本方案描述了一种小鼠胰岛分离及将其移植至腹股沟皮下白色脂肪组织的方法。将分离的同系小鼠胰岛利用基底膜水凝胶移植到小鼠受体体内。监测受体的血糖水平，并对胰岛移植物进行组织学分析。
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方法文章
小鼠胰岛的腹股沟皮下白色脂肪组织（ISWAT）移植模型
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
胰岛移植是治疗1型糖尿病的一种成熟疗法。在啮齿类动物模型中，肾包膜是最常用的胰岛移植部位。然而，紧密的肾包膜限制了在大型动物和人体中移植足够数量胰岛的能力。腹股沟皮下白色脂肪组织（ISWAT）是一种新型皮下空间，被发现是胰岛移植的潜在理想部位。该部位比其他皮下区域具有更丰富的血液供应。此外，ISWAT可容纳比肾包膜更大的胰岛质量，且移植操作简便。本文描述了在同基因型糖尿病小鼠受体中进行小鼠胰岛分离及ISWAT部位移植的操作流程。根据本方案，采用标准的胶原酶消化法分离小鼠胰岛，并使用基底膜基质水凝胶将纯化的胰岛固定于ISWAT部位。对受体小鼠的血糖水平监测超过100天。移植后第100天取出胰岛移植物进行组织学分析。本文所述的ISWAT部位胰岛移植方案简便且有效。
引言
根据国际糖尿病联合会（IDF）的统计数据，全球1型糖尿病（T1DM）的发病率和患病率正在迅速上升1。胰岛移植是治疗T1DM最有前景的方法之一4。自采用埃德蒙顿方案在临床胰岛移植方面取得重大突破以来2，目前T1DM受者在移植后5年仍保持功能的胰岛移植物存活率已达到约50%3。
过去，研究人员已探索了多种用于实验性胰岛移植的移植部位，包括肝脏、肾包膜、脾脏、肌肉内区域、皮下空间、骨髓以及大网膜囊5,6,7。上述部分部位已在临床环境中进行过测试8。尽管目前将胰岛移植至肝脏仍是临床应用中最广泛使用的方法9，但该部位仍存在若干亟待解决的重要问题。例如，如何减少移植胰岛因即时血液介导的炎症反应（IBMIR）和供氧不足所导致的早期丢失10,11，以及在必要时如何回收胰岛移植物，因为它们在肝脏中呈弥散性分布。肾包膜可能是啮齿类受体的理想移植部位，但人类肾包膜空间有限，限制了足量同种异体胰岛的移植；尽管如此，由于临床上使用的猪胰岛制备物纯度较高，该部位可能更适用于胰岛异种移植5,12。因此，寻找更合适的胰岛移植部位仍在持续研究中。
由于皮下空间易于获取，可作为胰岛移植的临床适用部位。然而，将胰岛移植至皮下空间的效率极低，因此需要相对大量的胰岛才能逆转高血糖13。最近，一个日本研究团队在小鼠模型中发现ISWAT是一种优于肝脏的新型皮下移植部位14。ISWAT含有腹壁上动脉和静脉，丰富的血液供应可能有助于胰岛移植物的血管重建。在本文中，我们提出一种简便的植入方法，利用基底膜基质水凝胶将同基因型小鼠胰岛固定于ISWAT中。该方案已被证实对胰岛移植有效。
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方案
本方案中的所有操作均遵循深圳市第二人民医院伦理审查委员会的动物福利原则。胰岛移植受体和供体为8至10周龄的雄性C57BL/6小鼠，购自广东省医学动物中心。收获、分离、培养或接种收获细胞的操作均在无菌条件下进行。
1. 胰岛制备
- 配制V型胶原酶工作液。称取V型胶原酶，用D-Hank's缓冲液溶解至终浓度为1 mg/mL，使用0.22 μm针筒式滤器和60 mL针筒过滤，冰上预冷。每位供体受者需要5 mL。
- 通过颈椎脱位法处死一只10周龄雄性C57BL/6小鼠（23 ± 2 g），并用75%乙醇喷洒小鼠体表数秒。同时，用5 mL注射器吸取胶原酶溶液，并将注射器针头更换为弯头钝端灌注针头（32 G）。
- 将供体小鼠仰卧置于解剖显微镜下的冰袋上，使用直头眼科剪在耻骨区域皮肤做一横向切口，并向头部方向完全切开皮肤。随后，从耻骨区至剑突行V形切口，完全打开腹腔。
- 将肝脏重新定位，暴露胆囊及胆总管全长。随后用血管夹夹闭胆总管的十二指肠开口，并在胆囊上切开一个小口。
注意：最佳的针头放置位置对于防止液体反流至肝脏和胆囊至关重要。 - 从胆囊开口处使用1.2步骤中的灌注针插管胆总管，然后向胰腺注入约2 mL胶原酶溶液。随后，使用两把无创显微镊子将灌注后的胰腺与肠道、胃和脾脏分离，并将其放入预冷的50 mL锥形管中置于冰上。
