使用分体路西酶测定系统识别 HBx-DDB1 相互作用的抑制剂

摘要

在这里，我们提出了一种使用裂解荧光素酶检测系统来抑制HBx-DDB1相互作用的抗乙型肝炎病毒药物的方法。该系统易于检测蛋白质-蛋白质相互作用，适用于识别此类相互作用的抑制剂。

摘要

迫切需要新的治疗乙型肝炎病毒（HBV）感染的治疗方法。虽然目前可用的核细胞（t）ide类比能有效抑制病毒复制，但它们对从病毒共价闭环DNA（cccDNA）转录的病毒蛋白的表达没有直接影响。由于高病毒抗原负荷可能在这个慢性和HBV相关的致癌作用，HBV治疗的目标是根除病毒蛋白。HBV调节蛋白X（HBx）与宿主DNA损伤结合蛋白1（DDB1）蛋白结合，降解染色体5/6（Smc5/6）的结构维持，导致从cccDNA激活病毒转录。在这里，使用裂化荧光素酶补充测定系统，我们提出了一个全面的化合物筛选系统，以识别HBx-DDB1相互作用的抑制剂。我们的协议能够轻松检测活细胞内的相互作用动力学。这项技术可能成为发现治疗HBV感染的新治疗剂的关键测定方法。

引言

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全世界一个重大的公共卫生问题，每年估计有2.4亿人长期感染乙肝病毒，9万人死于感染并发症，包括肝硬化和肝细胞癌^{（HCC）1。}虽然目前抗HBV治疗剂，核细胞（t）类比，足以抑制病毒逆转录，但它们很少实现病毒蛋白的消除，这是长期的临床目标。它们对病毒蛋白消除的不良影响是因为他们对肝细胞核²中表皮病毒共价闭合环DNA（cccDNA）小染色体的病毒转录缺乏直接影响。

HBV转录由HBV调节X（HBx）蛋白³激活。最近的研究表明，HBx通过劫持DDB1-CUL4-ROC1 E3泛素结合酶复合^{物4，5，6，}降解染色体5/6（Smc5/6）的结构维持，这是阻止HBV转录从cccDNA的宿主限制因子。因此，促进来自cccDNA的病毒转录的关键步骤被认为是HBx-DDB1相互作用。能够抑制HBx和DDB1之间结合的化合物可以阻断病毒转录，事实上，硝基氧烷通过实验室⁷开发的筛选系统被确定为HBx-DDB1相互作用的抑制剂。

在这里，我们介绍我们方便的筛选系统，用于识别HBx-DDB1相互作用的抑制剂，它利用裂性荧光素酶补充测定^7，8。裂化荧光素酶亚单位与HBx和DDB1融合，HBx-DDB1相互作用使亚单位接近，形成产生明亮发光信号的功能酶。由于亚单位之间的相互作用是可逆的，该系统可以检测迅速分离的HBx-DDB1蛋白（图1）。利用该系统，可以很容易地筛选大型化合物库，从而发现能够有效抑制HBx-DDB1相互作用的新型化合物。

方案

注:图1A显示了裂解荧光素酶测定的示意图表示，如图1B所示。图1B概述了测定过程。 相互作用动力学可以实时测量，无需细胞分变。

1. 细胞制备

1. 在Dulbeco的改性Eagle培养基（DMEM）中保持培养的HEK293T细胞，辅以10%v/v胎儿牛血清（FBS），1x青霉素/链霉素在37°C，在20%O₂和5%CO₂中。
2. 种子 5 x 10⁶细胞放入 100 mm 的培养皿中，其 DMEM 为 10 mL，并在 37°C 下孵育过夜。
3. 根据以下方法，用裂化荧光素酶将HBx和DDB1的瞬时转染1μg进入细胞。
   注:质粒DNA转染的量可能取决于所使用的转染。与靶蛋白融合的裂性荧光素酶的最佳位置必须事先确定。在这种情况下，HBx 在 HBx （HBx-LgBit） 的 C 端与 LgBit 融合，DDB1 在 DDB1 的 N 端（SmBit-DDB1）与 SmBit 融合，提供了最佳结果（即最亮的荧光素酶信号）。此过程之前已详细报告⁷。
   1. 在DNA冷凝缓冲液（材料表）中稀释1μg的HBx-LgBit表达DNA质粒和1μgSmBit-DDB1表达DNA质粒（材料表），总体积为300μL。
   2. 加入16μL的增强剂溶液（材料表），通过涡旋混合1s。
   3. 在室温下孵育样品3分钟。
   4. 将60μL转染试剂（材料表）加入样品，通过涡旋混合10s。
   5. 在室温下孵育样品8分钟。
   6. 在孵育期间，从培养基盘中吸出培养基（在步骤1.2中制备），用5 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。通过吸入移除 PBS 并添加 7 mL 的 DMEM。
   7. 在含有转染复合物的管中加入3 mL的DMEM。通过移液混合，并将转染复合物添加到10厘米盘中的细胞中。
4. 在5%CO2以下的培养箱中，在37°C下孵育细胞10小时。
5. 根据以下方法，在 5 x 10⁴细胞/孔 50 μL 的介质/孔中，将细胞重新播种到白色 96 孔板中。
   1. 去除废细胞培养基，用5 mL的PBS洗涤细胞。
   2. 通过吸入去除PBS，加入1 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，并在37°C孵育5分钟以分离细胞。
   3. 加入4 mL的DMEM，通过多次移液在细胞层表面分散介质。将细胞悬浮液转移到管子上。
   4. 在室温下，在500 x g下离心细胞5分钟。
   5. 丢弃上清液，在1mL的PBS中重新悬浮细胞颗粒。
   6. 在室温下将细胞悬浮液在500 x g下离心5分钟，并丢弃上清液。
   7. 用缓冲细胞培养基（材料表）稀释细胞颗粒，辅以10%FBS，种子密度为1.0 x 10⁶细胞/mL。
   8. 将50μL的细胞悬浮液放入96孔板的每个孔中，并将细胞返回到孵化器。
6. 在37°C下孵育细胞，在5%CO₂下孵育10小时。

