本研究描述了在大鼠中进行关节内注射单碘乙酸的方法，并讨论了由此引发的疼痛相关行为及组织病理学变化，为未来应用提供了参考依据。
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本文内容
摘要
摘要
目前，骨关节炎（OA）的动物模型可分为自发性模型和诱导性模型，二者均旨在模拟人类骨关节炎的病理生理变化。然而，疼痛作为骨关节炎晚期阶段的主要症状，严重影响患者日常生活，但可用于研究疼痛的模型却较为有限。单碘乙酸钠（MIA）诱导模型是目前应用最广泛的骨关节炎疼痛模型，主要应用于啮齿类动物。MIA 是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的抑制剂，可导致软骨细胞死亡、软骨退变、骨赘形成以及动物行为学的可测量变化。此外，在 MIA 诱导模型中还可检测到基质金属蛋白酶（MMP）以及促炎性细胞因子（IL-1β 和 TNF-α）的表达变化。这些改变与人类骨关节炎的病理生理状况一致，表明 MIA 能够成功诱导出具有可测量指标的骨关节炎疼痛模型。本研究旨在描述在大鼠中进行 MIA 关节内注射的方法学，并探讨由此引发的疼痛相关行为学及组织病理学改变。
引言
骨关节炎（OA）是全球最常见的关节疾病，估计影响成年人群的10-12%1。最常受累的关节是膝关节，且OA在老年人群中发病率更高，尤其是女性2。作为一种慢性疾病，OA在数十年内逐渐进展，最终导致关节功能衰竭，症状包括软骨丢失、滑膜炎症、骨赘形成、功能下降以及慢性疼痛3。根据世界卫生组织（WHO）的数据，OA在女性中是第四大常见疾病，在男性中是第八大常见疾病。到2020年，OA可能成为人类第四大致残性疾病4。然而，目前可用的OA治疗方法仅能缓解症状，并延长关节置换手术所需的时间5。
人类患者中自发性骨关节炎（OA）通常需要较长时间才会出现关节相关疼痛等临床症状6。在OA的早期阶段，疼痛通常为间歇性，随着疾病进展逐渐变得更加频繁和严重，成为患者最主要的症状7。因此，在过去半个世纪中，人们建立了大量用于研究OA疼痛的动物模型，以促进镇痛疗法的发展。OA模型传统上分为自发性模型和诱导性模型。自发性模型包括自然发生的模型和基因修饰模型，能够更接近地模拟人类原发性OA的病程8。诱导性模型通常可分为两类：1）通过手....
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方案
涉及动物受试者的实验程序已获得浙江中医药大学医学伦理与规范委员会的批准，并符合中国关于实验动物使用与护理的法律法规。
1. 膝关节内注射单碘乙酸
- 经过一周的适应期后，将40只雄性Sprague-Dawley大鼠（体重180−200 g，4−5周龄）随机均分为四组（每组n = 10只大鼠）。
注意：对照组大鼠关节内注射50 µL生理盐水，实验组大鼠则分别接受溶解于50 µL生理盐水中的0.5、1.5或3 mg MIA处理。 - 在注射当天，用无菌生理盐水（0.9% NaCl）新鲜配制浓度为15、30和60 mg/mL的MIA溶液，以及用无菌生理盐水（0.9% NaCl）配制10%戊巴比妥溶液。
注意：MIA对黏膜、上呼吸道、眼睛、皮肤及其他组织具有极强的破坏性。因此，配制溶液时建议佩戴口罩和手套。 - 通过腹腔注射给予氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）进行麻醉（两者均用 生理盐水配制）。用镊子轻轻夹住大鼠脚趾以确认麻醉状态。
- 将大鼠仰卧放置，剃除膝关节区域毛发，并用酒精擦拭膝关节周围区域。
- 保持膝关节呈90°屈曲，暴露髌骨下方的白色髌腱。用指尖按压髌腱以定位髌骨下方的间隙。
- 选择该间隙与外侧髌腱交界处作为注射位点。将26 G针头垂直刺入该部位约5 mm。当针头进入关节腔时，不应感到明显阻力。
注....
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结果
通过该方法，我们建立了大鼠骨关节炎疼痛模型，并检测了相应的变化。机械缩足阈值（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）分别反映机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。如图1所示，MIA以剂量依赖的方式诱导了机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。值得注意的是，MWT的下降在21至28天达到峰值，随后出现回升，提示此阶段可能发生了关节修复，但3 mg MIA组的MWT仍处于较低水平。TWL的变化趋势与MWT基本一致（图2）。
基于上述结果，我们选择1.5 mg MIA作为最终剂量，并在注射后28天评估步态模式和组织学变化。步态参数（总足印面积和单位步长）反映了与疼痛相关的行为。步态参数水平，包括总足印面积（图3A）和单位步长（图3B），在MIA组注射后28天显著降低，提示MIA在大鼠中诱导了与骨关节炎相关的关节疼痛。随着组织病理切片中Mankin评分的升高，MIA组明显出现软.......
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讨论
由MIA诱导的骨关节炎（OA）大鼠模型是一种已建立且被广泛使用的模型。关节内注射MIA最初会引起严重而急性的炎症，随后进入更持久的退行性OA阶段17,18。在本研究中，我们通过机械痛阈（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）测量伤害性敏感性，并利用成像系统评估步态改变。既往研究发现，MIA注射可提高膝关节传入纤维的敏感性，导致伤害性感觉，表现为热痛觉过敏和机械阈值降低19,20。已有研究证实，步态改变与伤害性感觉增强相关，提示步态模式可用于评估疼痛模型21。因此，MIA诱导的模型主要用于评估与OA相关的疼痛，并筛选口服药物及关节内注射药物3,6。
尽管与手术诱导的骨关节炎模型相比，向关节腔内注.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由浙江省自然科学基金（资助号：LY17H270016）、国家自然科学基金（资助号：81774331、81873049 和 81673997）以及浙江省中医药科技计划项目（资助号：2013ZQ007 和 2016ZZ011）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗胶原蛋白II抗体 | Abcam(UK) | 34712 | 免疫组化（IHC）一抗 |
| 抗胶原蛋白X（Col10）抗体 | Abcam(UK) | 49945 | 免疫组化（IHC）一抗 |
| DigiGait成像系统 | Mouse Specifics (Boston, MA, USA) | 步态分析设备 | |
| 伊红 | Sigma-Aldrich | 861006 | HE染色用染料 |
| 快绿FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | SO染色用染料 |
| 山羊抗小鼠抗体 | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | 免疫组化（IHC）二抗 |
| 山羊抗兔抗体 | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | 免疫组化（IHC）二抗 |
| 苏木精 | Sigma-Aldrich | H3163 | HE染色用染料 |
| MIA | Sigma-Aldrich | I4386-10G | 粉末 |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | 免疫组化（IHC）一抗 |
| 模块化组织包埋中心 | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | 制备石蜡包埋块 |
| 足底测试仪 | UgoBasile (Italy) | 37370 | TWL实验设备 |
| PrimeScript RT试剂盒（完美实时） | TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China) | RR037A | 从培养细胞中提取总RNA |
| 旋转式与滑动式切片机 | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | 精确切制石蜡切片 |
| 番红O | Sigma-Aldrich | S2255 | SO染色用染料 |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | 真空浸润处理仪 |
参考文献
- Hunter, D. J., Schofield, D., Callander, E. The individual and socioeconomic impact of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 437-441 (2014).
- Neogi, T. The epidemiology and impact of pain in osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 21
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