在杜氏肌营养不良症患者样本中评估反义寡核苷酸临床试验中外显子跳跃效率

摘要

在此，我们通过Sanger测序、RT-PCR和蛋白质印迹法对临床试验中抗肌萎缩蛋白38的表达进行了分子表征。

摘要

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种退行性肌肉疾病，可导致肌肉质量进行性丧失，并引发早亡。此类突变常引起阅读框移位和提前出现终止密码子，导致几乎完全缺乏抗肌萎缩蛋白（dystrophin）。通过使用反义寡核苷酸（AONs）诱导外显子跳跃，可纠正阅读框。吗啉代反义寡核苷酸viltolarsen（代号：NS-065/NCNP-01）已被证实可诱导第53号外显子跳跃，从而为存在第52号外显子缺失的患者恢复阅读框。我们近期在一项探索性的、由研究者发起的、针对NS-065/NCNP-01的首次人体临床试验中，对DMD患者进行了静脉给药。在本方法学文章中，我们介绍了在该临床试验中利用Sanger测序、逆转录PCR（RT-PCR）和蛋白质印迹法（western blotting）对抗肌萎缩蛋白表达进行的分子表征。由于未开展任何功能结局检测，对抗肌萎缩蛋白表达的表征在本研究中对于证明药物疗效具有基础性作用。

引言

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种退行性肌肉疾病，可导致进行性肌肉质量丧失、呼吸衰竭和心肌病，并引发早亡¹。该疾病由大型结构性肌肉蛋白——抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的缺失所致²。位于X染色体上的DMD基因突变为隐性遗传，每3500至5000名新生男婴中约有1人患病^3,4,5。这些突变通常发生在第44至55号外显子之间的热点区域，表现为大片段缺失，导致阅读框移位和提前出现终止密码子，进而引发无义介导的mRNA降解，使抗肌萎缩蛋白几乎完全缺失^6,7,8。通过使用反义寡核苷酸（AONs）可纠正阅读框，该方法诱导外显子跳跃，恢复阅读框，部分恢复抗肌萎缩蛋白的表达，从而延缓疾病进展^9,10,11。吗啉代反义寡核苷酸药物eteplirsen最近已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准，可诱导第51号外显子跳跃，适用于第52号外显子缺失的患者^12,13。然而，第53号外显子跳跃可恢复第52号外显子缺失患者的阅读框，有望治疗约10%的DMD患者¹⁴。吗啉代反义寡核苷酸药物NS-065/NCNP-01已被证实可在人源细胞中诱导第53号外显子跳跃，我们近期在一项1期开放标签、剂量递增的临床试验中（下文简称"本研究"）（注册号：UMIN: 000010964 和 ClinicalTrials.gov: NCT02081625）对DMD患者给予了NS-065/NCNP-01治疗¹⁴。研究结果显示，基于RT-PCR检测的第53号外显子跳跃率和基于Western印迹法检测的抗肌萎缩蛋白水平均呈剂量依赖性升高，且未观察到严重不良药物反应或受试者脱落情况¹⁴。

在所有临床试验中，结果分析至关重要。对于杜氏肌营养不良症（DMD）的临床试验，关于如何最佳地显示治疗获益仍存在争议。诸如6分钟步行试验等临床检测方法存在一定的局限性。可通过多种方法对肌营养不良蛋白（dystrophin）的表达进行分子表征，例如RT-PCR、qPCR、数字PCR、蛋白质印迹法（western blotting）和免疫组织化学。然而，实现临床获益所需的蛋白表达恢复程度尚不明确。在本方法学文章中，我们详细描述了在AON跳跃药物NS-065/NCNP-01的1期临床试验中，用于分别检测外显子跳跃效率和蛋白水平的RT-PCR和蛋白质印迹法¹⁴。

