实体瘤细胞系中侧群细胞的分析

摘要

介绍了一种方便、快速且经济高效的方法，用于测定实体肿瘤细胞系中侧群细胞的比例。

摘要

肿瘤干细胞（CSCs）是导致肿瘤生长、转移和复发的重要原因。分离和鉴定肿瘤干细胞对肿瘤研究具有重要意义。目前已有多种技术用于从肿瘤组织和肿瘤细胞系中鉴定和纯化肿瘤干细胞，其中侧群（SP）细胞的分离与分析是常用方法之一。这些方法基于肿瘤干细胞能够快速排出荧光染料（如Hoechst 33342）的特性。染料的外排与ATP结合盒（ABC）转运蛋白相关，并可被ABC转运蛋白抑制剂所抑制。本文描述了使用Hoechst 33342对培养的肿瘤细胞进行染色，并通过流式细胞术分析其侧群细胞比例的方法。该检测方法简便、快速且成本较低。由此获得的数据有助于更深入理解基因或其他细胞内外信号对肿瘤细胞干性特征的影响。

引言

肿瘤干细胞（CSCs）是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞亚群，在肿瘤生长、转移和复发中发挥关键作用^1,2。目前，已在多种恶性肿瘤中发现CSCs的存在，包括肺癌、脑癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和肝癌^{3,4,5,6,7,8,9}。这些肿瘤中CSCs的鉴定主要依赖于细胞表面标志蛋白的表达，例如CD44、CD24、CD133和Sca-1的高表达和/或低表达^9,10，但迄今为止尚未报道能够明确区分CSCs与非CSCs的特异性标志物。目前，已有多种技术用于肿瘤组织或肿瘤细胞系中CSCs的鉴定与纯化，这些技术基于CSCs的特定生物学特性而设计。其中，侧群（side population, SP）细胞的功能检测与分选是两种常用的方法。

SP细胞最初由Goodell等人¹¹发现，当时他们正在对小鼠骨髓细胞中的造血干细胞进行表征。当用荧光染料Hoechst 33342标记小鼠骨髓细胞时，在流式细胞术检测的二维点图中出现了一小群Hoechst 33342染色较弱的细胞。Hoechst 33342是一种DNA结合染料，至少具有两种不同的结合模式，从而产生不同的光谱特性。当同时检测两个波长的荧光发射时，可以揭示出多个细胞群体¹²。在该实验中，Hoechst 33342在350 nm处被激发，荧光信号通过450/20 nm带通（BP）滤光片和675 nm长波通边缘（EFLP）滤光片进行检测¹¹。与骨髓细胞总体相比，这群细胞富集了被称为SP细胞的造血干细胞¹¹。SP细胞能够快速排出Hoechst 33342，这种染料的外排与ATP结合盒（ABC）转运蛋白相关¹³，而该过程可被某些试剂如Fumitremorgin C¹⁴、维拉帕米（Verapamil）和利血平（Reserpine）所抑制^15,16。此后，在多种组织、器官、肿瘤组织及肿瘤细胞系中均检测到了不同比例的SP细胞^17,18,19。这些SP细胞具有许多干细胞的特征^17,19。

本文描述了Hoechst 33342对培养的肿瘤细胞进行标记和染色的方法，以及通过流式细胞术分析侧群细胞（SP细胞）的技术。此外，展示了利用该方法优化Hoechst 33342浓度并为特定肿瘤细胞系选择合适阻断剂的策略。最后，演示了干性促进或抑制信号对肿瘤细胞中SP细胞比例的影响。实验示例表明，SP细胞分析可用于探究多种信号（如基因表达、小分子抑制剂、激活剂、细胞因子和趋化因子）对肿瘤干性的影响。与其他肿瘤干细胞（CSCs）分离和纯化方法（如CD44⁺/CD24^–细胞群分选、醛脱氢酶（ALDH）分析以及肿瘤球形成实验）相比，该方法操作简便且成本较低。

