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用于研究原代肺泡上皮细胞中mRNA转录本稳定性的高效转录调控质粒表达系统

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DOI：

10.3791/60654

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2020年3月6日

 ,  ,  ,  , 
1Centre de Recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), 2Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 3Département de médecine, Faculté de médecine, Université de Montréal

本文内容

摘要

本文介绍了一种工具，可用于通过诱导型表达系统结合移液管电穿孔技术，研究转录后水平对原代肺泡上皮细胞中转录本的调控作用。

摘要

研究转录后调控对于理解特定信使RNA（mRNA）的调控机制及其对细胞稳态和代谢的影响至关重要。事实上，转录本表达水平的波动可能改变翻译效率，最终影响转录本的细胞功能。已有多种实验方法被开发用于研究mRNA的半衰期，但其中一些方法存在局限性，限制了对转录后调控的准确研究。启动子诱导系统可在合成型四环素调控启动子的控制下表达目的基因，该方法能够在不干扰细胞稳态的前提下，在任意实验条件下估算特定mRNA的半衰期。该方法的一个主要缺点是需要对细胞进行转染，这限制了其在原代分离细胞中的应用，因为这些细胞通常对常规转染技术具有高度抗性。原代培养的肺泡上皮细胞已被广泛用于研究肺泡上皮的细胞与分子生物学特性。由于原代肺泡细胞具有独特的特性和表型，因此在这些细胞中研究目的基因的转录后调控显得尤为必要。因此，我们的目标是开发一种新工具，用于在原代培养的肺泡上皮细胞中研究目的mRNA的转录后调控。我们设计了一种快速且高效的瞬时转染方案，将转录可控的质粒表达系统导入原代肺泡上皮细胞。该克隆策略利用病毒表位对构建体进行标记，从而可轻松区分外源构建体的表达与内源mRNA的表达。通过改进的ΔΔ定量循环（Cq）方法，可在不同时间点定量检测转录本的表达水平，以测定其半衰期。我们的数据表明，这种新方法在研究原代肺泡上皮细胞多种病理生理条件下转录后调控方面具有高效性和实用性。

引言

已开发出多种技术用于测定mRNA的半衰期。脉冲-追踪降解技术利用标记的mRNA，可在细胞干扰最小的情况下同时评估大量mRNA的稳定性。然而，该方法无法直接估算单个基因转录本的半衰期，也不能用于研究在生长因子、活性氧（ROS）、警报素或炎症刺激后mRNA的转录后调控过程1。

使用转录抑制剂（如放线菌素D和α-鹅膏蕈碱）是一种相对简单的方法，可用于随时间测量mRNA的降解动力学。与先前的技术（例如脉冲-追踪法）相比，该方法的一个主要优势在于能够直接估算特定转录本的半衰期，并比较不同处理条件对其降解动力学的影响。然而，转录抑制剂对细胞生理状态具有显著的有害影响，这是该方法的主要缺点2。事实上，这些药物对全细胞转录组的抑制会带来负面副作用，干扰参与mRNA稳定性的关键组分的合成，例如微小RNA（miRNA），以及RNA结合蛋白的表达与合成，而这些蛋白在mRNA降解和稳定性中起重要作用。因此，这些药物对基因转录的严重干扰可能会人为地改变转录本的降解曲线。

