利用鸡绒毛尿囊膜体内模型研究妇科和泌尿系统癌症

摘要

我们提出鸡胚尿囊绒毛膜模型作为一种可移植的体内替代模型，用于移植妇科和泌尿系统癌细胞系及患者来源的肿瘤。

摘要

小鼠模型是体内癌症研究的基准实验方法。然而，由于成本、时间和伦理方面的考虑，人们呼吁采用替代性的体内癌症模型。鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型提供了一种经济、快速的替代方案，可直接观察肿瘤发育过程，并适用于活体成像。因此，我们致力于建立一种将妇科和泌尿系统肿瘤移植到该模型中的优化方案，本文即对此进行介绍。受精约7天后，将气室转移至蛋的血管化一侧，并在蛋壳上开一个开口，随后可将来自小鼠和人类细胞系以及原代组织的肿瘤移植其中。这些肿瘤通常被接种于细胞外基质与培养基的混合物中，以防止细胞扩散，并在细胞募集到血管供应之前提供营养支持。在孵化前，肿瘤可在膜上继续生长长达14天。通过植入稳定转导了萤火虫荧光素酶的细胞，可利用生物发光成像技术灵敏地检测膜上的肿瘤生长及癌细胞在胚胎内的扩散情况。该模型有望用于研究肿瘤发生、侵袭、转移以及治疗效果。与传统的小鼠模型相比，鸡胚CAM模型所需的时间和经济资源显著减少。由于鸡蛋处于免疫缺陷和免疫耐受状态，理论上可移植来自任何生物体的组织，而无需为移植人类组织而使用昂贵的转基因动物（如小鼠）。然而，该模型的许多优势也可能成为其局限性，例如肿瘤生长时间较短以及免疫缺陷/免疫耐受状态。此外，尽管本文所展示的所有肿瘤类型均可在鸡胚尿囊绒毛膜模型中成功移植，但其肿瘤生长程度存在差异。

引言

小鼠作为研究人类疾病（包括恶性肿瘤）的经典模式生物，因其哺乳动物特性而与人类具有诸多相似之处。小鼠与人类基因组高度相似，使得通过转基因技术对小鼠基因组进行操控成为可能，从而极大地增进了人们对人类疾病遗传调控机制的理解¹。由于在小鼠饲养和实验操作方面积累了丰富的经验，小鼠已成为生物医学研究的首选模型。然而，除了涉及小鼠模型的伦理和科学问题外，其使用往往成本高昂且耗时较长^2,3。肿瘤的形成可能需要数周甚至数月时间，仅在典型机构中维持实验动物饲养的费用就可能高达数百至数千美元。卵巢癌便是这一缺陷的典型例子，因其在小鼠模型中的生长过程通常需要数月。研究进展的延迟可能直接影响卵巢癌患者的预后，该病患者的5年生存率长期处于仅47%的低水平（即过去30年中生存率仅提高了10%）⁴。同样，泌尿系统癌症（包括肾癌、前列腺癌和膀胱癌）在美国占所有癌症病例的19%，占癌症相关死亡的11%⁴。因此，若能开发一种新颖的体内研究方法用于妇科和泌尿系统癌症的研究，即使仅用于初步筛选实验，也可能为实验室节省大量时间、人力和经费。此外，研究进程的加速有望显著影响每年约17.7万名被诊断患有此类癌症的患者。

鸡胚尿囊膜（CAM）模型具有多种优势，可解决上....

方案

本研究中所有实验均经加州大学洛杉矶分校（UCLA）相应的伦理委员会审查和批准。使用去标识化的原代人类肿瘤已获得UCLA机构审查委员会的批准（方案编号：17-000037、17-001169 和 11-001363）。在UCLA，使用鸡胚的实验无需经过动物研究委员会审查；仅当鸡蛋将被孵化时才需要获得方案批准。然而，研究人员遵循了最佳实践规范，例如《美国兽医协会动物安乐死指南》（AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals），以确保对鸡胚进行人道处理，并尽可能避免其遭受疼痛。建议研究人员在开展使用CAM模型的研究之前，核实所在机构的相关监管要求。

1. 准备卵子

1. 在接收鸡蛋之前，按照制造商的说明将孵化箱组装并预热至37.8 °C（100 °F），湿度保持在60-70%。
   注意：为尽量减少污染风险，可使用经高压灭菌的水来控制湿度。
2. 从经认证的实验级蛋品供应商处收到受精的罗得岛红鸡鸡蛋后，用纸巾干擦蛋壳表面。如有必要，可使用略微湿润的纸巾去除附着物，随后立即擦干。
   注意：使用低于43.3 °C的液体润湿蛋壳可能将细菌带入蛋内。若需清洗或消毒鸡蛋，液体温度必须控制在43.3-48.9 °C之间；温度过高可能导致蛋内内容物受热变性。消毒剂的选择应根据所关注的微生物种类而定。
3. 使用铅笔或标记笔在蛋壳上标注日期，此日记为发育第0天。
4. 将....

结果

到目前为止，我们发现该植入方法在卵巢癌、肾癌、前列腺癌和膀胱癌中均取得了成功。每种肿瘤类型都经过优化以确定特定的植入条件，尽管可能存在一定的灵活性。在已测试的肿瘤类型中，卵巢癌的生长程度明显较弱，通常在没有生物发光成像辅助的情况下不可见（图1）。然而，在植入区域可用镊子触碰到CAM（尿囊绒毛膜）的硬化现象。这可能有助于在缺乏生物发光成像时识别潜在的肿瘤生长，但还需通过组织学或其他合适的方法进一步验证。我们成功实现了人源和鼠源细胞系的移植，其形态学特征与其他体内模型中观察到的一致（图1A 和 1B）。此外，肿瘤组织块的植入也是可行的（图1C，蓝色箭头指示肿瘤）。本例中植入的肿瘤来自一名患有高级别、转移性卵巢浆液性癌患者的组织。所形成的肿瘤在形态上与其来源肿瘤相似，并表达人源特异性蛋白（如细胞角蛋白.......