方案

1. 细胞制备

1. 细胞消化与中和
   1. 将肿瘤细胞（如 MDA-MB-231 细胞）接种于 6 孔板中，并在 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中进行培养。
   2. 当细胞密度达到约 90% 时收集细胞。彻底吸除培养基，用 3 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞 2 次。
      注意：为研究信号通路抑制剂（例如 FRA1 抑制剂）或激活剂（例如 STAT3 激活剂）对肿瘤细胞干性特征的影响，可将肿瘤细胞接种于 6 孔板中，并在收集前用抑制剂或激活剂预处理一定时间。
   3. 向 6 孔板的每孔中加入 500 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 1–3 分钟（min），轻轻敲击培养板使细胞脱落。
      注意：消化时间过长会影响侧群（SP）谱型，原因是细胞活力发生变化。
   4. 向 6 孔板每孔中加入 3 mL 含 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 以终止消化反应，并轻轻吹打细胞 3–5 次，使细胞团块充分分散。
   5. 取 0.5 mL 细胞悬液加入新 6 孔板的一个孔中，在显微镜下观察。若观察到细胞团块，需将细胞悬液通过 70 µm 细胞筛过滤。
      注意：此步骤为可选步骤。
   6. 将细胞转移至 15 mL 离心管中，以 200 × g 离心 5 分钟以收集细胞。弃去上清液，用 3 mL 含 2% FBS 的 PBS 重悬细胞沉淀。吹打 3–5 次，充分混匀。
2. 细胞计数
   1. 取 50 μL 细胞悬液加入 1.5 mL 微量离心管中，与 50 μL 台盼蓝溶液混合。取 10 μL 混合液，采用标准方法（如血细胞计数板法）对活细胞数量进行计数。
   2. 用含 2% FBS 的 PBS 将细胞稀释至终浓度为 1 × 10⁶ 个/mL。取 1 mL 细胞悬液加入 5 mL 聚苯乙烯圆底试管中，制备两份样品管。

2. 使用 Hoechst 33342 对细胞进行染色

1. 向一个试管中加入 Hoechst 33342，使其达到适当的终浓度。
   注意：例如，Hoechst 33342 对 MDA-MB-231 细胞的合适浓度为 3 µg/mL。
2. 添加阻断剂 （例如，将伏立康唑 C、维拉帕米或利血平）加入另一管中，使其达到适当的终浓度，37 °C 孵育 30 分钟后，加入与步骤 2.1 中所述相同浓度的 Hoechst 33342。
   注意：对于 MDA-MB-231 细胞，合适的阻断剂为利血平（40 µM）。利血平用作阻断对照，以验证门控 SP 区域中无细胞存在。
3. 准备多个含有细胞的离心管，并向其中加入 Hoechst 33342 不同的浓度梯度。流式细胞术检测后，根据SP细胞的图谱及其比例选择合适的浓度。
   注意：此为可选步骤，用于确定 Hoechst 33342 的合适浓度。
4. 准备多支含有细胞的离心管，加入不同浓度梯度的阻断剂，37 °C孵育30分钟，然后加入适当浓度的Hoechst 33342。流式细胞术检测后，根据门控SP区域中无细胞的情况选择合适的阻断剂浓度。
   注意：此为可选步骤，用于确定阻断剂的合适浓度。
5. 将试管置于37 °C培养箱中孵育60分钟，每隔10分钟摇动一次试管。
   注意：充分振荡试管对染色至关重要，因为这能确保细胞与染料充分接触，从而获得更佳的染色效果。
6. 孵育结束后，以 200 x g，4 °C 下离心 5 分钟，小心吸除上清液，因为细胞会形成沉淀 非常松散且不稳定的沉淀物
7. 将每管细胞重悬于1 mL预冷的含2% FBS的PBS中，上下吹打3–5次以充分混匀。向每管细胞悬液中加入1 μL 1 mg/mL的碘化丙啶（PI）以标记死细胞。
   注意：此步骤中的所有操作均应在 4 °C 下进行，以抑制 Hoechst 33342 从肿瘤细胞中流出。试管应避免直接暴露于光线下。