注意：对所有供体小鼠重复此过程。可将三只连续灌注的胰腺（间隔不超过40分钟）合并至一个50 mL锥形管中，每只胰腺预先加入3 mL胶原酶溶液。 - 每胰腺加入 100 μL DNase I（10 mg/mL）至 50 mL 锥形管中，在 37 °C 水浴中振荡消化 3–5 分钟。
注意：在水浴消化前，需在10秒间隔内剧烈振荡试管40次以解离组织，消化过程中则适度振荡试管。 - 加入终止液（2.5 mg/mL BSA-HBSS 溶液）至终体积为 50 mL，以阻断消化反应，并短暂离心试管至 750 x g 在 4 °C 下迅速停止。
- 弃去上清液，用15–25 mL BSA-HBSS轻轻重悬沉淀，洗涤2次。按照步骤1.7所述相同转速条件，短暂离心1分钟。
- 弃去上清液，将三个锥形管中的沉淀合并至一个50 mL锥形管中。用总体积10 mL的Histopaque-1119重悬沉淀，混匀后，沿管壁缓慢依次加入5 mL Histopaque-1077和5 mL HBSS。
- 在离心机中以 750 x g 4 °C 下离心 10 分钟，不启用刹车。
- 使用一次性5 mL巴斯德吸管，将HBSS/Histopaque-1077界面的胰岛吸出至50 mL锥形管中，加入BSA-HBSS至终体积50 mL，短暂离心（750 × g） g 在 4 °C 下。
- 弃去上清液，用30 mL BSA-HBSS洗涤胰岛。750 x g离心1分钟 g 在 4 °C 下。
- 使用30 mL培养基（10% FBS-1% P/S-CMRL-1066）重悬各管中的胰岛，并转移至直径10 cm的避光培养皿中。在体视显微镜下，利用200 μL加样枪头根据胰岛形态（即球形、白色）从溶液中手工挑选胰岛，放入含10 mL培养基的未处理细胞培养皿中。
注意：如果初次纯化的胰岛纯度不理想，可在初次挑选后进行第二次手工挑选。 - 通过光学显微镜下二苯硫腙染色检测手工挑选的胰岛纯度，并通过荧光显微镜下荧光素二乙酸酯（FDA）-碘化丙啶（PI）染色检测胰岛活力。
- 将分离的胰岛在培养箱中用培养基（同步骤1.13）于37 °C、95%空气-5% CO₂条件下培养2 移植前
2. ISWAT 胰岛移植
- 通过单次注射链脲佐菌素（STZ）在8周龄雄性C57BL/6小鼠（22 ± 2 g）中诱导糖尿病。在第-4天，禁食小鼠约4–6小时，然后使用0.1 M柠檬酸缓冲液（pH 4.4）配制2% STZ溶液。称重后重悬于缓冲液中，并以180 mg/kg剂量进行腹腔注射。
注意：STZ溶液需在使用前新鲜配制，并用铝箔包裹以避光。应立即使用，因其在15–20分钟内会失活。 - 在第-1天和第0天上午约10点，穿刺STZ注射后的小鼠尾静脉采集少量血液，使用试纸和基础血糖监测仪测量非空腹血糖水平。若连续两天检测的血糖水平均不低于20 mmol/L，则将该小鼠用作胰岛移植受体。
- 在第0天，称重并标记所有受体小鼠。通过腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥钠对每只受体小鼠进行麻醉。
注意：通过夹趾测试检查麻醉深度。若受体小鼠无缩足反射，则表明麻醉深度足够进行手术；否则追加10 mg/kg戊巴比妥钠。所用戊巴比妥钠以无菌生理盐水稀释至2%（m/v）浓度。 - 从-20 °C冰箱中取出水凝胶，置于冰上使其缓慢融化。水凝胶在4–10 °C时呈液态，在较高温度下会固化。
- 在体视显微镜下（如步骤1.13所述），将每只受体所需的约450–500个胰岛当量（IEQ）转移至无菌1.5 mL离心管中，加入200 µL培养基，并置于冰上直至准备移植。
- 使用75%乙醇擦拭受体小鼠左侧腹股沟区域。将小鼠仰卧位固定于手术台上，用手术胶带固定四肢。使用电动剃毛器剃除手术区域周围毛发，并用碘伏擦拭消毒。
- 使用眼科剪和无创微型镊在此区域做垂直皮肤切口，识别ISWAT中的下腹壁动静脉，并在血管上方创建一个小囊腔。
- 将含胰岛的离心管在200 x g条件下离心30秒，尽可能吸除上清液。吸取20 µL完全融化的水凝胶加入含胰岛的管中。轻柔重悬胰岛，避免产生气泡。
- 使用200 µL移液枪头将管中全部胰岛-水凝胶混合物注入受体小鼠的囊腔（步骤2.7）中。
注意：此过程需两名技术人员协作，一人用无创微型镊提起囊腔边缘，另一人将胰岛混合物注入囊腔。 - 待胰岛-水凝胶混合物完全固化后，在移植部位加入20 µL头孢菌素（约5–10 mg），然后使用5-0外科缝线采用连续缝合法关闭肌肉层和皮肤。