启动子诱导系统是测定特定mRNA半衰期的第三种方法。该方法测定特定mRNA降解的方式与使用转录抑制剂的方法类似。常用的诱导系统有两种：血清诱导的c-fos启动子3和Tet-Off可诱导系统4。使用c-fos系统时，无需使用可能对细胞有毒性的转录抑制剂。然而，该方法需要进行细胞周期同步化，从而无法评估转录本在间期的真实稳定性5。相比之下，Tet-Off系统可在合成型四环素调控启动子的控制下实现目的基因（GOI）的强表达。该系统需要两个元件共转染细胞后才能发挥功能。第一个质粒（pTet-Off）表达调控蛋白tTA-Adv，这是一种由原核阻遏蛋白TetR（来自大肠杆菌Escherichia coli）与三个来自病毒蛋白HSV VP16的转录激活结构域融合而成的杂合型合成转录因子。目的基因被克隆至pTRE-Tight质粒中，受控于一个合成启动子（PTight），该启动子包含巨细胞病毒（CMV）启动子的最小序列，并融合了七段tetO操纵子序列的重复片段。位于PTight下游基因的转录依赖于TetR与tetO的相互作用。当存在四环素或其衍生物多西环素（doxycycline）时，TetR阻遏蛋白对tetO操纵子的亲和力丧失，导致转录终止4。Tet-Off系统的特性使其成为研究真核细胞中特定mRNA表达的理想模型，同时避免了因真核细胞中缺乏原核调控序列而可能产生的多效性影响6。通常，采用双稳定Tet-Off细胞系（如HEK 293、HeLa和PC12）与该系统联用，以便将调控质粒和响应质粒整合入基因组，从而实现对基因表达的便捷调控7,8,9。

已采用多种肺泡上皮细胞的体外培养模型来研究肺泡上皮的细胞与分子生物学特性。多年来，研究人员广泛使用人或啮齿类动物的原代细胞10,11，以及永生化细胞系，如人源A549细胞或大鼠RLE-6TN细胞12,13。尽管原代培养的肺泡上皮细胞通常增殖能力较低，且培养和转染难度较大，但在生理和病理条件下研究肺泡上皮功能与功能障碍方面，它们仍是金标准。事实上，永生化细胞系（如A549细胞）并不具备原代细胞复杂的特性和表型，而原代培养的肺泡上皮细胞则能重现肺泡上皮的主要特性，尤其是形成极化且紧密屏障的能力14,15。然而，这些细胞对常规转染技术（如脂质体介导的转染）具有很强的抗性，使得使用Tet-Off等启动子诱导系统变得极为困难。

mRNA 的转录后调控是快速调节转录本基因表达的最有效方法之一16。mRNA 的 3' 非翻译区（3' UTR）在这一机制中起着重要作用。研究表明，与 5' UTR 不同，3' UTR 的长度与生物体的细胞复杂性和形态复杂性之间存在指数相关性。这种相关性表明，3' UTR 与 mRNA 编码区一样，在进化过程中经历了自然选择，从而实现了日益复杂的转录后调控17。3' UTR 包含多个蛋白质和 miRNA 的结合位点，这些位点可影响转录本的稳定性和翻译效率。

在本研究中，我们开发了一种工具，用于研究目的基因（GOI）3'非翻译区（3' UTR）中高度保守结构域在转录本稳定性调控中的作用。我们重点关注上皮钠通道α亚基（αENaC），该蛋白在肺泡上皮生理过程中发挥关键作用18。通过原代培养的肺泡上皮细胞，成功瞬时转染了Tet-Off系统的两个组分，该系统可在对细胞生理和代谢影响最小的情况下，研究3' UTR在mRNA稳定性中的作用，相较于其他方案中使用转录抑制剂的方法更具优势。我们设计了一种克隆策略，利用非内源性表达的表位（V5）来区分目的基因与内源基因的表达。随后，采用移液器电穿孔技术将应答质粒和调控质粒导入肺泡上皮细胞。接着，通过在不同时间点用多西环素处理细胞，检测转录本的表达水平。采用经转染的tTA-Ad mRNA产物作为归一化参照，结合改良的Cq法进行RT-qPCR分析，评估转录本的半衰期。通过本实验方案，我们提供了一种便捷的方法，用于在不同条件下研究转录本的转录后调控机制，并更深入地界定非翻译区的参与作用。