3. 流式细胞术分析

注意：本节及补充图1–10中描述了流式细胞仪软件（参见材料表）的使用说明。

1. 在流式细胞仪软件中，单击 文件夹 按钮。单击 实验 按钮，然后单击 新实验 (补充图 1A,B).
2. 点击 好的 按钮。“Experiment_001”将显示在下方 文件夹 (补充图 2A,B).
3. 点击 实验_001 按钮以将文件夹名称更改为特定名称（例如， "20191118-SP"）。点击 进入。新名称（"20191118-SP"）将显示在下方 文件夹 (补充图3A,B).
4. 点击 新样本 按钮，将样本添加到新实验文件夹中（"20191118-SP"）。点击 新管 按钮以向样本中添加试管。点击 箭头 按钮（补充图 4A-C).
5. 点击 参数 按钮并设置流式细胞仪的参数（补充图5).
   1. 使用610 nm短通二向色镜（DMSP）分离发射光波长。采用450/20 nm带通滤光片收集蓝色荧光，使用675 nm长通滤光片（EFLP）收集红色荧光。
      注意：Hoechst 33342 使用 355 nm 的紫外激光激发，PI 在 488 nm 处激发。
6. 在流式细胞仪上运行细胞样品。
   注意：SP细胞可在无菌条件下通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分选。后续实验应收集100,000–500,000个细胞。
   1. 使用流式细胞仪检测经 Hoechst 33342 染色的细胞。
      1. 将用 Hoechst 33342 染色的细胞样品管置于流式细胞仪上。
      2. 点击 点图 按钮以显示点图，然后单击 X轴 并将其设置为“FSC-A“；点击” Y轴 并将其设置为“PI-A显示前向散射脉冲面积（FSC-A，X轴设为线性模式）与碘化丙啶荧光（PI荧光，Y轴设为对数刻度）的散点图。调整电压，使活细胞位于右侧，而死细胞因强烈荧光位于左侧明亮区域 用PI染色，位于左上角 角落。然后，建立一个多边形门以排除死细胞和细胞碎片（图1A) 通过点击 多边形门 按钮用于圈选P1亚群，也称为FSC-A、PI-A亚群（补充图 6A,B).
      3. 点击 点图 按钮以显示点图，点击 X轴 并将其设置为“FSC-A“；点击Y轴并将其设置为“FSC-W”。显示FSC-A（X轴）与前向散射脉冲宽度（FSC-W，Y轴）的散点图。右键单击该散点图，然后单击 P1 按钮位于下方 显示种群 按钮。单击 矩形门 按钮以创建一个矩形门，用于圈选 P2 亚群（也称为 FSC-A、FSC-W 亚群）。这将排除体积较大的细胞（补充图 7A-C 和 图1A).
      4. 点击 点图 按钮以显示点图，单击该 X轴 并将其设置为“SSC-A“；点击” Y轴 并将其设置为“SSC-W显示侧向散射脉冲面积（SSC-A，X轴）与侧向散射脉冲宽度（SSC-W，Y轴）的散点图。右键单击该散点图，然后单击 P2 按钮下方 显示种群 按钮。然后单击 矩形门 按钮以创建一个矩形门，圈选P3亚群（也称为SSC-A、SSC-W亚群）。这将获得一个粒度均一的细胞群体（补充图 8A-C 和 图1A).
      5. 点击 点图 按钮以显示点图，单击该 X轴 并将其设置为“Hoechst Red-A“；点击” Y轴 并将其设置为“Hoechst 蓝-A”。显示 Hoechst Red-A（X 轴）与 Hoechst Blue-A（Y 轴）的散点图。右键单击散点图，点击 P3 按钮位于下方 显示种群 按钮。单击 多边形门 按钮以创建一个多边形门，用于圈选P4亚群（也称为Hoechst Red-A、Hoechst Blue-A亚群）。右键单击散点图，然后单击 显示种群层级 按钮以显示人口层级结构。
         注意：点图将显示三个不同的细胞群：1）位于图中心附近的G0-G1期细胞群；2）位于右上角附近的S-G2/M期细胞群；3）SP细胞群。随后对SP细胞群设门进行进一步分析补充图 9A-D 和 图1A）。如果Hoechst Red-A与Hoechst Blue-A的散点图未显示一个 SP谱图与所示相似 图1A此时应调整电压，直至观察到相似的曲线轮廓。同时，相应地调节上述所有门控。
      6. 确定SP细胞的门控区域后，点击 获取数据 收集每份样本的 20,000–100,000 个事件，以分析 SP 细胞的百分比（补充图10).
   2. 将经阻断剂处理并用Hoechst 33342染色的细胞在流式细胞仪上进行检测。
      1. 将含有阻断剂的试管置于流式细胞仪上，使用相同的电压和设门参数运行细胞，以进一步确认电压和设门的选择是否恰当。
         注意：与单独使用 Hoechst 33342 染色相比，仅 若有细胞出现，其数量也应仅有极小部分位于SP门控区域内图1B).
      2. 从每个样本中收集 20,000–100,000 个事件，以分析 SP 细胞的百分比。

4. 数据分析

注意：流式细胞术分析软件的使用说明（参见 材料表本节描述了） 补充图11–16.

