本实验方案的总体目标是指导如何从中枢神经系统中提取、培养和分离小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞，随后用原生动物寄生虫进行感染。
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方法文章
同时分离原代星形胶质细胞和小胶质细胞用于原生动物寄生虫感染研究
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
星形胶质细胞和小胶质细胞是最丰富的胶质细胞类型，负责中枢神经系统（CNS）的生理支持和稳态维持。越来越多的证据表明它们参与调控感染性疾病，这促使人们日益关注改进原代星形胶质细胞和小胶质细胞的分离方法，以评估这些细胞对影响中枢神经系统感染的反应。鉴于克氏锥虫（Trypanosoma cruzi，T. cruzi）和刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，T. gondii）感染对中枢神经系统的重大影响，本文提供了一种从小鼠中提取、培养、解离并用原生动物寄生虫感染星形胶质细胞和小胶质细胞的方法。从新生小鼠大脑皮层提取的细胞在体外培养14天，并定期更换差异培养基。星形胶质细胞和小胶质细胞通过相同的提取流程经机械解离获得。细胞经流式细胞术进行表型鉴定后，使用原生动物寄生虫进行感染。通过荧光显微镜在不同时间点测定感染率，从而评估胶质细胞控制原生动物入侵和复制能力的差异。这些技术代表了研究星形胶质细胞和小胶质细胞对感染反应的简单、经济且高效的方法，为深入的神经免疫学分析开辟了新的研究途径。
引言
中枢神经系统（CNS）主要由神经元和胶质细胞组成1,2,3。小胶质细胞和星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞。小胶质细胞作为常驻巨噬细胞，是中枢神经系统中具有免疫活性和吞噬功能的胶质细胞3,4，而星形胶质细胞则负责维持内环境稳定并发挥支持性功能5。
尽管胶质细胞传统上被认为主要负责神经元的支持和保护作用6,7，但近年来的文献已报道了这些细胞的多种新功能，包括其对感染的响应8,9,10,11。因此，目前迫切需要开发出分离这些胶质细胞的方法，以分别研究其各自的功能。
相较于原代培养，存在一些用于研究胶....
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方案
涉及小鼠的所有实验程序均依照巴西国家法律（11.794/2008）进行，并经圣保罗联邦大学（UNIFESP）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 胶质细胞的提取、培养与解离
注意：用于胶质细胞提取的小鼠数量取决于所需进行实验的细胞量。在本方案中，从六只新生C57BL/6小鼠共获得2.7 × 107个星形胶质细胞和4 × 106个小胶质细胞。所有操作均在II级生物安全柜中的无菌条件下进行。
- 第1天
- 准备纯Hank's平衡盐溶液（HBSS）以及含10%热灭活胎牛血清（FBS）的HBSS（参见材料表）。
- 配制添加物的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12（含10% FBS + 0.08 mM青霉素 + 0.09 mM链霉素 + 12.5 mM HEPES + 30 mM碳酸氢钠，pH 7.2），并用0.22 µm滤器过滤（参见材料表）。
注：所有培养基应保存在4 °C，但在实验开始前需在37 °C预热20分钟。 - 将所有手术器械（剪刀、刮匙和镊子）在高压灭菌器中灭菌，并在操作过程中使用70%乙醇。
- 将新生小鼠（出生后不超过3天....
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结果
第14天th 天，胶质细胞培养（图1A) 进行了机械解离。通过流式细胞术对分离的细胞群体进行 CD11b、CD45 和 GFAP 标志物分析。我们观察到星形胶质细胞群体纯度为 89.5%，小胶质细胞群体纯度为 96.6%（图1B)。分离后，将细胞接种于96孔平底培养板中，24小时后即可用于感染 T. cruzi 或 T. gondii 根据相应的感染方案。此处我们提供了一次时间序列感染实验 T. cruzi 作为评估这些胶质细胞感染率的一个示例。
星形胶质细胞和小胶质细胞（每孔 3 × 104 个细胞）以 MOI = 5:1（寄生虫:细胞）的比例接种 T. cruzi，感染时间为 2–96 小时（图 2）。通过免疫荧光法评估.......