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方案

所有动物实验均按照加拿大动物护理委员会的指南进行，并已获得蒙特利尔大学医院研究中心（CRCHUM）机构动物护理委员会的批准。

1. 表达目的基因（GOI）的响应质粒的设计与构建

  1. 使用可诱导的四环素关闭型载体，例如 pTRE-Tight。
  2. 分析目的基因（GOI）序列和载体的多克隆位点（MCS），以确定 MCS 中存在但目的基因内部不存在的限制性酶切位点。
  3. 按照先前描述的方法19,20，从雄性 Sprague-Dawley 大鼠肺中分离原代肺泡上皮细胞。
  4. 采用标准方法（如酚/氯仿抽提法或基于硅胶膜的 RNA 离心柱法）提取肺泡上皮细胞的总 RNA。
  5. 使用 oligo(dT) 引物和高保真逆转录酶将 mRNA 逆转录为互补 DNA（cDNA）。
  6. 使用高保真 Taq 聚合酶和标准重叠 PCR 技术，通过设计的引物在目的基因两侧引入两个选定的限制性酶识别位点。
    1. 正向引物应包含 Kozak 共识核糖体结合位点21，以提高表达水平，便于同时研究蛋白表达与 mRNA 稳定性。在目的基因上游需包含编码 V5 表位的序列，以区分转染的目的基因表达与内源性表达（表 1）。
    2. 反向引物应在终止密码子后包含一个多聚腺苷酸化信号序列。
  7. 可通过连续缺失的方法构建突变体，以研究不同 3' 非翻译区（UTR）对目的基因 mRNA 稳定性的影响，使用编码多聚腺苷酸化位点的反向引物逐步删除目的基因 3' UTR 的 3' 端（图 6）。或者，可采用 PCR 定向突变技术靶向 3' UTR 中特定感兴趣区域22。
  8. 用先前选定的限制性内切酶在适宜温度下消化诱导型载体和插入片段 1 小时，随后在载体反应中加入磷酸酶处理 30 分钟，以防止自连。
  9. 通过 1-1.5% 琼脂糖凝胶电泳（浓度根据插入片段大小确定）分离经酶切的载体和插入片段。
  10. 使用刀片和紫外灯切下含有目标插入片段和载体的 DNA 条带并收集。
    注意：此步骤可暂停。
  11. 使用基于硅胶膜的 PCR 纯化试剂盒从琼脂糖凝胶中回收收集的 DNA 片段，并在 260 nm 处通过分光光度法测定其浓度。
  12. 使用 T4 DNA 连接酶将目的基因与诱导型载体连接，载体与插入片段的摩尔比为 1:3，以提高连接效率。在室温（RT）下孵育反应 3 小时。
  13. 将连接产物转化至感受态大肠杆菌（E. coli）DH5α 中。
    1. 将 1-10 ng 的载体和基因加入含有 100 µL 感受态细胞的离心管中。冰上孵育 30 分钟，然后 42 °C 热激 45 秒。再次置于冰上 2 分钟，加入 900 µL 室温 LB 培养基。在 37 °C 下以 225 rpm 振荡培养 1 小时。
    2. 取 100 µL 转化液涂布于含适当抗生素的 LB 琼脂平板（例如 pTRE-Tight 载体使用 100 µg/mL 氨苄青霉素）上，以筛选转化菌落。37 °C 过夜培养。
    3. 用接种环或 20 µL 枪头挑取单菌落，接种至含适当抗生素的 5 mL LB 培养基中，37 °C 振荡培养过夜。转化后的细菌可按 LB 培养基与甘油 400:600 的比例制成甘油菌，于 -80 °C 保存。
  14. 使用基于硅胶膜的质粒纯化柱提取质粒 DNA，并在 260 nm 处通过分光光度法测定其浓度。通过限制性酶切分析确认目的基因的插入，并通过测序验证其方向及排除 RT-PCR 过程中可能引入的突变。

