和严重，成为患者最主要的症状7。因此，在过去半个世纪中，人们建立了大量用于研究OA疼痛的动物模型，以促进镇痛疗法的发展。OA模型传统上分为自发性模型和诱导性模型。自发性模型包括自然发生的模型和基因修饰模型，能够更接近地模拟人类原发性OA的病程8。诱导性模型通常可分为两类：1）通过手术或其他创伤诱导的创伤后OA；或 2）关节内注射软骨毒性物质或促炎性物质3。这些模型为OA的病理生理学研究奠定了基础，并极大地推动了缓解疼痛和改善功能的药物研发。

目前，用于骨关节炎（OA）建模最常用的诱导剂是单碘乙酸（MIA）。MIA 是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的抑制剂，可引起软骨基质改变、降解、软骨丢失、滑膜炎及其他类似人类骨关节炎病理变化的改变9。已有研究指出，在 MIA 给药后 28 天，关节内注射 MIA 可导致持续性疼痛，表明 MIA 模型可能适用于慢性伤害性疼痛的研究10,11,12。在本研究中，雄性 Sprague-Dawley 大鼠膝关节内注射 0.5、1.5 或 3 mg 的 MIA。通过在注射后第 1、7、14、21、28 和 35 天评估机械性和热敏感性，来衡量 MIA 诱导的关节疼痛严重程度。基于此，选择 1.5 mg MIA 作为最终浓度，在注射后第 28 天评估步态模式及组织学变化。

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方案

涉及动物受试者的实验程序已获得浙江中医药大学医学伦理与规范委员会的批准，并符合中国关于实验动物使用与护理的法律法规。

1. 膝关节内注射单碘乙酸

  1. 经过一周的适应期后，将40只雄性Sprague-Dawley大鼠（体重180−200 g，4−5周龄）随机均分为四组（每组n = 10只大鼠）。
    注意：对照组大鼠关节内注射50 µL生理盐水，实验组大鼠则分别接受溶解于50 µL生理盐水中的0.5、1.5或3 mg MIA处理。
  2. 在注射当天，用无菌生理盐水（0.9% NaCl）新鲜配制浓度为15、30和60 mg/mL的MIA溶液，以及用无菌生理盐水（0.9% NaCl）配制10%戊巴比妥溶液。
    注意：MIA对黏膜、上呼吸道、眼睛、皮肤及其他组织具有极强的破坏性。因此，配制溶液时建议佩戴口罩和手套。
  3. 通过腹腔注射给予氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）进行麻醉（两者均用 生理盐水配制）。用镊子轻轻夹住大鼠脚趾以确认麻醉状态。
  4. 将大鼠仰卧放置，剃除膝关节区域毛发，并用酒精擦拭膝关节周围区域。
  5. 保持膝关节呈90°屈曲，暴露髌骨下方的白色髌腱。用指尖按压髌腱以定位髌骨下方的间隙。
  6. 选择该间隙与外侧髌腱交界处作为注射位点。将26 G针头垂直刺入该部位约5 mm。当针头进入关节腔时，不应感到明显阻力。
    注意：保持针头与注射部位垂直至关重要。
  7. 向关节腔内注射50 µL生理盐水或MIA溶液。缓慢拔出针头，并用一块纱布包裹注射部位以减少反流和渗漏。 待麻醉恢复后，移除纱布。
  8. 在注射后第1、7、14、21、28和35天按照第2节所述方法检测疼痛相关行为。

