同时分离原代星形胶质细胞和小胶质细胞用于原生动物寄生虫感染研究

摘要

本实验方案的总体目标是指导如何从中枢神经系统中提取、培养和分离小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞，随后用原生动物寄生虫进行感染。

摘要

星形胶质细胞和小胶质细胞是最丰富的胶质细胞类型，负责中枢神经系统（CNS）的生理支持和稳态维持。越来越多的证据表明它们参与调控感染性疾病，这促使人们日益关注改进原代星形胶质细胞和小胶质细胞的分离方法，以评估这些细胞对影响中枢神经系统感染的反应。鉴于克氏锥虫（Trypanosoma cruzi，T. cruzi）和刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，T. gondii）感染对中枢神经系统的重大影响，本文提供了一种从小鼠中提取、培养、解离并用原生动物寄生虫感染星形胶质细胞和小胶质细胞的方法。从新生小鼠大脑皮层提取的细胞在体外培养14天，并定期更换差异培养基。星形胶质细胞和小胶质细胞通过相同的提取流程经机械解离获得。细胞经流式细胞术进行表型鉴定后，使用原生动物寄生虫进行感染。通过荧光显微镜在不同时间点测定感染率，从而评估胶质细胞控制原生动物入侵和复制能力的差异。这些技术代表了研究星形胶质细胞和小胶质细胞对感染反应的简单、经济且高效的方法，为深入的神经免疫学分析开辟了新的研究途径。

引言

中枢神经系统（CNS）主要由神经元和胶质细胞组成^1,2,3。小胶质细胞和星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞。小胶质细胞作为常驻巨噬细胞，是中枢神经系统中具有免疫活性和吞噬功能的胶质细胞^3,4，而星形胶质细胞则负责维持内环境稳定并发挥支持性功能⁵。

尽管胶质细胞传统上被认为主要负责神经元的支持和保护作用^6,7，但近年来的文献已报道了这些细胞的多种新功能，包括其对感染的响应^8,9,10,11。因此，目前迫切需要开发出分离这些胶质细胞的方法，以分别研究其各自的功能。

相较于原代培养，存在一些用于研究胶质细胞的替代模型，例如永生化细胞系和体内模型。然而，永生化细胞更容易发生遗传漂移和形态学改变，而体内研究则受限于操作条件。相反，原代培养易于操作，更接近体内细胞的特性，同时允许我们控制实验因素^12，13。本文中，我们描述了从小鼠中分离、培养和解离星形胶质细胞与小胶质细胞原代细胞的同一实验方案的指导原则。此外，我们还提供了在这些培养体系中进行原虫感染实验的操作示例。

从新生小鼠（不超过3日龄）中提取的中枢神经系统细胞在差异培养基中培养14天，以促进星形胶质细胞和小胶质细胞的选择性生长。由于小胶质细胞位于贴壁的星形胶质细胞层之上，因此通过轨道摇床进行机械分离。随后，收集含有小胶质细胞的全部上清液，并加入胰蛋白酶以解离星形胶质细胞。分离得到的胶质细胞通过流式细胞术进行表型鉴定，并根据所需实验进行接种培养。

我们还提供了如何用原生动物寄生虫感染这些分离的小胶质细胞和星形胶质细胞的示例。T. gondii 是一种具有高度嗜神经性的原生动物，可导致弓形虫病¹⁴，而 T. cruzi 则是恰加斯病的致病原，该病可导致中枢神经系统（CNS）出现神经系统障碍^15,16。此外，已有报道表明，在免疫功能低下患者中，T. gondii^17,18 或 T. cruzi^19,20,21 感染可能是导致死亡的潜在原因。因此，阐明中枢神经系统胶质细胞在控制原生动物感染中的免疫学作用具有重要意义。

方案

涉及小鼠的所有实验程序均依照巴西国家法律（11.794/2008）进行，并经圣保罗联邦大学（UNIFESP）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 胶质细胞的提取、培养与解离

注意：用于胶质细胞提取的小鼠数量取决于所需进行实验的细胞量。在本方案中，从六只新生C57BL/6小鼠共获得2.7 × 10⁷个星形胶质细胞和4 × 10⁶个小胶质细胞。所有操作均在II级生物安全柜中的无菌条件下进行。

