本文介绍了一种利用分裂荧光素酶检测系统筛选抑制HBx-DDB1相互作用的抗乙型肝炎病毒药物的方法。该系统可简便地检测蛋白质-蛋白质相互作用，适用于此类相互作用抑制剂的鉴定。
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本文内容
摘要
摘要
乙型肝炎病毒（HBV）感染迫切需要新的治疗药物。尽管目前可用的核苷（酸）类似物能有效抑制病毒复制，但它们对由病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）转录的病毒蛋白表达并无直接作用。由于高病毒抗原负荷可能在慢性感染及HBV相关致癌过程中发挥重要作用，因此HBV治疗的目标是清除病毒蛋白。HBV调控蛋白X（HBx）通过与宿主DNA损伤结合蛋白1（DDB1）相互作用，导致染色体结构维持蛋白5/6（Smc5/6）降解，从而激活来自cccDNA的病毒转录。本文中，我们利用分裂荧光素酶互补检测系统，建立了一套全面的化合物筛选体系，用于鉴定HBx-DDB1相互作用的抑制剂。本方案可在活细胞内实时、便捷地检测该相互作用的动力学变化。该技术有望成为发现新型HBV感染治疗药物的关键检测方法。
引言
乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球主要的公共卫生问题，据估计每年有2.4亿人患有慢性HBV感染，约9万人死于由该感染引起的并发症，包括肝硬化和肝细胞癌（HCC）1。尽管目前的抗HBV治疗药物——核苷（酸）类似物——能够有效抑制病毒的逆转录过程，但极少能实现病毒蛋白的清除，而后者正是长期临床治疗的目标。这类药物在病毒蛋白清除方面效果不佳，原因在于其对肝细胞核内病毒游离型共价闭合环状DNA（cccDNA）微染色体的病毒转录过程无直接作用2。
乙型肝炎病毒（HBV）的转录由HBV调节蛋白X（HBx）激活3。近期研究表明，HBx通过劫持DDB1-CUL4-ROC1 E3泛素连接酶复合物，降解染色体结构维持蛋白5/6（Smc5/6）——一种可阻断从共价闭合环状DNA（cccDNA）进行HBV转录的宿主限制因子4,5,6。因此，促进cccDNA上病毒转录的关键步骤被认为是HBx与DDB1之间的相互作用。能够抑制HBx与DDB1结合的化合物可能阻断病毒转录，事实上，通过本实验室建立的筛选系统已鉴定出硝唑尼特（nitazoxanide）为HBx-DDB1相互作用的抑制剂7。
本文介绍了我们用于筛选HBx-DDB1相互作用抑制剂的便捷筛选系统，该系统采用分裂荧光素酶互补检测法7,8。分裂的荧光素酶亚基分别与HBx和DDB1融合表达，当HBx与DDB1发生相互作用时，可使两个亚基靠近并形成具有功能的酶，从而产生强烈的发光信号。由于亚基之间的结合是可逆的，该系统能够检测快速解离的HBx-DDB1蛋白复合物（图1）。利用该系统可方便地对大规模化合物库进行筛选，有望发现能够高效抑制HBx-DDB1相互作用的新型化合物。
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方案
注意：分裂荧光素酶检测的示意图见图1A，检测流程见图1B。该方法可在无需裂解细胞的情况下实时测量相互作用动力学。
1. 细胞准备
- 在含有10% v/v胎牛血清（FBS）、1×青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、20% O2和5% CO2条件下培养HEK293T细胞。
- 将5 × 106个细胞接种至100 mm培养皿中，加入10 mL DMEM，于37 °C孵育过夜。
- 按照以下方法，将1 µg HBx和DDB1与分裂荧光素酶共同瞬时转染入细胞。
注意：转染质粒DNA的用量可能取决于所使用的转染试剂。分裂荧光素酶与目标蛋白融合的最佳位置需预先确定。本实验中，将LgBit融合至HBx的C末端（HBx-LgBit），将SmBit融合至DDB1的N末端（SmBit-DDB1）时结果最佳（即产生最强的荧光素酶信号）。该方法此前已有详细报道7。- 将表达HBx-LgBit的DNA质粒1 µg和表达SmBit-DDB1的DNA质粒1 µg（材料表）用DNA浓缩缓冲液（材料表）稀释至终体积300 µL。
- 加入16 µL增强剂溶液（材料表），涡旋混匀1秒。
- 室温孵育样品3分钟。
- 向样品中加入60 µL转染试剂（材料表），涡旋混匀10秒。
- 室温孵育样品8分钟。
- 孵育期间，吸除步骤1.2中准备的培养皿中的培养基，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，吸除PBS后加入7 mL DMEM。
- 向含有转染复合物的离心管中加入3 mL DMEM，用移液器吹打混匀，然后将转染复合物加入10 cm培养皿的细胞中。
- 将细胞置于含5% CO2的培养箱中，于37 °C孵育10小时。
- 按照以下方法，将细胞以每孔5 × 104个细胞、每孔50 µL培养基的密度重新接种至白色96孔板中。
- 移除用过的细胞培养基，用5 mL PBS洗涤细胞。
- 吸除PBS，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育5分钟以使细胞脱落。
- 加入4 mL DMEM，反复吹打细胞层表面使细胞悬液分散均匀，将细胞悬液转移至离心管中。
- 室温下以500 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中。
- 室温下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。
- 用补充了10% FBS的缓冲细胞培养基（材料表）将细胞沉淀稀释至接种密度为1.0 × 106个细胞/mL。
- 每孔加入50 µL细胞悬液至96孔板中，将细胞放回培养箱继续培养。
- 将细胞置于5% CO2环境中，于37 °C孵育10小时。
2. 化合物筛选
- 孵育期间，将筛选化合物（材料表）和溶剂（二甲基亚砜 [DMSO]）稀释至13.5倍浓度。例如，若母液浓度为10 mM，筛选浓度为10 µM，则将1 µL母液加入73.1 µL缓冲细胞培养基中。
- 向每孔加入12.5 µL发光底物（材料表），室温孵育5分钟。
注意：作为阴性对照，板的两端孔（即第1列和第12列）不应加入发光底物。 - 使用发光仪（材料表）测定基础发光值。
- 在初始测定后立即向每孔加入5 µL步骤2.1中稀释好的化合物及对照DMSO。
注意：最终浓度为10 µM。 - 每30分钟测定一次发光值，持续2小时。
注意：该板应在室温避光条件下孵育。 - 将信号归一化至基础值后，与对照DMSO处理组比较，计算抑制效应。
注意：每个化合物进行双复孔或三复孔筛选可减少变异。
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结果
采用本实验方案后的代表性结果如图2A,B所示。信噪比大于80，Z'因子9（高通量筛选的黄金标准质量指标）大于0.5，表明该检测系统适用于高通量筛选。以相较于对照组（仅含DMSO）抑制率>40%为阈值，我们筛选出硝唑尼特作为候选药物7。利用该系统，通过筛选其他更大规模的化合物文库，可发现更优的候选药物。
图1：HBx-DDB1相互作用的分裂荧...