方案

研究者发起的试验操作规程已获得国立精神·神经医疗研究中心伦理委员会的批准（批准编号：A2013-019）。

1. 肌肉样品的制备

注意：通常选择肱二头肌或股四头肌作为活检部位。但在该临床试验中使用了胫骨前肌。

1. 患者肌肉活检
   1. 在皮肤准备前标记切口位置。
   2. 准备用生理盐水浸湿的纱布用于包裹活检标本，充分挤去多余液体。
   3. 将局部麻醉剂注射至皮肤和皮下组织，但不得注入肌肉内。通过皮肤无痛感确认麻醉深度。
      注意：15岁以下儿科患者通常采用全身麻醉。
   4. 从皮肤切至皮下组织，使用小型拉钩撑开切口并分离皮下脂肪。
      注意：此步骤中可同时切取部分皮肤用于成纤维细胞培养。
   5. 在筋膜上做另一个小切口并进一步剪开筋膜，用蚊式钳夹住筋膜边缘以暴露肌肉。
   6. 用缝线提起所选部位的肌肉，使用虹膜剪创建一个小隧道，并将蚊式钳插入隧道内。
   7. 用镊子分离肌束，并剪断目标部位的两端。
      注意：成人患者的肌肉活检标本应约为铅笔大小（长度1.0–1.5 cm，直径0.8–1.0 cm）；儿科患者的标本应约为长度1 cm、直径5 mm。
   8. 将标本包裹在生理盐水浸湿的纱布中，并立即将新鲜肌肉在室温（RT）下运送至可进行后续处理的实验室。
      注意：若运输时间超过1小时，标本应置于4 °C条件下运输。

2. 肌肉样品制备

1. 将黄蓍胶与水按等体积混合，直至胶体变软且具有黏性。将混合物装入25 mL注射器中。注射器可存放于冰箱中。
2. 在软木圆片上放置约0.5至1 cm厚的黄蓍胶。在圆片的另一侧进行标记。
3. 将异戊烷液体倒入容器中并置于液氮中，直至部分液体冻结。
4. 将样本置于黄蓍胶上。每块肌肉的长轴应与软木片垂直。在每块肌肉底部周围添加黄蓍胶，以帮助正确固定位置。
5. 用镊子将肌肉/软木样本放入步骤2.3中制备的低温异戊烷中进行冷冻。持续移动样本约1分钟，或直至完全冻结，然后暂时放置于干冰上。
6. 将样本放入玻璃小瓶中，并在-80 °C下保存。

3. 肌肉切片

1. 将冷冻切片机设置为 -25 °C 的工作温度以进行切片。
2. 安装软木/肌肉组织块并修切，直至获得平整的切面。
3. 用于 RT-PCR 和蛋白质印迹时，切片厚度设为 10 µm；用于免疫组织化学染色时，切片厚度为 6–8 µm；用于苏木精-伊红染色时，切片厚度为 10–12 µm。将切好的组织片放入 2.0 mL 离心管中，并于 -80 °C 保存，用于后续 RT-PCR 和蛋白质印迹分析。

4. RNA 提取与逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

1. 使用冷冻切片机从冷冻肌肉组织中切取约10片厚度为10 µm的切片。根据试剂盒说明书，使用总RNA纯化试剂盒提取总RNA。
2. 使用分光光度计测定RNA浓度。
3. 按照 表1 在PCR管中加入逆转录PCR反应所需的试剂。引物序列见 表2。
   注意：NS-03患者的上游引物为44F，NS-07患者的上游引物为46F；下游引物默认使用54/55R。若出现非特异性扩增产物，可改用54R作为替代。
4. 将含有反应混合物的PCR管放入热循环仪中，按照 表3 设置程序运行。
5. PCR产物短期保存可置于4 °C，长期保存则应置于-20 °C。

5. 微芯片电泳与外显子跳跃计算

注意：通常选择微芯片电泳（MCE）系统来分析外显子跳跃效率。在本方案中，我们描述了使用厂家A和厂家B生产的MCE系统（以下分别称为系统A和系统B）分析外显子跳跃效率所需的操作步骤。在临床试验期间，外显子跳跃效率的分析是在系统A上进行的。然而，系统A目前已停止销售，我们推荐使用系统B来分析外显子跳跃效率。本文同时提供了两种系统的操作方案（详见第5.1节系统A和第5.2节系统B）。有关系统A和系统B的信息，请参见材料表。此外，该步骤也可通过常规琼脂糖凝胶电泳完成，但其灵敏度显著降低。

