实体瘤细胞系中侧群细胞的分析

摘要

介绍了一种方便、快速且经济高效的方法，用于测定实体肿瘤细胞系中侧群细胞的比例。

摘要

肿瘤干细胞（CSCs）是导致肿瘤生长、转移和复发的重要原因。分离和鉴定肿瘤干细胞对肿瘤研究具有重要意义。目前已有多种技术用于从肿瘤组织和肿瘤细胞系中鉴定和纯化肿瘤干细胞，其中侧群（SP）细胞的分离与分析是常用方法之一。这些方法基于肿瘤干细胞能够快速排出荧光染料（如Hoechst 33342）的特性。染料的外排与ATP结合盒（ABC）转运蛋白相关，并可被ABC转运蛋白抑制剂所抑制。本文描述了使用Hoechst 33342对培养的肿瘤细胞进行染色，并通过流式细胞术分析其侧群细胞比例的方法。该检测方法简便、快速且成本较低。由此获得的数据有助于更深入理解基因或其他细胞内外信号对肿瘤细胞干性特征的影响。

引言

肿瘤干细胞（CSCs）是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞亚群，在肿瘤生长、转移和复发中发挥关键作用^1,2。目前，已在多种恶性肿瘤中发现CSCs的存在，包括肺癌、脑癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和肝癌^{3,4,5,6,7,8,9}。这些肿瘤中CSCs的鉴定主要依赖于细胞表面标志蛋白的表达，例如CD44、CD24、CD133和Sca-1的高表达和/或低表达^9,10，但迄今为止尚未报道能够明确区分CSCs与非CSCs的特异性标志物。目前，已有多种技术用于肿瘤组织或肿瘤细胞系中CSCs的鉴定与纯化，这些技术基于CSCs的特定生物学特性而设计。其中，侧群（side population, SP）细胞的功能检测与分选是两种常用的方法。

方案

1. 细胞制备

1. 细胞消化与中和
   1. 将肿瘤细胞（如 MDA-MB-231 细胞）接种于 6 孔板中，并在 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中进行培养。
   2. 当细胞密度达到约 90% 时收集细胞。彻底吸除培养基，用 3 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞 2 次。
      注意：为研究信号通路抑制剂（例如 FRA1 抑制剂）或激活剂（例如 STAT3 激活剂）对肿瘤细胞干性特征的影响，可将肿瘤细胞接种于 6 孔板中，并在收集前用抑制剂或激活剂预处理一定时间。
   3. 向 6 孔板的每孔中加入 500 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 1–3 分钟（min），轻轻敲击培养板使细胞脱落。
      注意：消化时间过长会影响侧群（SP）谱型，原因是细胞活力发生变化。
   4. 向 6 孔板每孔中加入 3 mL 含 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 以终止消化反应，并轻轻吹打细胞 3–5 次，使细胞团块充分分散。
   5. 取 0.5 mL 细胞悬液加入新 6 孔板的一个孔中，在显微镜下观察。若观察到细胞团块，需将细胞悬液通过 70 µm 细胞筛过滤。
      注意：此步骤为可选步骤。
   6. 将细胞转移至 15 mL 离心管中，以 200 × g 离心 5 分钟以收集细胞。弃去上清液，用....

结果

根据该方法进行了四项实验性SP分析。在第一项实验中，我们检测了MDA-MB-231细胞在正常条件下SP细胞的比例，MDA-MB-231是一种三阴性人乳腺癌细胞系。细胞计数后，向含有1 × 10⁶个细胞的一管中加入Hoechst 33342，使其终浓度为3 µg/mL；向另一管中加入利血平和Hoechst 33342，使其终浓度分别为40 µM和3 µg/mL。向两管中均加入PI。FSC-A（X轴）对PI-A（Y轴）的散点图显示了三个群体：1）PI阳性细胞群体，代表死亡细胞；2）细胞碎片；3）主要群体为PI阴性细胞，用于进一步分析（图1A，B）。从FSC-A（X轴）对FSC-W（Y轴）散点图以及SSC-A（X轴）对SSC-W（Y轴）散点图中圈选单一细胞群体，用于分析SP细胞的比例（图1A，B）。SP细胞从Hoechst Red-A（X轴）对Hoechst Blue-A（Y轴）散点图中圈选，其在MDA-MB-231细胞中的比例约为0........

讨论

进行SP实验时需注意几个关键点。首先是为每种细胞系选择合适的阻断剂，例如维拉帕米（Verapamil）或利血平（Reserpine），因为 "门控" SP细胞的位置根据加入阻断剂后大量SP细胞消失的位置来确定。对于MDA-MB-231细胞系，利血平（Reserpine）效果良好；但对于其他细胞系，可能不同的阻断剂效果更佳。

第二个因素是 Hoechst 33342 的浓度。如代表性数据所示，随着 Hoechst 33342 染色浓度的降低，SP 细胞的比例增加。这一现象可通过染料摄取动力学²⁴加以解释。染料浓度的变化会影响 Hoechst 33342 在细胞内的富集程度。因此，Hoechst 33342 的染色浓度与 SP 检测结果密切相关。此外，不同细胞类型对 Hoechst 33342 的摄取和排出能力存在差异。因此，在进行 SP 分析前，需针对不同细胞系探索合适的 Hoechst 33342 浓度。

第三，流式细胞仪的良好变异系数（CV）对于SP分析也至关重.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 孔细胞培养板	CORNING	3516	9.5 cm2（约）
Colivelin	MCE	HY-P1061A	Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
胎牛血清（FBS）	Biological Industries (BIOIND)	04-001-1ACS
流式细胞仪	BD Biosciences		BD LSRFortessa
流式细胞仪软件	BD Biosciences		FACSDiva
流式细胞术分析软件	BD Biosciences		FlowJo
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	bisBenzimide H 33342 三盐酸盐
聚苯乙烯圆底试管	CORNING	352054	12 × 75 mm，5 mL
碘化丙啶（PI）	Sigma-Aldrich	P4170	3,8-二氨基-5-[3-(二乙基甲基铵)丙基]-6-苯基菲啶鎓二碘化物
利血平	Sigma-Aldrich	83580	(3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-二甲氧基-18-[(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)氧]育亨烷-16-羧酸甲酯
SKLB816	由四川大学杨胜勇博士提供
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Gibco	25200072
盐酸维拉帕米	Sigma-Aldrich	V4629	5-[N-(3,4-二甲氧基苯乙基)甲基氨基]-2-(3,4-二甲氧基苯基)-2-异丙基戊腈盐酸盐