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方法文章

离体加压海马毛细血管-实质小动脉制备用于功能研究

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DOI：

10.3791/60676

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2019年12月18日

 ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Neurological Sciences, University of Vermont Larner College of Medicine, 3Department of Pharmacology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

本文内容

摘要

本文详细介绍了如何从小鼠脑组织中分离海马动脉小动脉和毛细血管，以及如何对其进行加压，以用于压力肌图、免疫荧光、生物化学和分子生物学研究。

摘要

从轻微的行为改变到晚期痴呆，血管性认知障碍通常在脑缺血后发生。中风和心脏骤停是具有显著性别差异的疾病，二者均可引发脑缺血。然而，由于在功能研究中难以检测小鼠模型的脑微循环，目前对血管性认知障碍的理解以及针对性别特异性治疗的开发进展受到一定限制。本文介绍了一种用于研究小鼠脑组织海马区毛细血管-实质小动脉（HiCaPA）离体（ex vivo）制备中毛细血管至小动脉信号传导的方法。我们描述了如何分离、套管插管并加压微循环系统，以测量小动脉在毛细血管刺激下的直径变化。我们展示了可用于验证HiCaPA制备完整性的适当功能对照，并呈现典型实验结果，包括验证钾离子作为神经血管耦合介质的作用，以及近期鉴定的Kir2内向整流钾通道家族抑制剂ML133的效果。此外，我们比较了来自雄性和雌性小鼠制备样本的反应差异。尽管这些数据反映的是功能学研究结果，但本方法也可应用于分子生物学、免疫组织化学和电生理学研究。

引言

大脑表面的软脑膜循环一直是大量研究的对象，部分原因是其易于进行实验操作。然而，脑血管系统的拓扑结构形成了不同的区域。与具有丰富吻合支、可有效重定向血流的强健软脑膜网络相比，脑实质内穿支小动脉（PAs）的侧支供血极为有限，每条小动脉仅灌注特定体积的神经组织1,2。这导致血流出现瓶颈效应，再结合其独特的生理特征3,4,5,6,7,8，使得脑实质内小动脉成为脑血流（CBF）调节的关键部位9,10。尽管分离和插管PAs存在固有的技术挑战，但在过去十年中，利用加压血管进行离体（ex vivo）功能研究的兴趣显著增加11,12,13,14,15,16,17。其中一个重要原因是学界在神经血管耦合（NVC）机制方面开展了大量研究，该机制维持了脑功能活动引发的局部高灌注状态18。

局部神经激活后，局部脑血流量可迅速增加19细胞机制和信号特性对神经血管耦合（NVC）的调控尚不完全清楚。然而，我们发现脑毛细血管在NVC过程中具有此前未被预期的功能，即感知神经活动并将其转化为去极化电信号，从而引起上游微动脉的舒张。20,21,22动作电位23,24 以及大电导Ca通道的开放2+激活的K+ 星形胶质细胞终足上的（BK）通道25,26 增加间质钾离子浓度 [K+]o，从而激活强内向整流K+ 毛细血管内皮中的（Kir）通道。该通道由外部K⁺激活+ 但也可由超极化本身引起。这种超极化电流通过缝隙连接在毛细血管内皮细胞间传播，并在邻近细胞中再生，直至小动脉，在此处引起肌细胞松弛和脑血流量（CBF）增加20,21研究这一机制促使我们开发了一种加压的毛细血管-实质小动脉（CaPA）制备方法，用于在毛细血管受到血管活性物质刺激时测量小动脉的直径。CaPA制备物包含一段带完整下游毛细血管分支的套管插入脑内小动脉节段。毛细血管末端通过微移液管压紧在灌流腔的玻璃底部，从而闭塞并稳定整个血管结构。20,21.