1. 使用系统A的微芯片电泳
   注意：系统A有两种类型的芯片。此处，我们介绍DNA芯片的操作步骤。
   1. 将试剂盒试剂（染色缓冲液、上样缓冲液、蛋白分子量标记和凝胶缓冲液）平衡至室温，涡旋混匀后离心。
   2. 为制备凝胶染色缓冲液（GS），将12.5 µL染色缓冲液加入250 µL凝胶缓冲液中，涡旋振荡10秒。将溶液转移至离心滤管中，在2,400 x g 15 分钟后弃去滤膜。
      注意：过滤后的 GS 可在 4 °C 下保存 1 个月。
   3. 若样品浓度过高，用TE缓冲液或无DNase水稀释至约50 ng/µL。
      注意：如果样品的盐浓度 ≥ 200 mM KCl（或 NaCl）和/或 15 mM MgCl₂₂，更换缓冲液。
   4. 向DNA芯片的凝胶引物孔（高亮并标记为GS）中加入12 µL GS溶液，并将芯片放入引物站中。
      注意：为避免产生气泡，加样时应将移液器吸头垂直插入孔的底部。缓慢将液体加至移液器的第一档位，加样结束时不要完全压下第二档以排出残余空气。
   5. 选择 C3 模式并按下 开始 按钮。引物填充完成后，取出芯片。
   6. 目视检查微通道中是否存在截留的气泡或未完全预润湿的情况。
   7. 将制备好的样品和分子量标记物按照下述方法上样至芯片中。
      1. 将9 µL GS溶液移液至其余3个GS孔中。
      2. 将5 µL上样缓冲液加入L孔及每个样品孔（1-11）。
      3. 将1 µL的DNA分子量标准品加入L孔中。
      4. 将1 µL DNA样品移液至每个样品孔中。
      5. 向任何未使用的孔中加入1 µL TE缓冲液或无DNase的水。试剂盒快速指南中展示了芯片布局的示意图。
         注意：将芯片置于浅色背景上方，检查所有孔中是否存在气泡。若孔底部有气泡滞留，可用洁净的移液器吸头轻轻搅动或重新移除并加载溶液以去除气泡。
   8. 将芯片放入涡旋仪中并按压 混合涡旋站将在1分钟后自动停止。
   9. 在上样后5分钟内于电泳仪中运行芯片。
   10. 选择 新运行 软件工具栏中。在 新运行 筛选，选择 DNA 和 DNA 1K 来自 检测 下拉列表
   11. 从运行中选择一个项目文件夹 项目 下拉列表或通过输入名称创建新项目文件夹 项目 领域
   12. 为运行输入一个名称 运行前缀 字段并单击 开始运行.
   13. 分析完成时仪器会发出蜂鸣声，并弹出提示窗口显示运行结束。选择 好的 并将芯片从芯片平台中取出。
   14. 选择 文件 | 导出数据 导出数据。选择所需的选项 导出 对话
   15. 为清洁电极，将800 µL去离子水加入清洗芯片中，将其置于芯片平台上，盖上盖子并保持关闭状态1分钟。1分钟后，打开盖子，取出清洗芯片，让电极干燥1分钟。
2. 使用系统B的微芯片电泳
   1. 打开操作软件并输入样品信息。输入信息后，软件将自动计算分离缓冲液和标记物溶液的用量。
   2. 根据软件计算的结果，配制所需量的分离缓冲液。首先，用适量的TE缓冲液将10,000倍浓缩的核酸染料溶液稀释，制备成100倍浓缩的核酸凝胶染料溶液。100倍浓缩液可保存于-20 °C。
   3. 将适量的100倍浓缩核酸凝胶染料与公司提供的特定管中的分离缓冲液混合，配制1倍工作液。涡旋混匀溶液。
   4. 在试管中配制所需量的标记液。
   5. 启动探针清洗程序。
   6. 完成操作后启动微芯片清洗程序。
   7. 同时将样品移液至PCR多孔板（96孔，透明）中，并用去离子水稀释4倍。仪器可处理的最小体积为6 µL，最大体积为30 µL。建议总体积为10 µL（2.5 µL样品和7.5 µL水/TE缓冲液）。
   8. 用粘性PCR密封膜覆盖反应板，并离心收集样品。
   9. 根据仪器所示位置，将样品板、标记物溶液和1×分离缓冲液放入仪器中。按下 开始 按钮。
   10. 当运行结束后，从软件中将结果数据导出为 .csv 文件，并根据摩尔浓度按如下方法计算外显子跳跃效率：
       外显子跳跃效率（%）=（跳跃条带 /（跳跃条带 + 未跳跃条带）× 100