注意：由于体温作用，水凝胶约需3分钟完成固化。 - 将受体小鼠放入清洁笼中，并使用加热垫保温。持续监测直至小鼠完全恢复并开始自主活动。随后根据0.1 mg/kg剂量，腹腔注射0.03 mg/mL布托啡诺与无菌生理盐水混合液。
- 对每只受体小鼠重复执行步骤2.3–2.11。
- 在移植后第一个月内每周测量3–4次受体小鼠的非空腹血糖水平，之后每周测量1次（测量方法同步骤2.2）。
- 随访结束时（移植后第100天），在麻醉状态下（操作同步骤2.3），按照步骤2.6所述无菌操作流程，切除携带移植物的ISWAT组织。根据苏木精-伊红（H&E）染色及胰岛素和胰高血糖素免疫荧光的组织学方案，用福尔马林和多聚甲醛固定组织。
- 按照步骤2.10在受体小鼠上给予头孢菌素并缝合切口，然后按步骤2.11进行术后恢复处理。
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结果
本方案介绍了两种操作：小鼠胰岛的制备以及将胰岛移植至ISWAT位点。在第一种操作中，通过V型胶原酶溶液灌注和消化后，使用Histopaque-1119和Histopaque-1077进行纯化，并辅以手工挑选步骤，所分离的小鼠胰岛纯度足以用于移植（如图1所示），且具有高活力的分离胰岛将被用于移植（如图2所示）。在第二种操作中，使用STZ化学试剂诱导糖尿病至关重要。STZ的最佳剂量取决于小鼠品系和年龄，糖尿病成功诱导的标准为连续两天在同一时间测得的非空腹血糖水平均超过16.7 mmol/L。糖尿病小鼠在未接受胰岛移植的情况下可存活数周。胰岛移植物在移植至ISWAT位点前应与水凝胶充分混合，移植后需等待数分钟以使移植物在IWSAT中固定（图3）。当移植至ISWAT位点后，胰岛移植物可在约一个月内逆转高血糖状态，受体小鼠的体重也逐渐增加（图4）。移植后第100天，取出胰岛移植物进行组织学分析（
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讨论
胰岛移植是一种治疗1型糖尿病（T1DM）的有前景的疗法。该疗法的效果受多种因素影响，选择最佳的胰岛植入部位至关重要。理想的胰岛移植解剖部位应具备以下特征：便于进行简单的移植、活检和移植物取出操作；并发症较少；血糖控制成功率高；以及胰岛移植物的长期存活15,16。
我们团队此前描述了一种在小鼠模型中将胰岛移植至大网膜的实验方案17。与肾包膜下胰岛移植相比，大网膜移植后达到正常血糖水平所需时间较晚。因此，研究人员探索了其他可用于胰岛植入的部位。
已有研究报道，与肝脏移植相比，胰岛移植至腹股沟白色脂肪组织（ISWAT）所需胰岛数量更少即可逆转受体的高血糖状态，因此ISWAT可作为肝脏以外的替代移植位点14。此外，ISWAT位点易于进行胰岛移植操作，也便于移植物的观察和回收14...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了国家重点研发计划项目&中国国家重点研发计划（2017YFC1103704）、广东省高水平医院建设专项资金（2019）、深圳市医疗卫生“三名”工程（SZSM201412020）、深圳市高水平医学重点学科建设项目资助基金（2016031638）、深圳市科技计划项目（JCJY20160229204849975，GJHZ20170314171357556）、深圳市卫生和计划生育委员会科研项目（SZXJ2017021，SZXJ2018059）、广东省医学科研基金（A2019218）、中国博士后科学基金（2018M633218）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm 注射器驱动滤器单元 | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL 离心管 | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL 帕斯特移液管 | JingAn Biological, 中国 | J00085 | |
| 5 mL 注射器 | Szboon, 中国 | 20170829 | |
| 50 mL 锥形管 | Corning | 430829 | |