2. 行为学评估

  1. 机械性缩足阈值（MWT）
    注意：MWT 通过 von Frey 试验13测定，观察者对动物接受的注射处理不知情。
    1. 将大鼠置于一个抬高的塑料笼中（17 cm × 11 cm × 13 cm），笼底为金属网，悬于桌面以上 50 cm 处。确保测试环境安静，并让大鼠适应环境 30 分钟。
    2. 将 von Frey 针垂直按压在每只大鼠后足底面，逐渐（约 20 g/s）且线性增加压力，直至出现抬足或舔足反应。
    3. 使用低于前一次阈值的力进行测试，以确保所测阈值为最小缩足力。每只大鼠测试至少三次，每次间隔至少 3−5 分钟。
    4. 记录引发缩足反射的最小力值，并将多次测试结果取平均作为该大鼠的 MWT。
  2. 热缩足潜伏期（TWL）
    注意：TWL 使用足底测试仪（材料表）测定，观察者对动物接受的注射处理不知情。
    1. 将一个亚克力箱（60 cm × 20 cm × 14 cm，分为 6 个隔间）放置在一块 3 mm 厚的玻璃板上，将大鼠放入箱内（每个隔间一只）。确保环境安静且室温恒定。
    2. 让大鼠适应测试环境 30 分钟。
    3. 通过红外辐射计校准热刺激，设定所需的红外强度为 70 单位。
    4. 将红外发射/检测器置于待测足底正下方的容器底部。
    5. 按下 START 按钮，计时器将自动启动。一旦足部发生移动，控制器将自动关闭红外光源并停止计时。
    6. 记录出现抬足和舔足反应的时间。
      注意：测试的阳性反应定义为同时出现抬足和舔足。若仅出现抬足，则应视为大鼠的自主运动，而非阳性反应。
    7. 重复测试至少三次，取平均值作为大鼠的 TWL。
      注意：每次辐射热暴露时间不得超过 20 秒，同一后足的红外刺激间隔应至少为 3−5 分钟。
  3. 步态模式分析
    注意：步态模式分析使用成像系统（材料表）测定，观察者对动物接受的注射处理不知情。
    1. 通过调节行走隔间两端的旋钮，将行走隔间的长度调整至适合大鼠的长度（例如 61 cm）。
    2. 将一只大鼠放入行走隔间，训练其以 18 cm/s 的速度完成至少 5 个连续步态周期的无中断跑动，作为正式实验前的训练。
      注意：当大鼠首次放入行走隔间时，可将速度设为约 20 cm/s，跑动约 2 秒后关闭。随后将速度设为 18 cm/s。若大鼠在行走过程中暂停或后退，可轻敲其背部的隔板。可尝试将速度从 18 cm/s 逐步降低至 10 cm/s。若大鼠最终无法完成测试，可选择另一只大鼠进行测试。
    3. 缓慢增加 treadmill 的速度，直至达到目标速度（18 cm/s）。使用安装在透明 treadmill 带下方的高速数码摄像机，拍摄至少 5 秒的大鼠连续运动视频。
    4. 每只大鼠的测试间隔至少 5 分钟，以获得至少三次无中断的跑动记录。
    5. 在成像软件中绘制“边界框”以定义动物行走图像的范围，并输入每段视频的跑动速度。将视频分组后由软件自动处理。处理完成后，软件将输出多个电子表格，报告包括支撑相、摆动相、制动、推进、步频、步序等在内的步态指标。
    6. 计算总足底接触面积（cm2）、平均步长（cm）和单位步长。
      注意：总足底接触面积是指每组大鼠四足总面积的均值，足底面积定义为步态周期支撑相期间足部与 treadmill 接触的最大面积。步长是指同一足在一次完整步态周期中两次初始接触点之间的距离。单位步长 = 平均步长（cm）/体长（cm）。 