6. 互补DNA（cDNA）测序

1. 琼脂糖凝胶制备
   1. 称取1.5 g琼脂糖粉末，与100 mL 1x TAE缓冲液混合于可微波加热的烧瓶中（最终制成1.5%琼脂糖凝胶）。
   2. 微波加热1–3分钟，直至琼脂糖完全溶解。
      注意：避免过度煮沸，否则部分缓冲液会蒸发，导致凝胶中琼脂糖终浓度改变。
   3. 将琼脂糖溶液冷却至约50 °C。
   4. 向琼脂糖溶液中加入10 µL 10,000倍稀释的荧光核酸染料。
   5. 将琼脂糖溶液倒入已插入加样孔梳子的凝胶托盘中，在室温下静置20–30分钟，直至完全凝固。
2. 测序
   1. 取5 µL RT-PCR产物（来自步骤4.4）与1 µL 6x上样缓冲液混合，加入1.5%琼脂糖凝胶的加样孔中。
   2. 以135 V电压电泳5分钟，随后以120 V电压电泳20分钟。
   3. 根据制造商说明书，使用凝胶成像系统观察条带。
   4. 从凝胶中切下目标条带，使用凝胶回收与PCR产物纯化试剂盒提取RT-PCR产物。
   5. 使用分光光度计测定浓度。
      注意：若实验室无Sanger测序设备，可将纯化后的条带送至公司或测序中心进行测序。
   6. 按照表4准备循环测序试剂盒所需的试剂，并用移液器加入多孔PCR板中。引物序列见表2。
   7. 用透明粘性封膜密封PCR板。
   8. 涡旋震荡2至3秒，随后在摆动转子离心机中短暂离心（5至10秒），使液体沉降至孔底（1,000 x g）。
      注意：孔中可能存在气泡，但不会对反应产生不利影响。
   9. 将PCR板放入热循环仪，按照表5程序运行。
   10. 根据制造商说明书，使用纯化板对测序反应产物进行纯化。
   11. 按照制造商说明书，使用DNA分析仪测定序列。
   12. 将获得的序列与患者的预期序列进行比对。

7. 蛋白质印迹法

1. 样品制备
   1. 配制SDS样品缓冲液（4% SDS，4 M 尿素，10% 2-巯基乙醇，10% 甘油，70 mM Tris-HCl pH 6.4，0.001% 溴酚蓝，以及蛋白酶抑制剂）。
   2. 将冷冻切片获得的约100片10 µm肌肉组织切片放入150 µL SDS缓冲液中。
   3. 使用手持式微型匀浆器在冰上短暂匀浆蛋白样品30秒。
   4. 在16,500 x g 离心15分钟，将上清液转移至新管中。立即进行分析或于-80 °C保存。
2. 用于蛋白浓度测定的SDS-PAGE
   注意：使用荧光凝胶染色剂测定蛋白浓度。
   1. 根据BCA蛋白检测试剂盒的说明书，测定正常健康对照样品的重量和浓度。
   2. 准备凝胶电泳样品。向健康对照样品中加入10 µg总蛋白，向患者样品中加入5 µL，再分别加入5 µL 4x样品缓冲液和2 µL 10x样品还原剂。混合后，用去离子水补足至每份样品终体积为20 µL。
   3. 在70 °C加热样品10分钟。
   4. 使用50 mL 40x SDS电泳缓冲液加1,950 mL去离子水稀释，配制2,000 mL 1x SDS电泳缓冲液。
      注意：此时使用1,000 mL电泳缓冲液即可。剩余1,000 mL缓冲液用于步骤7.3.1。
   5. 充分混匀后，预留800 mL 1x SDS电泳缓冲液，用于电泳槽的下层（外槽）缓冲室。
   6. 在电泳前立即向200 mL 1x SDS电泳缓冲液中加入500 µL抗氧化缓冲液，用于电泳槽的上层（内槽）缓冲室。
   7. 按照制造商说明书设置3-8% Tris-乙酸盐凝胶，每孔上样20 µL样品。
   8. 以150 V恒压电泳75分钟。
   9. 电泳结束后，将凝胶直接放入盛有50 mL荧光凝胶染色液的洁净托盘中。
   10. 盖上托盘，置于摇床上，轻轻振荡90分钟，避免液体飞溅或损坏凝胶。
   11. 成像前将凝胶转移至水中，在荧光系统中以312 nm激发光、溴化乙锭发射滤光片检测荧光信号。
   12. 根据已知浓度的正常对照裂解液构建的标准曲线，测定患者样品的蛋白浓度。
3. 用于Western印迹的SDS-PAGE
   1. 按照步骤7.2.4–7.2.6准备电泳槽。
   2. 根据步骤7.2.11测得的浓度，每道上样100 µg健康对照裂解液和300 µg患者样品。使用与步骤7.2.7相同的条件进行电泳。
4. 蛋白转膜
   1. 配制转膜缓冲液。将PVDF膜在甲醇中浸泡20秒，随后转移至印迹缓冲液B中备用。
   2. 将超厚印迹滤纸分别在印迹缓冲液A、B和C中各浸泡至少30分钟。
   3. 电泳结束后，将凝胶在印迹缓冲液B中浸泡5分钟。
   4. 按照图1所示示意图，将印迹滤纸、PVDF膜和凝胶放置于半干转仪上。用滚轮轻轻滚压以排除凝胶与膜之间的气泡。
   5. 在室温下以2 mA/cm²的电流密度转膜1小时。
      注意：转膜完成后，建议进行总蛋白染色（如Ponceau染色），以确认高分子量蛋白的成功转膜。
5. 封闭与抗体孵育
   1. 用PBST（1x PBS含0.1% Tween 20）将膜漂洗两次。
   2. 将膜放入1%封闭剂中，在室温下轻轻振荡封闭1小时。
   3. 在封闭液中加入抗dystrophin抗体（1:125）和抗spectrin抗体（1:25,000），室温孵育1小时或4 °C过夜。
   4. 在室温下用PBST洗涤膜三次，每次10分钟。
   5. 在PBST中加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（抗小鼠/兔，1:100），室温孵育40分钟。
   6. 再次在室温下用PBST洗涤膜三次，每次10分钟。
6. 检测
   1. 将检测液A和B按1:1比例混合。所需检测试剂的终体积为0.1 mL/cm²膜面积。
   2. 去除洗涤后膜上多余的PBST，将膜蛋白面朝上置于塑料膜或其他洁净表面上。加入混合后的检测试剂，室温孵育5分钟。
   3. 用镊子轻轻夹住膜，边缘轻触纸巾，去除多余的检测试剂。
   4. 将膜蛋白面朝上置于样品托盘中。按照用户手册操作荧光系统。设置如下：曝光模式：递增，间隔时间：10秒，灵敏度/分辨率：高。
      注意：检测区域以蓝色矩形框标出（图4a-b）：BG：背景；D：dystrophin（427 kDa）；SL：spectrin β长亚型（274 kDa）；SS：短亚型（253 kDa）。dystrophin/spectrin信号比值计算公式为 (D-BG)/[(SL-BG) + (SS-BG)]。正常对照的比值设为100%。

