小鼠胰岛的腹股沟皮下白色脂肪组织（ISWAT）移植模型

摘要

本方案描述了一种小鼠胰岛分离及将其移植至腹股沟皮下白色脂肪组织的方法。将分离的同系小鼠胰岛利用基底膜水凝胶移植到小鼠受体体内。监测受体的血糖水平，并对胰岛移植物进行组织学分析。

摘要

胰岛移植是治疗1型糖尿病的一种成熟疗法。在啮齿类动物模型中，肾包膜是最常用的胰岛移植部位。然而，紧密的肾包膜限制了在大型动物和人体中移植足够数量胰岛的能力。腹股沟皮下白色脂肪组织（ISWAT）是一种新型皮下空间，被发现是胰岛移植的潜在理想部位。该部位比其他皮下区域具有更丰富的血液供应。此外，ISWAT可容纳比肾包膜更大的胰岛质量，且移植操作简便。本文描述了在同基因型糖尿病小鼠受体中进行小鼠胰岛分离及ISWAT部位移植的操作流程。根据本方案，采用标准的胶原酶消化法分离小鼠胰岛，并使用基底膜基质水凝胶将纯化的胰岛固定于ISWAT部位。对受体小鼠的血糖水平监测超过100天。移植后第100天取出胰岛移植物进行组织学分析。本文所述的ISWAT部位胰岛移植方案简便且有效。

引言

根据国际糖尿病联合会（IDF）的统计数据，全球1型糖尿病（T1DM）的发病率和患病率正在迅速上升¹。胰岛移植是治疗T1DM最有前景的方法之一⁴。自采用埃德蒙顿方案在临床胰岛移植方面取得重大突破以来²，目前T1DM受者在移植后5年仍保持功能的胰岛移植物存活率已达到约50%³。

过去，研究人员已探索了多种用于实验性胰岛移植的移植部位，包括肝脏、肾包膜、脾脏、肌肉内区域、皮下空间、骨髓以及大网膜囊^5,6,7。上述部分部位已在临床环境中进行过测试⁸。尽管目前将胰岛移植至肝脏仍是临床应用中最广泛使用的方法⁹，但该部位仍存在若干亟待解决的重要问题。例如，如何减少移植胰岛因即时血液介导的炎症反应（IBMIR）和供氧不足所导致的早期丢失^10,11，以及在必要时如何回收胰岛移植物，因为它们在肝脏中呈弥散性分布。....

方案

本方案中的所有操作均遵循深圳市第二人民医院伦理审查委员会的动物福利原则。胰岛移植受体和供体为8至10周龄的雄性C57BL/6小鼠，购自广东省医学动物中心。收获、分离、培养或接种收获细胞的操作均在无菌条件下进行。

1. 胰岛制备

1. 配制V型胶原酶工作液。称取V型胶原酶，用D-Hank's缓冲液溶解至终浓度为1 mg/mL，使用0.22 μm针筒式滤器和60 mL针筒过滤，冰上预冷。每位供体受者需要5 mL。
2. 通过颈椎脱位法处死一只10周龄雄性C57BL/6小鼠（23 ± 2 g），并用75%乙醇喷洒小鼠体表数秒。同时，用5 mL注射器吸取胶原酶溶液，并将注射器针头更换为弯头钝端灌注针头（32 G）。
3. 将供体小鼠仰卧置于解剖显微镜下的冰袋上，使用直头眼科剪在耻骨区域皮肤做一横向切口，并向头部方向完全切开皮肤。随后，从耻骨区至剑突行V形切口，完全打开腹腔。
4. 将肝脏重新定位，暴露胆囊及胆总管全长。随后用血管夹夹闭胆总管的十二指肠开口，并在胆囊上切开一个小口。
   注意：最佳的针头放置位置对于防止液体反流至肝脏和胆囊至关重要。
5. 从胆囊开口处使用1.2步骤中的灌注针插管胆总管，然后向胰腺注入约2 mL胶原酶溶液。随后，使用两把无创显微镊子将灌注后的胰腺与肠道、胃和脾脏分离，并将其放入预冷的50 mL锥形管中置于冰上。
   注意：对所有供体小鼠重复此过程。可将三只连续灌....