我们先前通过成像小鼠皮层的CaPA制备物20,21以及大鼠杏仁核13和海马16,17的小动脉，实现了技术上的创新。由于海马血管系统因其对病理状态的易感性而受到越来越多的关注，本文提供了一种从小鼠海马制备CaPA（HiCaPA）的逐步操作方法，该方法不仅可用于功能性神经血管耦合（NVC）研究，还可应用于分子生物学、免疫组织化学和电生理学研究。

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方案

所有实验均经科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并依照美国国立卫生研究院的指南进行。

1. 溶液

  1. 使用MOPS缓冲盐溶液进行解剖，并在使用前将样品置于4 °C保存。切勿对溶液通气。配制如下成分的MOPS缓冲盐溶液：135 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM KH2PO4，1 mM MgSO₄4，2.5 mM CaCl2，5 mM 葡萄糖，3 mM MOPS，0.02 mM EDTA，2 mM 丙酮酸，10 mg/mL 牛血清白蛋白，pH 7.3（4 °C 条件下）。
  2. 使用人工脑脊液（aCSF）作为灌流液和移液管填充液。对 aCSF 和 Ca2+含5% CO的无钙人工脑脊液2，20% O₂2，以及 N2 平衡。配制如下成分的溶液：125 mM NaCl，3 mM KCl，26 mM NaHCO₃3，1.25 mM NaH2PO4，1 mM MgCl2，4 mM 葡萄糖，2 mM CaCl2，pH 7.3（用5% CO₂供气）2，20% O₂2，以及 N2 平衡）
  3. 获得名义上无钙条件下的最大舒张2+无钙 aCSF（0 mM [Ca2+]o，5 mM EGTA）

2. 器官腔室制备

  1. 将硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 = 1.2 mm；内径 = 0.69 mm；长度 = 10 cm）插入玻璃微电极拉制仪中，拉制毛细管，使其一端形成细长的尖端。
  2. 在灌流腔室的一侧安装一根可连接微型蠕动泵的套管，用于对管腔施加压力。在解剖显微镜下，将套管尖端折断，使其直径足够小以插入目标血管，但又足够大以允许溶液流过。确保尖端直径约为 10–15 µm。
  3. 使用带有 0.22 µm 滤器的注射器将充氧人工脑脊液（aCSF）注入套管中，确保套管内无气泡或碎屑。
  4. 在腔室的另一侧再添加两根套管，其尖端无需折断。

3. 海马体解剖与分离

  1. 处死并断头一只小鼠。本实验使用8周龄的C57BL6/J小鼠，以比较雄性和雌性之间的差异。向小鼠注射戊巴比妥钠后，用手术剪进行断头。
  2. 使用小型解剖剪沿头部顶端正中线剪开皮肤，并将皮肤向两侧拨开。
  3. 从颅骨尾侧开始，沿正中线剪开颅骨，直至暴露嗅球。逐步移除颅骨部分，使大脑半球完全暴露。
  4. 从靠近小鼠鼻部的位置开始缓慢取出脑组织。使用小型解剖剪切断嗅球、脑神经和脊髓等连接结构，将脑组织分离出来。
  5. 将脑组织置于解剖培养皿中，加入足量MOPS溶液使其完全浸没。在解剖显微镜下，将脑组织置于培养皿中央，腹面朝下。
  6. 使用剃刀刀片沿大脑纵裂将脑组织切成两半。持刀时使刀刃与解剖培养皿底部平行，一次性垂直下压切过脑组织。将其中一个半球移至培养皿一侧。
  7. 对每个半球分别或同时进行以下操作：
    1. 将一个脑半球置于培养皿中央，使切面（正中面）朝下。使用剃刀刀片沿横裂切割，去除小脑和脑干。将刀片垂直穿过组织完成切割。
    2. 旋转脑半球，使内侧面朝上（图1A）。用一把刮勺固定脑组织，另一把刮勺的尖端插入胼胝体下方，从下方铲起，以去除覆盖海马体的丘脑、隔区和下丘脑（图1B）。
    3. 确认海马体现已可见，呈弯曲状结构，位于大脑半球后部附近。用一把刮勺固定大脑半球，另一把刮勺将其从大脑半球中完整铲出（图1C）。
  8. 将分离出的海马体转移至另一个装有约半满MOPS溶液的新解剖培养皿中。其余脑组织弃去。