1. 将 fcs 格式的文件复制到计算机，打开流式细胞仪分析软件，将一个样本文件拖入软件中（补充图11A,B).
2. 分选细胞并获得SP细胞的百分比。
   1. 双击此处 样本文件，点击 X轴 并将其设置为“FSC-A“；点击” Y轴 并将其设置为“PI-A”。然后，创建一个多边形门控并单击 好的 按钮以获取 FSC-A、PI-A 子集（补充图 12A-E).
   2. 双击 FSC-A、PI-A 子集文件，点击 X轴 并将其设置为“FSC-A”；点击 Y轴 并将其设置为“FSC-W”。然后，创建一个矩形门控并单击 好的 按钮以获取FSC-A、FSC-W子集（补充图 13A-E).
   3. 双击 FSC-A、FSC-W 子集文件，点击 X轴 并将其设置为“SSC-A”；点击 Y轴 并将其设置为“SSC-W”。然后，创建一个矩形门控并单击 好的 按钮以获取 SSC-A、SSC-W 子集（补充图 14A-E).
   4. 双击 SSC-A、SSC-W 子集文件，点击 X轴 并将其设置为“Hoechst Red-A“；点击” Y轴 并将其设置为“Hoechst 蓝-A”。然后，创建一个多边形门控并单击 好的 按钮以获取 Hoechst Red-A、Hoechst Blue-A 子集（补充图 15A-E).
   5. 单击以打开布局编辑器 打开布局编辑器 按钮。拖动 SSC-A、SSC-W 子集文件 到布局编辑器，然后单击 单击将布局窗口保存到文件 保存图像结果的按钮（补充图 16A-C).
3. 关闭软件时保存工作区以保留设门信息。
4. 使用统计分析软件进行 t 检验分析，以比较两组之间的差异。P 值小于 0.05 被认为具有统计学意义。 < 0.05 被定义为具有统计学意义。

结果

根据该方法进行了四项实验性SP分析。在第一项实验中，我们检测了MDA-MB-231细胞在正常条件下SP细胞的比例，MDA-MB-231是一种三阴性人乳腺癌细胞系。细胞计数后，向含有1 × 10⁶个细胞的一管中加入Hoechst 33342，使其终浓度为3 µg/mL；向另一管中加入利血平和Hoechst 33342，使其终浓度分别为40 µM和3 µg/mL。向两管中均加入PI。FSC-A（X轴）对PI-A（Y轴）的散点图显示了三个群体：1）PI阳性细胞群体，代表死亡细胞；2）细胞碎片；3）主要群体为PI阴性细胞，用于进一步分析（图1A，B）。从FSC-A（X轴）对FSC-W（Y轴）散点图以及SSC-A（X轴）对SSC-W（Y轴）散点图中圈选单一细胞群体，用于分析SP细胞的比例（图1A，B）。SP细胞从Hoechst Red-A（X轴）对Hoechst Blue-A（Y轴）散点图中圈选，其在MDA-MB-231细胞中的比例约为0....

讨论

进行SP实验时需注意几个关键点。首先是为每种细胞系选择合适的阻断剂，例如维拉帕米（Verapamil）或利血平（Reserpine），因为 "门控" SP细胞的位置根据加入阻断剂后大量SP细胞消失的位置来确定。对于MDA-MB-231细胞系，利血平（Reserpine）效果良好；但对于其他细胞系，可能不同的阻断剂效果更佳。

第二个因素是 Hoechst 33342 的浓度。如代表性数据所示，随着 Hoechst 33342 染色浓度的降低，SP 细胞的比例增加。这一现象可通过染料摄取动力学²⁴加以解释。染料浓度的变化会影响 Hoechst 33342 在细胞内的富集程度。因此，Hoechst 33342 的染色浓度与 SP 检测结果密切相关。此外，不同细胞类型对 Hoechst 33342 的摄取和排出能力存在差异。因此，在进行 SP 分析前，需针对不同细胞系探索合适的 Hoechst 33342 浓度。

第三，流式细胞仪的良好变异系数（CV）对于SP分析也至关重...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 孔细胞培养板	CORNING	3516	9.5 cm2（约）
Colivelin	MCE	HY-P1061A	Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
胎牛血清（FBS）	Biological Industries (BIOIND)	04-001-1ACS
流式细胞仪	BD Biosciences		BD LSRFortessa
流式细胞仪软件	BD Biosciences		FACSDiva
流式细胞术分析软件	BD Biosciences		FlowJo
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	bisBenzimide H 33342 三盐酸盐
聚苯乙烯圆底试管	CORNING	352054	12 × 75 mm，5 mL
碘化丙啶（PI）	Sigma-Aldrich	P4170	3,8-二氨基-5-[3-(二乙基甲基铵)丙基]-6-苯基菲啶鎓二碘化物
利血平	Sigma-Aldrich	83580	(3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-二甲氧基-18-[(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)氧]育亨烷-16-羧酸甲酯
SKLB816	由四川大学杨胜勇博士提供
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Gibco	25200072
盐酸维拉帕米	Sigma-Aldrich	V4629	5-[N-(3,4-二甲氧基苯乙基)甲基氨基]-2-(3,4-二甲氧基苯基)-2-异丙基戊腈盐酸盐