结果

为了使用 RT-PCR 检测外显子跳跃，设计并评估了位于将发生跳跃的外显子两侧的引物，以确保仅扩增出特异性条带（参见图2中外显子跳跃及引物位置的示意图）。这些引物应能产生在 MCE 系统或常规琼脂糖凝胶电泳上可通过大小轻松区分的扩增产物（若无 MCE 系统，可使用琼脂糖凝胶电泳）。图3a展示了在剂量递增的 1 期临床试验中，患者 NS-03 和 NS-07 在使用 NS-065/NCNP-01 治疗前后，RT-PCR 反应的 MCE 系统 A 凝胶图像以及跳跃条带的测序结果。NS-03 和 NS-07 分别携带跨越外显子 45-52 和 48-52 的缺失突变。NS-03 接受每周 5 mg/kg、NS-07 接受每周 20 mg/kg 的 NS-065/NCNP-01 治疗，持续 12 周。如预期，在治疗前，两名患者均未出现外显子跳跃，仅能观察到未跳跃的条带。经过 12 周治疗后，NS-07 出现了清晰的较低分子量跳跃条带，而 NS-03 仍难以检测到任何跳跃产物。测序结果显示，NS-07 的序列包含外显子 47 与 54 的连接，NS-03 则为外显子 44 与 54 的连接。根据序列分析，这些理论上可产生具有功能但长度缩短的抗肌萎缩蛋白异构体。为计算 图3b 中所示的跳跃百分比，将跳跃条带的摩尔浓度除以跳跃与未跳跃条带的总摩尔浓度。NS-07 治疗后的跳跃百分比为 72%，而 NS-03 为 3.4%。来自患者 NS-03、NS-07 及健康对照的 Western blot 数据（三份重复）如 图4a 所示。如预期，治疗前未检测到抗肌萎缩蛋白条带。治疗后，NS-07 检测到一条分子量低于健康对照的条带（野生型抗肌萎缩蛋白的分子量为 427 kDa，NS-07 的抗肌萎缩蛋白分子量为 389 kDa）。由于外显子缺失及跳跃，NS-07 患者的抗肌萎缩蛋白异构体缺失了多个外显子，因此预期其分子量较低。NS-03 治疗后仍未检测到可识别水平的抗肌萎缩蛋白。在 图4b 中，展示了 NS-07 患者抗肌萎缩蛋白水平相对于健康对照的表达量。用于计算抗肌萎缩蛋白恢复水平的信号强度测量位置以蓝色方框标出。采用抗肌萎缩蛋白与肌谱蛋白的比值来计算患者抗肌萎缩蛋白相对于健康对照的表达量。具体而言，将抗肌萎缩蛋白信号减去背景后的值，除以两种肌谱蛋白异构体（长型和短型）信号之和减去背景后的值（见步骤 8.6.5）。健康对照的比值设定为 100%。NS-07 患者治疗后抗肌萎缩蛋白表达量相对于健康对照为 9.1%。然而，由于 NS-03 的抗肌萎缩蛋白条带信号微弱，与两名患者治疗前样本结果相似，因此无法计算其百分比。