4. 海马动脉小段的分离

  1. 对每个海马体完成以下步骤。
    1. 用小镊子在海马体切片的两端固定，使其固定在底部，海马动脉朝上。
    2. 使用非常锋利的镊子，轻轻拉伸海马体的小段区域。这将松解小动脉周围组织，便于后续分离。
    3. 在背侧海马组织中寻找，以识别外侧横动脉（图1C）16,27。
    4. 轻轻夹住外侧横动脉，缓慢将其从组织中拉出，以收集供应海马CA3区的小动脉和毛细血管。
    5. 当组织中不再有可分离的血管时，弃去海马体组织。未使用时，将分离出的血管置于冰上的培养皿中保存。

5. 海马毛细血管-实质小动脉插管

  1. 找到一条具有以毛细血管终止的分支的小动脉。将其转移至器官浴槽中。确保该小动脉在完全舒张时直径约为 15–30 µm（图 1D）。
  2. 通过将套管尖端穿过目标区域下方的小动脉壁，小心地将血管固定在套管上。轻柔地将血管沿套管滑动，直至留出足够的组织用于结扎。
  3. 使用 12-0 尼龙缝线打一个松结，使其能够套住血管和套管。采用半结固定缝线，然后拉紧线头以收紧结扎，将小动脉牢固固定在套管上。用镊子轻轻牵拉结扎下方多余的血管分支，并将其去除。
  4. 在小动脉的另一端打另一个结扎并固定，以封闭该端。
  5. 将带有血管的套管缓缓下降，使其紧贴浴槽底部的盖玻片。注意不要过度下压套管，以免将其折断。
  6. 使用位于浴槽对侧的另一个套管，将其下降，使尖端压住小动脉末端的结扎线。
  7. 使用第三个套管将毛细血管分支固定在盖玻片上。将套管尖端置于分支末端附近，同时确保毛细血管的末端暴露在外（不被套管压住）。

6. 压力血管造影术

  1. 将灌流室从解剖显微镜转移到配备记录软件的显微镜下。
  2. 将进液和出液管路连接至灌流室，开始灌流预热的 aCSF 溶液（37 °C），流速为 4 mL/min。
  3. 将加压套管连接至配备压力传感器的蠕动泵，并将管腔内压力调节至 20 mm Hg。
  4. 启动记录软件，调整显微镜和成像参数以获得最清晰的图像。当参数优化至适合检测软件使用时，开始记录。
  5. 在记录过程中，使用边缘检测软件监测动脉直径的同时，逐步将血管压力升高至 40 mm Hg。
  6. 用 aCSF 灌流约 15–20 分钟，以充分洗脱灌流室中的 MOPS 溶液，并使 HiCaPA 标本达到平衡状态并形成肌源性张力。
  7. 为检测血管活性，向灌流液中加入 1 µM NS309 溶液（参见 图 2A,B 及“代表性结果”部分）。微动脉节段应出现舒张反应，表明其具有约 30–40% 的肌源性张力，如先前研究所述3,14,20。

7. 毛细血管末端的局灶性刺激

  1. 在确定微动脉的基础张力并评估内皮功能后，测试毛细血管刺激的反应。
  2. 使用玻璃拉针仪制备导管，使其一端具有精细尖端。折断导管的尖端，使待测药物可在5 psi压力下顺畅地从尖端流出。
  3. 用感兴趣的药物溶液填充导管，并将其安装到显微镜附带的三轴显微操作器上。将压力喷射系统的管路连接至导管。
  4. 缓慢将导管下降至靠近毛细血管的灌流槽中，注意避免触碰血管或腔室中的任何硬件部件。将导管尖端移动至毛细血管末端附近，但不得接触。保持导管尖端略微离开盖玻片，以防导管泄漏时刺激血管。
  5. 准备刺激毛细血管时，将导管下放至盖玻片表面并紧邻毛细血管。启动压力喷射系统，设定所需的喷射时间（此处为20秒）。刺激结束后，轻微上提导管，避免持续刺激。
  6. 根据需要重复刺激操作。更换压力喷射系统中的导管以测试不同的药物化合物。
  7. 为确认仅毛细血管受到刺激，使用1 µM NS309溶液填充导管，并重复上述步骤。
    注意：毛细血管内皮细胞不表达由NS309激活的K+通道，因此微动脉不应对刺激产生反应。若微动脉出现舒张，则需重新调整导管位置或减小孔径（参见图2A,B及代表性结果部分）。