2. 将表达目的基因（GOI）的报告质粒转染至原代肺泡上皮细胞

  1. 从大鼠肺组织中分离Ⅱ型肺泡上皮细胞。
  2. 将细胞以 1 × 106 个细胞/cm2 的密度接种于含完全最低必需培养基（完全 MEM）的 100 mm 培养皿中。完全 MEM 指在 MEM 基础上添加 10% 胎牛血清（FBS）、0.08 mg/L 妥布霉素、复方新诺明（3 µg/mL 甲氧苄啶和 17 µg/mL 磺胺甲噁唑）、0.2% NaHCO3、0.01 M HEPES（pH = 7.3）以及 2 mM L-谷氨酰胺。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养 24 小时。
  3. 次日，向新的 12 孔板每孔加入 500 µL 不含抗生素的完全 MEM，并在 37 °C 预热 30 分钟。此步骤中，应使用无四环素污染或四环素含量极低、不足以干扰诱导表达的胎牛血清。
  4. 在 1.5 mL 离心管中分别加入可诱导的目的基因质粒（GOI 质粒）和调控载体（如 pTet-Off），每孔各加入 1 µg GOI 质粒和 1 µg 调控载体，于室温下配制。若需进行与 RNA 结合蛋白（RBP）共表达的实验，则在 DNA 混合物中额外加入 1 µg 表达目标 RBP 的组成型表达载体（如 pcDNA3）（图 7）。
  5. 吸除培养基，用预热至 37 °C 的不含钙镁离子的 PBS 轻柔冲洗细胞。
  6. 加入 5 mL 预热至 37 °C 的 0.05% 胰蛋白酶，孵育至细胞脱落（2–4 分钟）。加入 10 mL 不含抗生素的完全 MEM 以中和胰蛋白酶活性。
  7. 将细胞悬液收集至 50 mL 离心管中，用 4 mL 培养基冲洗培养皿以尽可能回收残留细胞，随后将细胞悬液于 300 × g 离心 5 分钟。
  8. 轻柔吸除上清液，将沉淀用 1 mL PBS 重悬。使用血细胞计数板计数并计算细胞数量。
  9. 以 300 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，将沉淀用重悬缓冲液重悬至浓度为 4 × 107 个细胞/mL。取步骤 2.4 中配制的 1.5 mL 管中的细胞，按每孔 400,000 个细胞的量加入，并用移液器轻柔吹打混匀。
  10. 将离心管放入电穿孔装置中，并加入 3.5 mL 电解缓冲液。
  11. 将镀金电极头插入移液器枪头，完全压下活塞。轻柔混匀 1.5 mL 管中的内容物，小心用移液器吸取细胞悬液。注意避免气泡进入枪头，否则在电穿孔过程中会产生电弧，导致转染效率下降。
  12. 将移液器插入电穿孔仪，直至听到“咔哒”声。
  13. 选择适用于肺泡上皮细胞的电穿孔程序，对应脉冲电压为 1,450 V，2 次脉冲，脉宽 20 ms，然后在触摸屏上按下 开始。
  14. 转染后立即取出移液器，将细胞转移至预先加入已预热至 37 °C 的不含抗生素完全 MEM 的孔中。
  15. 对剩余样品重复步骤 2.11–2.14。
  16. 轻柔振荡培养板，使细胞均匀分布于孔底表面。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育。两天后，更换为含抗生素的完全 MEM。
  17. 通过荧光显微镜观察 eGFP 表达或使用表达 eGFP 的对照载体进行流式细胞术分析，确认转染成功（图 1）。
    注意：此步骤为可选，需额外进行一次转染，使用表达 eGFP 的不同质粒（如 pcDNA3-EGFP）。