1. 第1天
   1. 准备纯Hank's平衡盐溶液（HBSS）以及含10%热灭活胎牛血清（FBS）的HBSS（参见材料表）。
   2. 配制添加物的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12（含10% FBS + 0.08 mM青霉素 + 0.09 mM链霉素 + 12.5 mM HEPES + 30 mM碳酸氢钠，pH 7.2），并用0.22 µm滤器过滤（参见材料表）。
      注：所有培养基应保存在4 °C，但在实验开始前需在37 °C预热20分钟。
   3. 将所有手术器械（剪刀、刮匙和镊子）在高压灭菌器中灭菌，并在操作过程中使用70%乙醇。
   4. 将新生小鼠（出生后不超过3天）放入含有浸有异氟烷棉球的密闭容器中，麻醉5分钟。
   5. 用70%乙醇喷洒幼鼠，然后用剪刀剪下头部。
   6. 用剪刀沿颅骨从后向前做矢状切口以打开颅腔并暴露脑组织。用镊子将颅骨与脑组织分离。使用微型刮匙小心取出脑组织，以保持脑组织完整性。
   7. 将脑组织置于一个干燥的培养皿（直径6 cm）中。用微型刮匙去除嗅球和小脑。将大脑皮层转移至另一含有HBSS + 10% FBS（2 mL/培养皿）的培养皿（直径6 cm）中。
   8. 用无菌剪刀将脑组织剪成小块，并使用p1000移液器将每块脑组织连同HBSS + 10% FBS转移至不同的15 mL锥形管中。确保最终体积为2 mL/管；若不足，请用HBSS + 10% FBS补足。
      注：本步骤可暂停。若暂停，装有中枢神经系统组织的锥形管必须置于冰上，最长不超过1小时。
   9. 用3 mL HBSS + 10% FBS（每管）洗涤剪碎的脑组织，静置分层后小心吸除上清液。重复此步骤3次。
      注：本步骤旨在去除碎片并回收提取的组织。
   10. 用3 mL纯HBSS（每管）洗涤剪碎的脑组织，静置分层后小心吸除上清液。重复此步骤3次。
       注：本步骤旨在去除前次洗涤中残留的血清，因为细胞将在下一步进行胰蛋白酶消化。
   11. 每管加入3 mL胰蛋白酶，置于37 °C水浴中30分钟，每隔5分钟轻轻摇动一次。避免通过倒置或剧烈混合产生气泡。
       注：本步骤旨在消化收集的组织。
   12. 为灭活胰蛋白酶，每管用3 mL HBSS + 10% FBS洗涤组织，静置分层后小心吸除上清液。重复此步骤3次。
   13. 每管用3 mL纯HBSS洗涤组织，并小心吸除上清液。重复此步骤2次。
   14. 每管加入7 mL纯HBSS，通过连续使用不同移液管进行吹打以匀浆组织：先用10 mL移液管，再用5 mL移液管，最后用p1000移液器。
   15. 匀浆完成后，在4 °C条件下以450 x g离心5分钟。
   16. 弃去上清液，每管用4 mL HBSS + 10% FBS重悬沉淀。
   17. 将细胞转移至预处理的T-75培养瓶中，以促进细胞贴壁（参见材料表）。
       注：每只动物的组织应单独处理并接种于一个培养瓶中。
   18. 将培养瓶置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育30分钟，使细胞贴壁。
   19. 每瓶加入10 mL添加物的DMEM/F12，并在37 °C、5% CO₂条件下继续培养。
       注：每瓶最终体积为14 mL。
2. 第3天
   1. 从T-75培养瓶中移除7 mL培养基，并加入7 mL新鲜的添加物DMEM/F12。
      注：培养瓶中将含有大量细胞碎片，外观浑浊。
3. 第5天
   1. 将T-75培养瓶中的全部培养基移除，并加入14 mL新鲜的添加物DMEM/F12。
      注：更换培养基以去除碎片和未贴壁细胞。
   2. 此后每隔48小时，从培养瓶中移除6 mL上清液，并加入7 mL新鲜的添加物DMEM/F12，直至培养第14天。
4. 第14天
   1. 移除6 mL上清液并加入7 mL新鲜的添加物DMEM/F12后，将T-75培养瓶盖紧。
   2. 将培养瓶置于37 °C、200 rpm的轨道摇床上过夜，以机械方式分离小胶质细胞与星形胶质细胞。
5. 第15天