图1：Western印迹分析中转印叠层的示意图。 示出了Western印迹转印叠层的组装方式：底部为浸透转印缓冲液A的滤纸，其上依次为浸透转印缓冲液B的滤纸、PVDF膜、3-8% Tris-乙酸盐凝胶，最顶部为两张浸透转印缓冲液C的滤纸。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：DMD基因中外显子45-52缺失患者发生外显子53跳跃的示意图。 例如，在剂量递增的临床试验中，患者NS-03即存在该缺失。若外显子53被保留，则由于外显子44与外显子53之间的连接破坏了阅读框，导致mRNA移码，并在外显子53内产生终止密码子。当外显子53被跳过时，阅读框得以恢复，从而产生一种较短的抗肌萎缩蛋白（dystrophin）异构体。为了通过RT-PCR检测外显子53的跳跃，使用位于外显子44和外显子54的引物，以便于区分跳跃与未跳跃mRNA所产生的PCR产物。FWD：上游引物，REV：下游引物，PMO：磷酸二酰胺吗啉寡聚物。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：来自NS-03和NS-07患者胫骨前肌活检样本的外显子跳跃效率。 a) 由电泳系统A生成的RT-PCR样本凝胶图像，显示NS-03和NS-07患者未处理与处理后样本的结果。上图显示NS-03样本的三复孔结果，下图显示NS-07样本的三复孔结果。NS-03中未跳跃条带为422 bp，跳跃条带为212 bp；NS-07中条带分别为836 bp和624 bp。序列分析显示，NS-03中外显子44与外显子54连接，NS-07中外显子47与外显子54连接。b) 显示NS-03和NS-07患者治疗前后外显子跳跃效率，根据系统A提供的两个条带摩尔浓度计算，公式为：跳跃条带/(跳跃条带 + 未跳跃条带) × 100。NS-03治疗后的跳跃效率极低；NS-07的跳跃效率则超过70%。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：外显子跳跃治疗前后肌营养不良蛋白亚型的蛋白质定量分析。 a) 外显子跳跃治疗前后肌营养不良蛋白亚型的蛋白质定量分析。来自患者 NS-03 和 NS-07 治疗前后以及健康对照者的胫骨前肌肌肉活检样本的蛋白质印迹结果，每组三个重复。健康对照者的肌营养不良蛋白条带位于 427 kDa，NS-07 治疗后的条带位于 389 kDa。两名患者在治疗前均未检测到肌营养不良蛋白，NS-03 患者在治疗后也未能检测到任何蛋白表达。黑色框内区域在 图 4b 中放大显示。每张印迹图左侧显示的是蛋白分子量标记物。 b) 患者 NS-07 治疗后恢复的肌营养不良蛋白量。肌营养不良蛋白的恢复程度根据肌营养不良蛋白条带、背景信号以及血影蛋白长亚型和短亚型条带的强度，按以下公式计算：(dystrophin - background)/(spectrin L - background) + (spectrin S - background)，其中健康对照组的比值设定为 100%。各条带的强度在图中蓝色框内区域进行测量。NS-07 患者治疗后的肌营养不良蛋白恢复水平为 9.1%。未治疗样本中的肌营养不良蛋白信号过弱，无法准确测量。标记物大小以千道尔顿（kDa）表示。Dys：肌营养不良蛋白，BG：背景，SL：血影蛋白长亚型，SS：血影蛋白短亚型，My：肌球蛋白 1 型。标记物大小以千道尔顿（kDa）表示。 请点击此处查看该图的放大版本。