2. 化合物筛选

1. 在孵育过程中，以13.5倍的浓度稀释筛选化合物（材料表）和溶剂（二甲基磺酸二氧化硫[DMSO]）。例如，如果库存为 10 mM，筛选浓度为 10 μM，则向缓冲细胞培养基的 73.1 μL 中添加 1 μL 的库存溶液。
2. 在每个井中加入12.5 μL的发光基板（材料表），并在室温下孵育5分钟。
   注:作为负控制，板两端的孔（即1和12柱）不应含有发光基板。
3. 使用光度计（材料表）测量基线发光。
4. 在初始测量后，立即添加 5 μL 的化合物，并在步骤 2.1 中控制分量DMSO稀释到每个井中。
   注:最终浓度为10μM。
5. 每 30 分钟测量一次发光值 2 小时。
   注:板应在室温下在黑暗中孵育。
6. 在归一化基线信号后，通过与对照 DMSO 处理进行比较，计算抑制效果。
   注:在重复或三联中筛选每种化合物可以减少变异。

结果

使用该协议后的代表性结果如图2A，B所示。信背景比大于80，Z'因子^9（高通量筛选的黄金标准质量指数）大于0.5，表明该检测系统对于高通量筛选是可以接受的。与对照组（仅限DMSO）相比，阈值设置为>40%抑制，我们确定硝基氧烷为候选药物^7。使用这个系统，通过筛选其他更大的化合物库可以找到更好的候选药物。

图1:HBx-DDB1相互作用的分路素酶分析的原理表示。（A） 使用裂分荧光素酶互补测定系统对HBx-DDB1结合进行基础检测...

讨论

我们开发了一种方便的筛选方法，使用裂光酶测定法来发现HBx-DDB1结合抑制剂。相互作用动力学可以在活细胞中实时检测，而无需细胞变热。抑制HBx-DDB1相互作用导致Smc5/6的恢复，导致抑制病毒转录，蛋白质表达和cccDNA生产⁷。这种新的抗病毒作用机制可以克服目前HBV疗法的不足。

虽然有许多方法可用于研究活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，但检查这些相互作用仍然很困难^。我们的程序很简单，只需要很短的时间来筛选一个96孔板。此外，筛选质量令人满意，Z分高，高通量筛选的黄金标准质量指数^为9。我们的测定可能适用于机器人自动化^11，是药物发现的有效检测。

虽然本文所述的协议使用了HEK293T细胞系，因为它的高转染效率和高增殖能力适合高通量筛选，这种筛选方法可以使用其他细胞系（例如HepG2）进行，无需修改

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养微孔板，96 孔，PS，F-BOTTOM	Greiner-Bio-One GmbH	655098
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
DMSO	Tocris Bioscience	3176
Effectene 转染试剂	Qiagen	301425	包括 DNA 缩合缓冲液、增强剂溶液和转染试剂
FBS	Nichirei
GloMax 96 微孔板发光仪	Promega	E6521
HBx–表达 LgBit 的 DNA 质粒	我们的实验室		可根据要求提供
HEK293T 细胞	美国类型培养物保藏中心	CRL-11268
NanoBiT PPI 启动系统	Promega	N2015	包括 Nano-Glo 活细胞试剂
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	在手稿中描述为"缓冲细胞培养基"
PBS	Takara	T900
青霉素-链霉素	Sigma Aldrich	P0781
筛选孔 FDA 批准的药物库 V2 版本 1.0	Enzo Life Sciences	BML-2841	这里使用的化合物如下：美喹醇、巯嘌呤水合物、美司钠、美三酚、偏肾上腺素半硫酸盐、间拉米诺酒石酸盐、美他沙酮、乙酰甲胆碱氯化物、甲唑胺、乌洛托品马普酸盐、美索巴莫、甲氨蝶呤、甲氧沙林、溴化美莨菪碱、美琥胺、甲基噻嗪、氨基乙酰丙酸甲酯·HCl、马来酸甲基麦角新碱、美托拉宗、美替拉酮、美西律和middot;盐酸、米卡芬净、咪康唑、米多君和middot;HCl、米格列醇、米那普仑和middot;HCl、米氮平、米托坦、莫西普利和middot;盐酸、糠酸莫米松、莫匹罗星、纳多洛尔、萘夫西林和middot;Na， naftifine·HCl、naratriptan 和 middot;HCl、纳他霉素、奈比洛尔和 middot;盐酸、奈拉宾、奈帕芬胺、奈韦拉平、烟酸、尼古丁、尼罗替尼、尼鲁胺、硝唑尼特、尼替西农、呋喃妥因、尼扎替丁、去甲替林和middot;HCl、olsalazine·Na、奥利司他、奥沙普嗪、氧三叶碱、奥昔布宁氯化物、土霉素和middot;HCl、帕潘立酮、帕洛诺司琼·HCl、硫酸巴龙霉素、帕唑帕尼和middot;盐酸、培美曲塞二钠、培美司特钾、青霉胺、青霉素 G 钾、羟乙基磺酸喷他脒、喷司他丁、培哚普利、氯菊酯、奋乃静、硫酸苯乙肼、去氧肾上腺素、植物甲萘醌、吡美莫司、匹伐他汀钙和鬼臼
SmBit–表达 DDB1 的 DNA 质粒	我们的实验室		可根据要求提供
胰蛋白酶-EDTA	Sigma Aldrich	T4049