3. 组织病理学与免疫组织化学分析

  1. 通过腹腔注射150 mg/kg戊巴比妥钠（用生理盐水配制）处死大鼠。立即切除 膝关节用于组织学分析。
  2. 将关节置于10%福尔马林中固定24小时，用含10% EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）脱钙8周，然后将关节包埋于石蜡中。
    注意：福尔马林可引起眼睛、皮肤和呼吸道刺激，应在通风橱中操作。
  3. 使用切片机将石蜡包埋的关节切成3 mm厚切片，并漂浮于40 °C蒸馏水水浴中。
  4. 将切片转移至载玻片上。室温（RT）下干燥过夜，并在室温保存以进行后续染色。
  5. 将载玻片置于60 °C烘箱中4小时以脱蜡。
  6. 在室温下依次将载玻片浸入二甲苯、二甲苯、100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和75%乙醇中，各5分钟。
  7. 按照步骤3.8−3.12所述方法，对切片进行苏木精-伊红（H&E）、番红O（SO）、阿尔新蓝-苏木精（ABH）染色，以及针对大鼠II型胶原（Col2）、X型胶原（Col10）和基质金属蛋白酶13（MMP13）抗体的免疫组化染色。
  8. H&E染色
    1. 用去离子H2O冲洗载玻片3分钟。用苏木精染色3−5分钟。
    2. 用去离子H2O冲洗载玻片3次，每次1分钟，直至表面无残留苏木精。
    3. 用伊红染色30秒。然后用去离子H2O冲洗载玻片3次，每次1分钟，直至表面无残留伊红。
    4. 将载玻片浸入0.1%氨水10−20秒。然后用去离子H2O冲洗3次，每次1分钟。
    5. 依次将载玻片浸入95%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯和二甲苯中，各1分钟。
    6. 用中性树脂封片。
  9. SO染色
    1. 用去离子H2O冲洗载玻片3分钟。用苏木精染色3−5分钟。
    2. 在1%酸性乙醇中快速分化（约3秒）。然后用去离子H2O冲洗3次，每次1分钟，直至表面无残留苏木精。
    3. 用亮绿FCF（FCF）溶液染色5分钟。然后用去离子H2O冲洗3次，每次1分钟。
    4. 用番红O（SO）染色1−2分钟。然后用去离子H2O冲洗3次，每次1分钟。
    5. 用1%乙酸冲洗1−2分钟以去除残留的FCF。再用去离子H2O冲洗1分钟。
    6. 依次将载玻片浸入95%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯和二甲苯中，各1分钟。
    7. 用中性树脂封片。
  10. ABH染色
    1. 用去离子H2O冲洗载玻片3分钟。将载玻片浸入1%酸性乙醇中30秒，然后在纸巾上短暂沥干（不要冲洗）。
    2. 将载玻片浸入ABH染液中1小时。然后用去离子H2O冲洗3次，每次1分钟，直至表面无残留ABH。
    3. 在1%酸性乙醇中快速分化（约3秒）。用去离子H2O冲洗3次，每次1分钟。
    4. 将载玻片浸入0.5%氨水15秒。然后用去离子H2O冲洗3次，每次1分钟。
    5. 将载玻片浸入95%乙醇1分钟。再浸入伊红/橘黄G溶液中1.5分钟。
    6. 依次将载玻片浸入95%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯和二甲苯中，各1分钟。
    7. 用中性树脂封片。
  11. 在显微镜下观察所有切片，并根据Mankin评分系统14进行双盲统计学评分（0−13分）。
  12. 免疫组织化学
    1. 用去离子H2O冲洗载玻片3分钟。
    2. 将载玻片浸入0.1 M柠檬酸钠溶液中，并置于60 °C烘箱中4小时以进行抗原修复。
    3. 将载玻片浸入含0.3% Triton X-100的PBS中10分钟。然后用PBS冲洗2次，每次3分钟。
    4. 在室温下用含3% H2O2的甲醇溶液孵育切片10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。用PBS冲洗2次，每次3分钟。
    5. 在室温下用含5%山羊血清的PBS孵育切片30分钟，以阻断非特异性结合。用PBS冲洗2次，每次3分钟。
    6. 在4 °C下用100 µL PBS稀释（1:1,000）的抗大鼠II型胶原（Col2）、X型胶原（Col10）和基质金属蛋白酶13（MMP13）一抗溶液孵育切片过夜。用PBS冲洗2次，每次3分钟。
    7. 在室温下用100 µL PBS稀释（1:1,000）的二抗（山羊抗小鼠二抗或山羊抗小鼠二抗）孵育切片20分钟。用PBS冲洗2次，每次3分钟。
    8. 用100 µL 3,3′-二氨基联苯胺（DAB）工作液孵育切片。在显色反应使抗原位点呈现棕色时观察反应进程。
      注意：DAB为致癌物，操作时务必戴手套并在通风橱中进行。
      注意：显色时间可能从几秒到10分钟不等。
    9. 一旦切片上出现棕色，立即用去离子H2O冲洗2次，每次3分钟。
    10. 将载玻片浸入苏木精中1−2分钟进行复染。然后用去离子H2O冲洗3次，每次1分钟。
    11. 依次将载玻片浸入95%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯和二甲苯中，各1分钟。
    12. 用中性树脂封片。
    13. 在显微镜下观察切片中抗体染色的颜色。