   1. 从摇床上取下培养瓶，用力用其自身培养基冲洗，以优化细胞解离并最大程度收集小胶质细胞。然后收集上清液（含小胶质细胞）并转移至50 mL锥形管中。
   2. 随后，每瓶加入4 mL胰蛋白酶，在37 °C孵育5分钟，以解离星形胶质细胞。
   3. 每瓶加入5 mL添加物DMEM/F12以灭活胰蛋白酶。用其自身培养基冲洗培养瓶，并将内容物转移至50 mL锥形管中。
   4. 将所有含有解离的小胶质细胞和星形胶质细胞的管在4 °C条件下以450 x g离心5分钟。
   5. 弃去上清液。将小胶质细胞沉淀重悬于1 mL添加物DMEM/F12中，星形胶质细胞沉淀重悬于10 mL添加物DMEM/F12中。
   6. 使用血球计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。将细胞以所需密度接种于适当的平底细胞培养板中（预处理以促进细胞贴附；参见材料表），并在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时，使细胞贴壁。
      注：保留每种细胞群体1.5 × 10⁶个细胞，用于通过流式细胞术确认纯度。
   7. 进行流式细胞术分析，以验证细胞群体的纯度。
      注：我们认为小胶质细胞为CD11b⁺/CD45⁺/GFAP^-，星形胶质细胞为CD11b^-/CD45^-/GFAP⁺。可考虑使用Iba1和TMEM119染色以全面表征小胶质细胞²²。
   8. 为每种细胞群体（星形胶质细胞和小胶质细胞）设置FMO（荧光减一）²³和未染色样本作为流式细胞术的对照。
   9. 为每种细胞群体，保留5 × 10⁵个细胞用于每个染色和未染色样本。对于FMO，另保留两个含小胶质细胞的管，每管含2.5 × 10⁵个细胞，以及另一个含5 × 10⁵个星形胶质细胞的管。
      注：由于小胶质细胞数量可能有限，未染色和FMO对照可使用较少细胞。
   10. 将所有微量离心管在4 °C条件下以450 x g离心5分钟。弃去上清液，每管用500 µL FACS缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBS）+ 0.5%牛血清白蛋白（BSA）+ 2 mM EDTA，pH 7.2）重悬沉淀。
   11. 将所有微量离心管在4 °C条件下以450 x g离心5分钟。弃去上清液，每管用100 µL抗CD16/CD32（克隆93）（1:50稀释于FACS缓冲液中）重悬沉淀，在室温孵育10分钟。
   12. 向所有微量离心管中每管加入500 µL FACS缓冲液，4 °C、450 x g离心5分钟。弃去上清液。将星形胶质细胞和小胶质细胞染色管以及星形胶质细胞FMO管用50 µL/管的表面标记物混合液（抗CD45（PE，克隆30-F11）和抗CD11b（eFluor 450，克隆M1/70），均以1:100稀释于FACS缓冲液中）重悬。
   13. 对于未染色细胞，用相同体积的FACS缓冲液重悬。对于小胶质细胞FMO，将每个小胶质细胞管分别与抗CD45或抗CD11b孵育。所有样本在4 °C避光孵育20分钟。
   14. 每管加入500 µL FACS缓冲液，4 °C、450 x g离心5分钟。弃去上清液，每管用100 µL固定缓冲液（参见材料表）重悬沉淀，在室温避光孵育20分钟。
   15. 每管加入500 µL 1×破膜缓冲液（参见材料表），在4 °C避光孵育5分钟。
   16. 将所有微量离心管在4 °C条件下以450 x g离心5分钟。弃去上清液。将星形胶质细胞和小胶质细胞染色管以及小胶质细胞FMO管用50 µL/管的细胞内抗体抗GFAP（APC，克隆GA5）（以1:100稀释于1×破膜缓冲液中）重悬。对于未染色细胞和星形胶质细胞FMO，用相同体积的FACS缓冲液重悬细胞。所有样本在4 °C避光孵育30分钟。
   17. 通过每管加入500 µL 1×破膜缓冲液洗涤所有管。将所有微量离心管在4 °C条件下以450 x g离心5分钟。每管用200 µL FACS缓冲液重悬。在流式细胞仪上每样本采集1 × 10⁵个事件。
   18. 分析时，应先在CD11b × CD45散点图中设门，再分析GFAP直方图。
       注：未染色和FMO对照有助于确定设门范围。