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结果

内皮细胞的小电导（SK）和中等电导（IK）Ca2+敏感性K+通道对肺动脉（PA）的管径具有舒张作用。灌流应用1 µM NS309（一种合成的IK和SK通道激动剂）可引起接近最大幅度的舒张（图2A,B）。然而，毛细血管内皮细胞缺乏IK和SK通道，对NS309无超极化反应20。因此，通过局部压力喷射（20 s，5 psi）将1 µM NS309施加于毛细血管末端时，并未引起上游微动脉的舒张（图2A,B）。该结果表明，在HiCaPA制备中NS309并未扩散至微动脉，因此可将此作为对照，用于评估通过压力喷射将化合物施加于毛细血管时的空间局限性。

该制备方法最初旨在测量从毛细血管向小动脉...

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讨论

本文所述的加压HiCaPA（海马区毛细血管-实质小动脉，hippocampal capillary-parenchymal arteriole）制备方法，是我们已建立的分离、加压并研究实质小动脉方法的进一步拓展29。我们近期报道了脑毛细血管内皮细胞中的Kir2.1通道可感知神经激活相关的细胞外[K+]o升高，并产生向上传导的超极化信号，从而引起上游小动脉舒张20。揭示毛细血管这一此前未被预料的功能，部分得益于从大脑皮层微循环发展而来的CaPA制备技术20,21。本论文介绍了一种类似实验方法，但取自小鼠大脑更深且更为局限的结构，旨在描述一种简单且可重复的研究神经血管耦合过程中毛细血管至小动脉信号传导的方法。

脑微循环极为脆弱，必须采用特定操作方法，尤其是尽量减少对血管的牵拉和机械接触，以确保微动脉和毛细血管的存活。自发性肌源性张力...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Jules Morin 对本文手稿提出的深刻见解。本研究由非营利组织 CADASIL Together We Have Hope、女性健康与研究中心以及 NHLBI R01HL136636（FD）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22µm 注射器滤器CELLTREAT Scientific Products229751
12-0 尼龙（12 cm）黑色Microsurgery Instruments, IncS12-0 NYLON
自动温度控制器Warner InstrumentsTC-324B
硼硅酸盐玻璃外径：1.2 mm，内径：0.68 mmSutter InstrumentsB120-69-10
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7030
CaCl2 二水合物Sigma-AldrichC3881
D-(+)-葡萄糖Sigma-AldrichG5767
解剖显微镜OlympusSZ11
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — 配驱动装置和 MS/CA 4-12 泵头的完整泵系统IsmatecISM 1090
EGTASigma-AldrichE4378
精细剪刀 - 锐头Fine Science Tools14063-09
在线水加热器Warner InstrumentsSH-27B
Integra™ Miltex™ 组织镊Fisher Scientific12-460-117
KClSigma-AldrichP9333
KH2PO4Sigma-AldrichP5379
七水合硫酸镁Sigma-AldrichM1880
无水 MgClSigma-AldrichM8266
显微操作器NarishigeMN-153
ML 133 盐酸盐Tocris4549
MOPSSigma-AldrichM1254
NaClSigma-AldrichS9625
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS8875
NS309Tocris3895
Picospritzer III - 胞内微量注射分配系统，双通道Parker Hannifin052-0500-900
带蠕动泵的压强伺服控制器Living Systems InstrumentationPS-200
丙酮酸钠Sigma-AldrichP3662
超精细镊子Fine Science Tools11252-20
手术剪 - 锐头钝头Fine Science Tools14001-13
垂直微电极拉制仪NarishigePP-83

参考文献

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