溶液	每反应体积 (μl)	终浓度
无RNase水（提供）	可变	-
5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer	5.0	1x
dNTP混合液（含每种dNTP 10 mM）	1.0	每种dNTP 400 μM
上游引物（10 μM）	1.5	0.6 μM
下游引物（10 μM）	1.5	0.6 μM
QIAGEN OneStep RT-PCR 酶混合液	1.0	-
RNase抑制剂（可选）	可变	每反应5–10单位
模板RNA	50 ng
总计	25

表1：RT-PCR试剂。 一次RT-PCR反应所需的化合物。

引物	序列
44F	5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'
46F	5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3'
48F	5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3'
54/55R	5'-TCTCGCTCACTCACCCTTTT-3'
54R	5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3'

表2：引物列表。 本研究中所用引物的序列。F：正向，R：反向。

1 个循环	反转录	30 分钟	50 °C
1 个循环	初始 PCR 激活步骤	15 分钟	95 °C
35 个循环	变性	1 分钟	94 °C
	退火	1 分钟	60 °C
	延伸	1 分钟	72 °C
1 个循环	最终延伸	7 分钟	72 °C
保持		∞	4 °C

表3：PCR反应条件。 显示RT-PCR反应的PCR条件。

溶液	每反应体积 (μl)
无RNase水	可变
BigDye Terminator 3.1 Ready Reaction Mix	3.5
正向引物/反向引物 (3.2 μM)	2.0
模板RNA	20 ng
总计	20

表4：测序反应所需的试剂。 在反应体系中使用正向或反向引物之一，不要同时使用两者。

1 个循环	1 分钟	96 °C
25 个循环	10 秒	96 °C
	5 秒	50 °C
	4 分钟	60 °C
保持	∞	4 °C

表5：Sanger测序的PCR条件。

讨论

近年来，杜氏肌营养不良症（DMD）的临床试验取得了成功，也经历了失败。RT-PCR 和蛋白质印迹法（western blotting）均为评估给予患者外显子跳跃化合物后所产生的跳跃效率的常用技术。然而，据报告，与数字PCR相比，RT-PCR会高估跳跃效率¹⁵。尽管这一现象由多种因素导致，但主要原因是PCR扩增过程中较小的跳跃片段扩增效率更高。本临床试验中使用的RT-PCR似乎也产生了比蛋白质印迹法估计的蛋白表达水平更高的跳跃效率。根据美国食品药品监督管理局（FDA）的观点，后者是量化抗肌萎缩蛋白（dystrophin）恢复更为可靠的方法¹²。因此，在解读RT-PCR的跳跃效率结果时应保持谨慎；但样本之间仍可进行比较。通常情况下，基于RT-PCR结果显示出较高跳跃效率的样本，在蛋白质印迹分析中也表现出较高的蛋白表达水平。

由于杜氏肌营养不良症（DMD）临床试验中的所有患者缺失模式并不相同，因此设计出能够对所有样本进行数字PCR或qPCR检测且具有足够特异性的引物和探针具有挑战性。因此，RT-PCR仍是评估外显子跳跃效率的较好初步方法。在NS-065/NCNP-01临床试验启动之前，体外评估每位患者的跳跃效率十分繁琐，因为必须通过肌肉或皮肤活检获取患者特异性的成肌细胞。然而，我们近期发表了一种新型技术，可通过MYOD1转化尿液来源的细胞（UDCs）建立患者特异性的DMD肌肉细胞模型¹⁶。因此，仅需采集患者的尿液即可生成成肌细胞，无需任何侵入性操作。我们认为该方法可用于在患者特异性细胞中筛选不同的反义寡核苷酸（AONs）。此外，可在患者参与任何临床试验前测试不同的引物和探针组合。这有望在未来促进qPCR或数字PCR在DMD临床试验中外显子跳跃效率检测中的应用。

在本临床试验中进行蛋白质印迹分析时，仅使用了一种抗肌营养不良蛋白的单克隆抗体，并且仅采用一个健康对照样本作为参考。因此，该抗体的特异性未得到充分验证。这一点，加上该抗体仅能识别肌营养不良蛋白的C末端结构域，构成了本实验方案的局限性。未来建议使用更多健康对照样本，以及针对肌营养不良蛋白不同结构域的多种抗体。