| 5-0 外科缝合线 | sh-Jinhuan, 中国 | CR537 | |
| 60 mL 注射器 | Szboon, 中国 | 20170623 | |
| 75% 乙醇 | LIRCON, 中国 | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | 稀释比例 (1:200) |
| 抗小鼠胰高血糖素抗体 | Abcam | ab10988 | 稀释比例 (1:100) |
| 抗小鼠胰岛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3014s | 稀释比例 (1:100) |
| 钝头灌注针 | Oloey, 中国 | 005 | 32G，黄色 |
| BSA | Meilune, 中国 | MB4219 | |
| C57BL/6 小鼠 | 广东省医学实验动物中心 | 8~10 周龄 | |
| 细胞培养皿 | BIOFIL, 中国 | TCD000100 | 普通，未处理，直径 87.8 mm |
| 离心机 | Thermo Scientific | ST16R | |
| 头孢菌素 | Lukang medical, 中国 | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos 宠物电推剪 | Szcodos, 中国 | CP-8000 | |
| V 型胶原酶 | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-Hank's 缓冲液 | Coolaber, 中国 | PM5140-10 | |
| 二苯硫腙 | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| 伊红染色液 | Beyotime Biotech, 中国 | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| 荧光素二乙酸酯 (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| 荧光显微镜 | Leica | DMIL | |
| 加样枪头 | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, 中国 | PM5150-10 | |
| 苏木精染色液 | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| 水凝胶 | BD Biosciences | 356234 | 基底膜基质 |
| 碘伏 | LIRCON, 中国 | 5190313 | |
| 避光培养皿 | DVS, 中国 | AN-5058548 | 自制，玻璃皿喷涂黑色油漆 |
| 医用胶带 | Cofoe, 中国 | K12001 | |
| 非侵入性微型镊子 | RWD Life Science | F11033-11 和 F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic 血糖监测系统 | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| 眼科剪刀 | RWD Life Science | S12012-12 和 S11001-08 | |
| P/S (青霉素/链霉素) | Gibco | 15140-122 | |
| 戊巴比妥钠 | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (链脲佐菌素) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| 试纸条 | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC 标记的山羊抗兔 IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | 稀释比例 (1:200) |
| 血管夹 | RWD Life Science | R31006-04 |
参考文献
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