2. 感染及感染率的评估

1. 胶质细胞感染T. gondii
   1. 将3 × 10⁴个小胶质细胞或星形胶质细胞接种于经预处理的96孔平底板中，加入含补充剂的DMEM/F12培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养24小时（参见材料表）。
   2. 用表达黄色荧光蛋白（YFP）的T. gondii RH株速殖子感染各细胞群体，按感染复数（MOI）1:1（寄生虫:细胞）的比例，将速殖子稀释于每孔200 µL含补充剂的RPMI培养基（含3% FBS、0.16 mM青霉素、0.18 mM链霉素、12.5 mM HEPES和30 mM碳酸氢钠，pH 7.2）中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育48小时（参见材料表）。
   3. 随后弃去上清液，每孔加入100 µL用PBS稀释的1%多聚甲醛（PFA），于4 °C固定24小时。
   4. 将PFA替换为每孔100 µL、pH 7.2的PBS。
   5. 小心吸除上清液，每孔加入50 µL用pH 7.2 PBS稀释1:1,000的DAPI（5 mg/mL），室温避光孵育1分钟，对细胞核进行染色。
   6. 将DAPI染色液替换为每孔100 µL、pH 7.2的PBS，随后进行荧光显微镜观察。
2. 胶质细胞感染T. cruzi
   1. 将3 × 10⁴个小胶质细胞或星形胶质细胞接种于经预处理的96孔平底板中，加入含补充剂的DMEM/F12培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养24小时（参见材料表）。
      注意：每个感染时间点应使用不同的培养板。
   2. 用T. cruzi Y株的上鞭毛体以MOI为5:1（寄生虫:细胞）的比例感染胶质细胞，将上鞭毛体稀释于每孔200 µL含补充剂的RPMI培养基中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时。
      注意：此步骤对寄生虫侵入细胞至关重要。
   3. 弃去全部上清液，每孔加入200 µL含补充剂的RPMI洗涤一次，以去除所有胞外寄生虫；再次弃去上清液后，每孔加入200 µL新鲜的含补充剂RPMI培养基。
      注意：此步骤旨在去除未侵入贴壁细胞的寄生虫。
   4. 将感染后的细胞分别孵育2小时、48小时和96小时，以评估T. cruzi在胶质细胞内的复制情况¹¹。
   5. 在每个时间点后，弃去上清液，每孔加入100 µL甲醇，室温固定15分钟，随后将甲醇替换为每孔100 µL、pH 7.2的PBS。
   6. 固定后，按以下步骤进行免疫荧光染色：
      1. 为避免自发荧光，每孔加入100 µL用pH 8.0 PBS稀释的50 mM NH₄Cl，室温孵育15分钟；每孔加入100 µL PBS洗涤并立即吸除（重复该步骤3次）。
      2. 接着，每孔加入100 µL用PBS稀释的0.5% Triton，室温孵育15分钟以通透细胞；每孔加入100 µL PBS洗涤并立即吸除（重复该步骤3次）。
      3. 然后，每孔加入100 µL封闭液（含5%脱脂奶粉和2% BSA的PBS [pH 7.2]溶液），室温孵育1小时；每孔加入100 µL PBS洗涤并立即吸除（重复该步骤3次）。
      4. 为染色无鞭毛体，每孔加入30 µL用封闭液稀释1:200的非商业化单克隆抗体（mAb）2C2抗-Ssp-4蛋白，室温孵育1小时。
      5. 每孔加入100 µL PBS洗涤并立即吸除（重复该步骤3次）；每孔加入30 µL用PBS稀释1:500的二抗（抗小鼠抗体），室温孵育1小时。
         注意：非商业化单克隆抗体mAb 2C2抗-Ssp-4蛋白由圣保罗联邦大学微生物学、免疫学与寄生虫学系Renato A. Mortara教授惠赠。
      6. 小心吸除上清液，每孔加入50 µL用pH 7.2 PBS稀释1:1,000的DAPI（5 mg/mL），室温避光孵育1分钟，对细胞核进行染色。
      7. 将DAPI染色液替换为每孔100 µL、pH 7.2的PBS，随后进行荧光显微镜观察。