本文总结了近期一项探索性研究者发起的、针对NS-065/NCNP-01的首次人体临床试验中所采用的实验方案。NS-065/NCNP-01可能适用于10.1%的杜氏肌营养不良症（DMD）患者。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 bp DNA Ladder	Takara	3407A	MultiNA 用标记物溶液
1mol/l-Tris-HCl 缓冲液 (pH 7.6)	Nacalai	35436-01
2-巯基乙醇	Nacalai	21418-42
2-甲基丁烷（异戊烷）	Sigma-Aldrich	15-2220
5 mL 圆底聚苯乙烯试管	Falcon	352235
6× 上样缓冲液	Takara	9156
Agarose ME	Iwai chemical	50013R
Applied Biosystems 3730 DNA 分析仪	Applied Biosystems	A41046
BD Matrigel 基质	BD Biosciences	356234
BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒	Applied Biosystems	4337455
牛血清白蛋白溶液	Sigma-Aldrich	A8412
溴酚蓝	Nacalai	05808-61
Centri-Sep 96 孔板	Applied Biosystems	4367819
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	4693116001
DMEM/F-12	Gibco	11320033
ECL Prime 封闭试剂	GE healthcare	RPN418
ECL Prime 西部印迹检测试剂	GE healthcare	RPN2232
Endo-Porter	GeneTools	2922498000
Experion 自动电泳工作站	Bio-Rad	7007010	微芯片电泳系统 A
Experion DNA 1K 分析试剂盒（适用于 10 个芯片）	Bio-Rad	7007107JA
Experion 加样工作站	Bio-Rad	7007030
Experion 涡旋工作站 II	Bio-Rad	7007043
超厚印迹滤纸	Bio-Rad	1703965
EzBlot	Atto	AE-1460
GelRed 核酸凝胶染料	Biotium	41003
玻璃小瓶	Iwaki	1880 SV20
甘油	Nacalai	17045-65
Histofine Simple Stain MAX PO	Nichirei	424151
马血清	Gibco	16050122
Immobilon-P 转印膜	Millipore	IPVH304F0
ITS 液体培养基添加剂	Sigma-Aldrich	I3146
甲醇	Sigma-Aldrich	34860
MicroAmp 透明粘性封膜	Applied Biosystems	4306311
MultiNA	SHIMADZU	MCE-202	微芯片电泳系统 B
Multiplate 96 孔 PCR 板	Bio-Rad	mlp9601
NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计（带 Wi-Fi）	Thermo Scientific	ND-ONE-W
NovocastraTM 冻干小鼠单克隆抗体 Dystrophin（C 末端）	Leica biosystems	NCL-DYS2
NovocastraTM 冻干小鼠单克隆抗体 Spectrin	Leica biosystems	NCL-SPEC1
NuPAGE 3-8% Tris-乙酸蛋白凝胶	Invitrogen	EA03785BOX
NuPAGE 抗氧化剂	Invitrogen	NP0005
NuPAGE LDS 上样缓冲液	Invitrogen	NP0007
NuPAGE 样品还原剂	Invitrogen	NP0009
NuPAGE Tris-乙酸 SDS 电泳缓冲液	Invitrogen	LA0041
Oriole 荧光凝胶染料	Bio-Rad	1610496
PBS	Gibco	10010023
青霉素-链霉素稳定溶液	Sigma-Aldrich	P4458
Physcotron 便携式微型匀浆器	MICROTEC	NS-310E3
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	23227
Polybrene 感染/转染试剂	Sigma-Aldrich	TR-1003
碘化丙啶染色液	BD Pharmingen	556463
QIAGEN OneStep RT-PCR 试剂盒	Qiagen	210212
RNeasy 纤维组织小型试剂盒	Qiagen	74704
SDS	Nacalai	31606-75
半干转印仪	Bio Craft	41-1293
SYBR Gold 核酸凝胶染料	Invitrogen	S11494	用于 MultiNA
TAE 缓冲液	Nacalai	35430-61
刺梧桐胶	Wako	200-02245
Tris-EDTA 缓冲液	Nippon Gene	316-90025	用于 MultiNA
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
尿素	Nacalai	35907-15
Wizard SV 凝胶与 PCR 产物纯化系统	Promega	A9281
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001