3. 诱导目的基因的转录抑制

注意：可在强力霉素诱导前对细胞进行所需的处理，以评估这些处理对 mRNA 稳定性的影响（图 5）。

  1. 用去离子水配制浓度为 1 mg/mL 的多西环素储备液。将储备液于 -20 °C 避光保存。多西环素是一种四环素衍生物，因其半衰期比四环素长（2 倍），故优先选用。此外，完全失活 tet 操纵子所需的多西环素浓度也更低23。
    注意：多西环素可能影响内源性目的基因（GOI）的 mRNA 表达。为验证这一点，应检测多西环素处理 24 小时后对肺泡细胞的影响，以确认目的基因表达无任何变化（图 2）。
  2. 转染后 72 小时，在完全 MEM 培养基中新鲜配制 1 µg/mL 的多西环素溶液，并将其预热至 37 °C。
  3. 每孔加入 1 mL 含 1 µg/mL 多西环素的完全 MEM 培养基，替换原有培养基，以抑制目的基因的转录。
  4. 将多个孔板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育不同时间（15 分钟至 6 小时），以评估目的基因 mRNA 的半衰期。
  5. 处理结束后，用预冷的 PBS 洗涤细胞，然后每孔加入 500 µL 裂解缓冲液，使用商品化的苯酚-氯仿 RNA 提取试剂盒裂解细胞，并轻轻振荡培养板以充分匀浆。
  6. 按照试剂盒说明书提取 RNA。通过分光光度法在 230、260 和 280 nm 波长下测定 RNA 产量和纯度。当 RNA 样品的 260:230 和 260:280 比值分别为 1.8 和 2.0 时，视为纯度合格。
    注意：此步骤可暂停。

4. 确定目的基因mRNA的稳定性

  1. 用无RNA酶的DNA酶I（扩增级）处理1 µg总RNA，以去除可能干扰后续DNA扩增的质粒DNA残留。
    1. 在0.2 mL的PCR管中，加入1 µg总RNA、1 µL 10x DNase I反应缓冲液、1 µL DNase I（1 U/µL），并用RNase-free水补足至总体积为10 µL。
    2. 在室温下孵育反应20分钟。
    3. 通过向10 µL反应体系中加入1 µL 25 mM EDTA来灭活DNA酶I，并在70 °C孵育反应体系10分钟。
  2. 使用市售的cDNA合成试剂盒，结合oligo(dT)和随机六聚体引物，将去除了DNA的总RNA逆转录为cDNA，以提高逆转录效率。
    1. 简言之，向11 µL去除了DNA的总RNA混合物中加入4 µL 5x反应混合液、1 µL逆转录酶和4 µL无RNase的水，使总反应体积达到20 µL。用移液器反复吹打充分混匀反应体系。
    2. 在25 °C孵育反应5分钟，随后在46 °C孵育20分钟，最后在95 °C孵育1分钟以终止反应。每个反应可产生50 ng/µL的cDNA产物。
    3. 将20 µL cDNA反应体系加入180 µL分子生物学级水，稀释至浓度为5 ng/µL。cDNA产物可于-80 °C保存，或立即用于进行实时定量PCR（qPCR）。
      注意：此处可暂停本实验方案。
  3. 设计针对目的基因（GOI）的特异性qPCR正向和反向引物。
    1. 由于细胞中存在目的基因（GOI）的内源性表达，引物设计必须能够扩增出与目的基因（GOI）相连的V5表位的一段100–150 bp的扩增片段（表1).
    2. 内参基因引物也必须用作归一化对照。通常，看家基因如β-actin和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1）基因被用作参考基因。然而，由于转染效率存在差异，这些基因不能在此诱导系统中使用。取而代之的是，通过检测tTA-Ad转录本的表达来进行归一化，因为该转录本在细胞中由巨细胞病毒（cytomegalovirus）启动子驱动，呈组成型表达。通过qPCR检测到的其表达水平的任何变化均可代表转染效率（引物：上游5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3'，下游5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3'；扩增产物长度为129 bp），从而可用于对转染克隆的表达水平进行归一化处理图3).
  4. 使用 SYBR Green 染料预混液，每个 qPCR 反应设置三个复孔。
    1. 使用分子生物学级水将5 ng/µL的cDNA混合液稀释至1.25 ng/µL的浓度。
    2. 将 5 µL SYBR Green 染料预混液（2x）、0.1 µL 分子生物学级水、0.45 µL 7.5 µM 正向引物、0.45 µL 7.5 µM 反向引物以及 4 µL 1.25 ng/µL cDNA 混合，得到总体积为 10 µL 的反应体系。在 96 孔 PCR 板中通过上下吹打充分混匀。使用光学粘性封膜确保板盖密封，防止污染和蒸发。
    3. 短暂离心反应混合物，然后将反应板放入qPCR仪中。
  5. 使用以下qPCR条件扩增V5标签的GOI和tTA-Ad扩增子：95 °C变性10 min，随后进行40个循环，每个循环为95 °C 10 s、58 °C 15 s、72 °C 20 s。扩增循环结束后必须生成高分辨率熔解曲线，以评估目标扩增子的特异性熔解温度，并确保无非特异性扩增产物峰。
    1. 在qRT-PCR中设置阴性对照，包括以RNA为模板但不加逆转录酶进行qPCR，以检测是否存在质粒DNA污染；同时在qPCR反应体系中不添加cDNA进行qPCR，以确保无引物二聚体或污染物存在。
    2. 目的基因（GOI）的最佳cDNA浓度、引物效率及引物浓度需通过标准曲线实验进行优化。为此，使用未处理细胞（未添加多西环素培养）的cDNA进行系列稀释。标准曲线通过将Cq值对cDNA稀释倍数的对数作图生成，扩增效率（E）根据标准曲线的斜率，按以下公式计算：
      E = 10-1/斜率
      注意：扩增效率应在0.9至1.05之间。否则，必须重新设计引物。
  6. 使用比较Cq法分析qPCR数据，通过将目的基因（GOI）的表达值归一化至tTA-Ad的表达水平，计算目的基因的相对表达量，并以同一动物来源细胞在起始时间点（t = 0）时目的基因mRNA表达水平的百分比形式报告其表达量图4).
  7. 半衰期通过以下公式，由目的基因（GOI）mRNA降解曲线的速率常数（K）确定：
    t1/2 = ln 2/K。