讨论

利用 CAM 模型进行肿瘤扩展和移植，相较于现有的体内动物模型，可实现更快速且可直接观察的肿瘤生长。此外，在完成设备的初始购置后，其成本显著降低，尤其与免疫缺陷小鼠的使用成本相比更为经济。鸡胚先天的免疫缺陷状态使其能够 readily接受人源和鼠源组织的移植。尽管具有上述优势，CAM 模型仍存在局限性。其较短的实验周期在某些情况下是优势，但若需开展长期治疗研究时，则可能成为限制因素。CAM 模型的免疫缺陷或免疫耐受状态可能使肿瘤-免疫相互作用的研究变得复杂。对于此类研究，可能需要共移植特定的免疫细胞，甚至需对免疫组分进行补充。此外，尽管我们所展示的所有肿瘤类型均可在 CAM 模型中成功移植，但其生长程度各不相同。例如，肾细胞癌可迅速形成较大的肿瘤，而卵巢癌肿瘤若无生物发光成像技术的辅助则难以观察。因此，需针对特定肿瘤类型评估其生长情况和生长速度，以确定 CAM 模型是否适合作为实验模型。

成功的肿瘤移植需要仔细完成方案中的特定步骤。首先，鸡蛋必须在理想的条件下孵育，以确保胚胎在移植前具有最佳的存活率和绒毛尿囊膜（CAM）的正常形成。由于不同批次之间存在天然差异，我们建议从特定的鸡蛋.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
-010 聚四氟乙烯（PTFE）白色 55 邵氏 D 硬度 O 型圈	The O-Ring Store	TEF010	用于细胞接种的不粘环。1/4"ID × 3/8"OD × 1/16"CS 聚四氟乙烯（PTFE）。
C4-2	ATCC	CRL-3314	人前列腺癌细胞系。
CWR22Rv1			CWR 细胞系由南加州大学凯克医学中心 David Agus 博士惠赠。
细胞角蛋白 8/18 抗体（C-51）	Novus Biologicals	NBP2-44929-0.02mg	用于人卵巢 CAM 肿瘤免疫组织化学分析，稀释比例为 1:100。
D-荧光素钾盐（来自萤火虫）	Goldbio	LUCK-1G
精细手术剪；弯型；尖-尖；30 mm 刀刃长度；总长 4-3/4 英寸	Roboz Surgical	RS6703	此为示例。任何类似的弯剪均可使用。
Dremel 8050-N/18 微型 8V Max 工具套装	Dremel	8050-N/18	该套装包含所有必需工具。
受精鸡卵（罗得岛红羽 - 棕色，实验级）	AA Lab Eggs Inc.	N/A	需自行寻找本地蛋品供应商，因该供应商仅限区域配送。
HT-1376	ATCC	CRL-1472	人膀胱癌细胞系。
Hovabator Genesis 1588 豪华型孵蛋器组合套装	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	可使用其他孵蛋器，但需验证其可靠性。植入后也可使用关闭 CO2 功能的细胞培养箱。
ID8			非商业化产品，请参见 PMID: 10753190。
Incu-Bright 冷光源照蛋灯	Incubator Warehouse	1102	可使用其他照蛋灯，但经测试本产品为首选。该照蛋灯包含于上述孵蛋器套装中。
虹膜镊，10 cm，弯型，带齿，0.8 mm 尖端	World Precision Instrument	15915	此为示例。任何类似的弯型镊子均可使用。本方法已使用多个品牌产品。
异氟烷	Clipper Distributing	0010250
IVIS Lumina II 活体成像系统	Perkin Elmer
Matrigel 基底膜基质 HC；无病原体（LDEV-Free）	Corning	354248	细胞外基质溶液
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	小鼠前列腺癌细胞系。
便携式 Pipet-Aid XP 移液控制器	Drummond Scientific	4-000-101	任何类似的移液控制器均可适用。
PrecisionGlide 皮下注射针头	BD	305196	此为示例。任何 18G 针头均可达到类似效果。
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken 镊子	Fine Science Tools	11008-13	此为示例。任何类似镊子或符合研究人员偏好的其他类型均可适用。
SKOV3	ATCC	HTB-77	人卵巢癌细胞系。
标本镊	Electron Microscopy Sciences	72914	此为示例。用于移除蛋壳以进行生物发光成像的镊子长度约为 12.8 cm，尖端宽度为 3 mm。
无菌棉球	Fisherbrand	22-456-885	此为示例。任何无菌棉球均可满足要求。
带橡胶刮头的搅拌棒；直径 5 mm，长度 6 英寸	United Scientific Supplies	GRPL06	此为示例。任何类似的玻璃搅拌棒均可使用。
T24	ATCC	HTB-4	人膀胱癌细胞系。
Tegaderm 透明敷料原框式 2 3/8" × 2 3/4"	Moore Medical	21272
组织培养皿，直径 10 cm	Corning	353803	此为示例。任何类似的无菌 10 cm 培养皿均可使用。无需组织培养处理。
Tygon 透明实验室管路 - 1/4 × 3/8 × 1/16 管壁（50 英尺）	Tygon	AACUN017	此为示例。任何尺寸相似的管路均可使用。