结果

本方案介绍了两种操作：小鼠胰岛的制备以及将胰岛移植至ISWAT位点。在第一种操作中，通过V型胶原酶溶液灌注和消化后，使用Histopaque-1119和Histopaque-1077进行纯化，并辅以手工挑选步骤，所分离的小鼠胰岛纯度足以用于移植（如图1所示），且具有高活力的分离胰岛将被用于移植（如图2所示）。在第二种操作中，使用STZ化学试剂诱导糖尿病至关重要。STZ的最佳剂量取决于小鼠品系和年龄，糖尿病成功诱导的标准为连续两天在同一时间测得的非空腹血糖水平均超过16.7 mmol/L。糖尿病小鼠在未接受胰岛移植的情况下可存活数周。胰岛移植物在移植至ISWAT位点前应与水凝胶充分混合，移植后需等待数分钟以使移植物在IWSAT中固定（图3）。当移植至ISWAT位点后，胰岛移植物可在约一个月内逆转高血糖状态，受体小鼠的体重也逐渐增加（图4）。移植后第100天，取出胰岛移植物进行组织学分析（

讨论

胰岛移植是一种治疗1型糖尿病（T1DM）的有前景的疗法。该疗法的效果受多种因素影响，选择最佳的胰岛植入部位至关重要。理想的胰岛移植解剖部位应具备以下特征：便于进行简单的移植、活检和移植物取出操作；并发症较少；血糖控制成功率高；以及胰岛移植物的长期存活^15,16。

我们团队此前描述了一种在小鼠模型中将胰岛移植至大网膜的实验方案¹⁷。与肾包膜下胰岛移植相比，大网膜移植后达到正常血糖水平所需时间较晚。因此，研究人员探索了其他可用于胰岛植入的部位。

已有研究报道，与肝脏移植相比，胰岛移植至腹股沟白色脂肪组织（ISWAT）所需胰岛数量更少即可逆转受体的高血糖状态，因此ISWAT可作为肝脏以外的替代移植位点¹⁴。此外，ISWAT位点易于进行胰岛移植操作，也便于移植物的观察和回收¹⁴.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm 注射器驱动滤器单元	Merck Millipore	SLHV033RB
1.5 mL 离心管	Axygen	MCT-150-C
5 mL 帕斯特移液管	JingAn Biological, 中国	J00085
5 mL 注射器	Szboon, 中国	20170829
50 mL 锥形管	Corning	430829
5-0 外科缝合线	sh-Jinhuan, 中国	CR537
60 mL 注射器	Szboon, 中国	20170623
75% 乙醇	LIRCON, 中国	9180527
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG(H+L)	Invitrogen	A21202	稀释比例 (1:200)
抗小鼠胰高血糖素抗体	Abcam	ab10988	稀释比例 (1:100)
抗小鼠胰岛素抗体	Cell Signaling Technology	3014s	稀释比例 (1:100)
钝头灌注针	Oloey, 中国	005	32G，黄色
BSA	Meilune, 中国	MB4219
C57BL/6 小鼠	广东省医学实验动物中心		8~10 周龄
细胞培养皿	BIOFIL, 中国	TCD000100	普通，未处理，直径 87.8 mm
离心机	Thermo Scientific	ST16R
头孢菌素	Lukang medical, 中国	150303
CMRL-1066	Sigma-Aldrich	C0422
Codos 宠物电推剪	Szcodos, 中国	CP-8000
V 型胶原酶	Sigma	C9262
DAPI	Thermo Fisher	D1306
D-Hank's 缓冲液	Coolaber, 中国	PM5140-10
二苯硫腙	Sigma-Aldrich	D5130
Dnase I	Sigma-Aldrich	D4263
伊红染色液	Beyotime Biotech, 中国	C0109
FBS	GE Healthcare Life Sciences	SH30084
荧光素二乙酸酯 (FDA)	Thermo Fisher	F1303
荧光显微镜	Leica	DMIL
加样枪头	Corning	CLS4884
HBSS	Coolaber, 中国	PM5150-10
苏木精染色液	Cell Signaling Technology	14166S
HISTOPAQUE-1077	Sigma-Aldrich	RNBG0522
HISTOPAQUE-1119	Sigma-Aldrich	RNBG0536
水凝胶	BD Biosciences	356234	基底膜基质
碘伏	LIRCON, 中国	5190313
避光培养皿	DVS, 中国	AN-5058548	自制，玻璃皿喷涂黑色油漆
医用胶带	Cofoe, 中国	K12001
非侵入性微型镊子	RWD Life Science	F11033-11 和 F12016-15
One Touch ultraeasy Basic 血糖监测系统	Johnson & Johnson	33391713
眼科剪刀	RWD Life Science	S12012-12 和 S11001-08
P/S (青霉素/链霉素)	Gibco	15140-122
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich	P-010
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	P4864
STZ (链脲佐菌素)	Sigma-Aldrich	S0130
试纸条	GenUltimate	100-50
TRITC 标记的山羊抗兔 IgG(H+L)	proteintech	SA00007-2	稀释比例 (1:200)
血管夹	RWD Life Science	R31006-04