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结果

本方案已成功用于构建 Tet-Off 转录调控型质粒表达系统，以评估 αENaC 3' 非翻译区（UTR）不同片段在原代肺泡上皮细胞中对转录本稳定性的调控作用。

实施该系统的第一步是建立一种快速、简便且高效的原代培养肺泡上皮细胞转染技术，这类细胞通常难以转染。如图1所示，移液管电穿孔技术可实现25–30%的转染效率，该数据通过荧光显微镜和流式细胞术检测到的表达eGFP的细胞比例得出。

在应用由四环素及其衍生物控制的该诱导系统之前，首先验证了该药物对目的基因（GOI）表达的影响。肺泡上皮细胞经处理后 1.0 µg/mL 多西环素处理以评估其对内源性 αENaC mRNA 表达的影响。如图所示，经过 1–24 小时的处理，对内源性转录本的表达无显著影响。

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讨论

原代培养的肺泡上皮细胞转染效率低，一直是应用 Tet-Off 系统评估这些细胞中 mRNA 稳定性的严重限制因素。然而，通过移液管电穿孔技术克服了这一限制，实现了 25–30% 的转染效率（图 1 和 图 3）26。

转录本稳定性的测定对于理解特定mRNA的调控机制及其对细胞稳态和代谢的影响至关重要。目的基因（GOI）生物可利用性的变化可能改变翻译效率，并直接影响该基因在细胞内的表达水平。因此，已发展出多种技术用于测定mRNA的半衰期。如上所述，这些技术均存在一定的局限性和约束条件，限制了对目标转录本的准确研究。与其他方法相比，本文所建立的TET-off模型具有可在任意实验条件下估算特定mRNA半衰期的优势。然而，该模型无法直接研究内源性转录本的稳定性。为尽可能克服这一局限，建议在质粒中包含该转录本的5'非翻译区（5' UTR）和3'非翻译区（3' UTR）序列，使构建的表达载体尽可能接近内源性转录本。V5表位的引入...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