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讨论
在过去的二十年中，研究分离的胶质细胞在不同生物学背景下的功能变得愈发重要。理解中枢神经系统（CNS）中除神经元以外的功能仍是细胞生物学中一个不断发展的领域，尤其是在感染或炎症条件下8,9,24。胶质细胞的重要性不仅体现在为神经元提供物理支持（如先前所知），还涉及多种生理过程，例如为神经元提供能量、神经代谢、免疫监视、突触修剪以及组织的塑造与调节等3,25,26,27,28,29。
由于星形胶质细胞和小胶质细.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢圣保罗联邦大学（UNIFESP）的 Renato A. Mortara 博士教授提供抗 Ssp-4 的单克隆抗体 2C2。本研究得到了圣保罗州研究支持基金会（FAPESP，项目号 2017/25942-0，授予 K.R.B.）、国家科学技术发展委员会（CNPq，项目号 402100/2016-6，授予 K.R.B.）、国家疫苗科学与技术研究所（INCTV/CNPq）以及高等教育人员提升协调办公室（CAPES，资助代码 001）的资助。M.P.A. 获 CNPq 研究奖学金，A.L.O.P. 获 CAPES 研究奖学金，I.S.F 和 L.Z.M.F.B. 获 FAPESP 研究奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70% 乙醇 | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | 灭菌 |
| 75 cm2 培养瓶 | Corning | Cat: 430720U | 塑料材料 |
| 96 孔细胞培养板 | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | 细胞培养 |
| 氯化铵 (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | 去除自发荧光 |
| 抗 GFAP 抗体 | Abcam | Cat.: ab49874 | 免疫荧光抗体 |
| 瓶顶滤器 0.22 μm CA | Corning | Cat: 430513 | 培养基过滤 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS 缓冲液配制 |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | 流式细胞术抗体 |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | 流式细胞术抗体 |
| 离心机 | Eppendorf | Cat: 5810R | 离心 |
| 离心机 | Eppendorf | 5415R | 离心 |
| II 级生物安全柜 | Pachane | Cat: 200 | 无菌操作用生物安全柜 |
| CO2 培养箱 | ThermoScientific | 型号: 3110 | 原代细胞维持 |
| 15 mL 锥形管 | Corning | Cat: 430766 | 塑料材料 |
| 50 mL 锥形管 | Corning | Cat: 352070 | 塑料材料 |
| Countess 自动细胞计数仪 | Invitrogen | Cat: C10281 | 细胞计数 |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | 免疫荧光抗体 |
| 数码显微镜相机 | Nikon | Cat: DS-RI1 | 显微镜图像采集 |
| 杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | 细胞培养基 |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS 缓冲液配制 |
| F12 营养混合物 | Gibco | Cat: 21700-026 | 细胞培养基 |
| FACS Canto II | BD Biosciences | 不可用 | 流式细胞仪 |
| 胎牛血清 (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | 细胞培养基添加剂 |
| Flow Jo（软件） | Flow Jo | 版本: Flow Jo_9.9.4 | 数据分析 |
| 荧光光源 | Nikon | Cat: C-HGFI | 荧光光源 |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | 流式细胞术抗体 |
| 山羊抗小鼠 IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | 免疫荧光抗体 |
| HBSS - 亨克氏平衡盐溶液 | Gibco | Cat: 14175079 | 细胞培养基 |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | 细胞培养基添加剂 |
| IC 固定缓冲液 | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | 流式细胞术细胞固定 |
| 倒置显微镜 | Nikon | 型号: ECLIPSE TS100 | 显微镜 |
| 异氟烷 | Cristália | Cat: 21.2665 | 吸入性麻醉剂 |
| 甲醇 | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | 免疫荧光固定 |
| 微型刮勺 | ABC stainless | 不可用 | 手术材料 |
| 1.5 mL 微量离心管 | Axygen | Cat: MCT-150-C | 塑料材料 |
| 单克隆抗体 (mAb) 2C2 抗 Ssp-4 | 非商业化 | 非商业化 | 免疫荧光抗体 |
| 多通道移液器 (p200) | Corning | Cat: 751630124 | 移液试剂 |
| NIS Elements 软件 | Nikon | 版本 4.0 | 图像采集与分析 |
| 脱脂奶粉 | Nestlé | Cat: 9442405 | 免疫荧光封闭液 |
| 轨道摇床培养箱 | ThermoScientific | 型号: 481 Cat: 11 | 分离小胶质细胞与星形胶质细胞 |
| 多聚甲醛 (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | 免疫荧光固定 |
| PBS | 非商业化 | 非商业化 | 中性缓冲液 |
| 青霉素 G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | 细胞培养基添加剂 |
| 通透缓冲液 (10x) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | 流式细胞术细胞通透 |
| 培养皿 60 mm x 15 mm（一次性，无菌） | Prolab | Cat: 0303-8 | 塑料材料 |
| pH 计 | Kasvi | K39-1014B | pH 溶液校准 |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | Cat: 31800-014 | 细胞培养基 |
| 剪刀 | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | 手术材料 |
| 10 mL 移液管 | Corning | Cat: 4101 | 塑料材料 |
| 5 mL 移液管 | Corning | Cat: 4051 | 塑料材料 |
| 单通道移液器 (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | 移液试剂 |
| 单通道移液器 (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | 移液试剂 |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | 细胞培养基添加剂 |
| 硫酸链霉素 | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | 细胞培养基添加剂 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | 免疫荧光通透 |
| 胰蛋白酶 | Gibco | Cat: 27250-018 | 消化酶 |
| 镊子 | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | 手术材料 |
| 水浴锅 | Novatecnica | 型号: 09020095 | 37 °C 下用胰蛋白酶消化组织 |
参考文献
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S.
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