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讨论
我们开发了一种利用分裂荧光素酶检测技术筛选HBx-DDB1结合抑制剂的便捷方法。该方法可在活细胞中实时检测相互作用动态，无需裂解细胞。抑制HBx-DDB1相互作用可恢复Smc5/6的功能，从而抑制病毒转录、蛋白表达以及cccDNA的产生7。这种新型抗病毒作用机制有望克服现有乙型肝炎病毒（HBV）疗法的不足。
尽管已有多种方法可用于研究活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，但检测这些相互作用仍然具有挑战性10。我们的实验流程简单，筛选一块96孔板仅需较短时间。此外，筛选质量令人满意，具有较高的Z'分数，这是高通量筛选的金标准质量指标9。我们的检测方法可能适用于机器人自动化11，是药物发现的一种高效检测手段。
尽管本实验方案中采用HEK293T细胞系是因其具有较高的转染效率和增殖能力，适用于高通量筛选，但该筛选方法无需修改即可应用于其他细胞系（例...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了日本文部科学省科研经费（#19H03430 和 #17K09405，授予 M.O.；#19J11829，授予 K.S.）、日本文部科学省创新领域研究经费（#18H05024，授予 M.O.）、日本医疗研究开发机构（AMED）肝炎研究项目（授予 M.O.，#JP19fk021005）、AMED 乙型肝炎新药创新开发与应用项目（#JP19fk0310102，授予 K.K.）、日本应用酶学基金会和小林癌症研究基金会的资助（授予 M.O.）、GSK 日本研究基金 2018（授予 K.S.）以及宫川纪念研究基金会基金（授予 K.S.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养微孔板，96孔，聚苯乙烯，平底 | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene 转染试剂 | Qiagen | 301425 | 包含DNA浓缩缓冲液、增强溶液和转染试剂 |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 微孔板发光检测仪 | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit 表达质粒DNA | 本实验室 | 可根据要求提供 | |
| HEK293T细胞 | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT 蛋白相互作用起始系统 | Promega | N2015 | 包含Nano-Glo活细胞试剂 |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | 在文稿中描述为"缓冲细胞培养基" |
| PBS | Takara | T900 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA批准药物库 V2 版本 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | 本研究中使用的化合物如下：对苯二酚单甲醚、巯嘌呤水合物、美司钠、戊诺醇、甲硫醇喘宁半硫酸盐、间羟胺酒石酸盐、美他沙酮、甲酰胆碱氯化物、甲乙唑胺、马尿酸甲氧胺、甲氯芬那酸、甲氨蝶呤、补骨脂素、甲溴东莨菪碱、甲琥乙酰脲、氢氯噻嗪、氨基酮戊酸甲酯盐酸盐·HCl、马来酸甲麦角新碱、美托拉宗、美替拉酮、盐酸美西律·HCl、米卡芬净、咪康唑、盐酸米多君·HCl、米格列醇、盐酸米那普仑·HCl、米氮平、米托坦、盐酸莫昔普利·HCl、糠酸莫米松、莫匹罗星、纳多洛尔、萘夫西林钠·Na、盐酸萘替芬·HCl、盐酸那拉曲坦·HCl、制霉菌素、盐酸奈必洛尔·HCl、奈拉滨、 Nepafenac、奈韦拉平、烟酸、尼古丁、尼洛替尼、尼鲁米特、硝唑尼特、尼替西农、呋喃妥因、尼扎替丁、盐酸去甲替林·HCl、柳氮磺吡啶钠·Na、奥利司他、氧苯唑嗪、三羟甲基氨基甲烷、氯化奥昔布宁、盐酸土霉素·HCl、帕利哌酮、盐酸帕洛诺司琼·HCl、硫酸巴龙霉素、盐酸帕唑帕尼·HCl、培美曲塞二钠、培米罗司特钾、青霉胺、青霉素G钾、喷他脒异烟酸盐、喷司他丁、培哚普利叔丁胺、氯菊酯、奋乃静、苯乙肼硫酸盐、去氧肾上腺素、植物甲萘醌、匹美克莫司、匹伐他汀钙，以及鬼臼毒素 |
| SmBit–DDB1 表达质粒DNA | 本实验室 | 可根据要求提供 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
参考文献
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