Francis Migneault 获得了魁北克呼吸健康网络和加拿大卫生研究院（CIHR）肺部培训项目提供的博士后奖学金，以及来自 FRSQ 和蒙特利尔大学研究生与博士后学院的博士生奖学金支持。本研究得到了 Gosselin-Lamarre 临床研究讲席和加拿大卫生研究院 [YBMOP-79544] 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
放线菌素DSigma-AldrichA9415
氨苄青霉素Sigma-AldrichA1593
亮线血细胞计数板Sigma-AldrichZ359629
氯仿 - 分子生物学级Sigma-AldrichC2432
ClaINew England BiolabsR0197S
环己酰亚胺Sigma-AldrichC7698
DM IL LED 倒置显微镜，配备相差功能Leica-
DNase I，扩增级Invitrogen18068015
盐酸多西环素Sigma-AldrichD9891-1G
杜尔贝科’不含钙和镁的D-磷酸盐缓冲液（D-PBS）Wisent Bioproducts311-425-CL
乙醇 - 分子生物学级Fisher ScientificBP2818100
Excella E25 恒温振荡培养箱Eppendorf1220G76
甘油Sigma-AldrichG5516
HEPES pH 7.3Sigma-AldrichH3784
Heracell 240i赛默飞世尔科技51026420
iScript cDNA合成试剂盒伯乐生命科学公司1708890
异丙醇 - 分子生物学级Sigma-AldrichI9516
LB肉汤（Lennox）Sigma-AldrichL3022
LB 肉汤加琼脂（Lennox）Sigma-AldrichL2897
L-谷氨酰胺Sigma-AldrichG7513
铜绿假单胞菌的脂多糖10Sigma-AldrichL9143
MEM，粉末Gibco61100103
MicroAmp 光学 96 孔反应板应用生物系统公司N8010560
MicroAmp 光学粘性膜应用生物系统公司4360954
MSC-Advantage II级生物安全柜赛默飞世尔科技51025413
Mupid-exU 电泳系统Takara BioAD140
NanoDrop 2000cThermoFisher ScientificND-2000
Neon 转染系统 10 µL 型试剂盒InvitrogenMPK1025
Neon 转染系统入门装InvitrogenMPK5000S
NheINew England BiolabsR0131S
One Shot OmniMAX 2 T1R 化学感受态 E. coliInvitrogenC854003
pcDNA3 载体赛默飞世尔科技V790-20
pcDNA3-EGFP 质粒Addgene13031
PlatinumTaq DNA聚合酶 高保真Invitrogen11304011
pTet-Off Advanced 载体Takara Bio631070
pTRE-Tight 载体Takara Bio631059
纯化的肺泡上皮细胞无可用数据未提供
QIAEX II 琼脂糖凝胶回收试剂盒QIAGEN20021
QIAGEN 质粒大提试剂盒QIAGEN12162
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒QIAGEN27104
QuantStudio 6 和 7 Flex 实时荧光定量 PCR 系统软件Applied Biosystems无可用数据
QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量 PCR 系统，96 孔快速板Applied Biosystems4485697
重组大鼠TNF-α蛋白R&D Systems510-RT-010
SeptraSigma-AldrichA2487
重组虾碱性磷酸酶（rSAP）New England BiolabsM0371S
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix伯乐生命科学公司1725270
SuperScript IV 逆转录酶Invitrogen18090010
T4 DNA连接酶赛默飞世尔科技EL0011
四环素系统认证胎牛血清Takara Bio631367
妥布霉素Sigma-AldrichT4014
TRIzol试剂Invitrogen15596018
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红Gibco25300054
UltraPure 琼脂糖Invitrogen16500500
水，分子生物学级Wisent Bioproducts809-115-EL

参考文献

  1. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
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