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结果

通过该方法，我们建立了大鼠骨关节炎疼痛模型，并检测了相应的变化。机械缩足阈值（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）分别反映机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。如图1所示，MIA以剂量依赖的方式诱导了机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。值得注意的是，MWT的下降在21至28天达到峰值，随后出现回升，提示此阶段可能发生了关节修复，但3 mg MIA组的MWT仍处于较低水平。TWL的变化趋势与MWT基本一致（图2）。

基于上述结果，我们选择1.5 mg MIA作为最终剂量，并在注射后28天评估步态模式和组织学变化。步态参数（总足印面积和单位步长）反映了与疼痛相关的行为。步态参数水平，包括总足印面积（图3A）和单位步长（图3B），在MIA组注射后28天显著降低，提示MIA在大鼠中诱导了与骨关节炎相关的关节疼痛。随着组织病理切片中Mankin评分的升高，MIA组明显出现软...

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讨论

由MIA诱导的骨关节炎（OA）大鼠模型是一种已建立且被广泛使用的模型。关节内注射MIA最初会引起严重而急性的炎症，随后进入更持久的退行性OA阶段17,18。在本研究中，我们通过机械痛阈（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）测量伤害性敏感性，并利用成像系统评估步态改变。既往研究发现，MIA注射可提高膝关节传入纤维的敏感性，导致伤害性感觉，表现为热痛觉过敏和机械阈值降低19,20。已有研究证实，步态改变与伤害性感觉增强相关，提示步态模式可用于评估疼痛模型21。因此，MIA诱导的模型主要用于评估与OA相关的疼痛，并筛选口服药物及关节内注射药物3,6。

尽管与手术诱导的骨关节炎模型相比，向关节腔内注...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由浙江省自然科学基金（资助号：LY17H270016）、国家自然科学基金（资助号：81774331、81873049 和 81673997）以及浙江省中医药科技计划项目（资助号：2013ZQ007 和 2016ZZ011）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗胶原蛋白II抗体Abcam(UK)34712免疫组化（IHC）一抗
抗胶原蛋白X（Col10）抗体Abcam(UK)49945免疫组化（IHC）一抗
DigiGait成像系统Mouse Specifics (Boston, MA, USA)步态分析设备
伊红Sigma-Aldrich861006HE染色用染料
快绿FCFSigma-AldrichF7252SO染色用染料
山羊抗小鼠抗体ZSGQ-BIO (Beijing, China)PV-9002免疫组化（IHC）二抗
山羊抗兔抗体ZSGQ-BIO (Beijing, China)PV-9001免疫组化（IHC）二抗
苏木精Sigma-AldrichH3163HE染色用染料
MIASigma-AldrichI4386-10G粉末
MMP13Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)69926免疫组化（IHC）一抗
模块化组织包埋中心Thermo Fisher Scientific (USA)EC 350制备石蜡包埋块
足底测试仪UgoBasile (Italy)37370TWL实验设备
PrimeScript RT试剂盒（完美实时）TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China)RR037A从培养细胞中提取总RNA
旋转式与滑动式切片机Thermo Fisher Scientific (USA)HM325精确切制石蜡切片
番红OSigma-AldrichS2255SO染色用染料
Tissue-Tek VIP 5 JrSakura (Japan)真空浸润处理仪

参考文献

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