结果

第14天^th 天，胶质细胞培养（图1A) 经机械解离。分离的细胞群体通过流式细胞术分析 CD11b、CD45 和 GFAP 标志物。我们可观察到星形胶质细胞群体纯度为 89.5%，小胶质细胞群体纯度为 96.6%（图1B)。分离后，将细胞接种于96孔平底培养板中，24小时后即可用于感染 T. cruzi 或 T. gondii 根据相应的感染方案。此处我们提供了一次时间进程感染的 T. cruzi 作为评估这些胶质细胞感染率的一个示例。

星形胶质细胞和小胶质细胞（每孔 3 × 10⁴ 个细胞）以 MOI = 5:1（寄生虫:细胞）的感染复数接种 T. cruzi，感染时间为 2–96 小时（图 2）。通过免疫荧光法检测感染率...

讨论

在过去的二十年中，研究分离的胶质细胞在不同生物学背景下的功能变得愈发重要。理解中枢神经系统（CNS）中除神经元以外的功能仍是细胞生物学中一个不断发展的领域，尤其是在感染或炎症条件下^8,9,24。胶质细胞的重要性不仅体现在为神经元提供物理支持（如先前所知），还涉及多种生理过程，例如为神经元提供能量、神经代谢、免疫监视、突触修剪以及组织的塑造与调节等^{3,25,26,27,28,29}。

由于星形胶质细胞和小胶质细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70% 乙醇	Dinâmica Química Contemporânea	Cat: 2231	灭菌
75 cm2 培养瓶	Corning	Cat: 430720U	塑料材料
96 孔细胞培养板	Greiner Cellstar	Cat: 655090	细胞培养
氯化铵 (NH4Cl)	Dinâmica Química Contemporânea	Cat: C10337.01.AH	去除自发荧光
抗 GFAP 抗体	Abcam	Cat.: ab49874	免疫荧光抗体
瓶顶滤器 0.22 μm CA	Corning	Cat: 430513	培养基过滤
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma Aldrich	Cat: A7906	FACS 缓冲液配制
CD11b (FITC)	BD Pharmigen	Cat.: 553310	流式细胞术抗体
CD45 (PE)	Invitrogen	Cat.: 12-0451-83	流式细胞术抗体
离心机	Eppendorf	Cat: 5810R	离心
离心机	Eppendorf	5415R	离心
II 级生物安全柜	Pachane	Cat: 200	无菌操作用生物安全柜
CO2 培养箱	ThermoScientific	型号: 3110	原代细胞维持
15 mL 锥形管	Corning	Cat: 430766	塑料材料
50 mL 锥形管	Corning	Cat: 352070	塑料材料
Countess 自动细胞计数仪	Invitrogen	Cat: C10281	细胞计数
DAPI	Invitrogen	Cat.: D1306	免疫荧光抗体
数码显微镜相机	Nikon	Cat: DS-RI1	显微镜图像采集
杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM)	Gibco	Cat: 12800-058	细胞培养基
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Sigma Aldrich	Cat: E9884	FACS 缓冲液配制
F12 营养混合物	Gibco	Cat: 21700-026	细胞培养基
FACS Canto II	BD Biosciences	不可用	流式细胞仪
胎牛血清 (FBS)	LGC Biotechnology	Cat: 10-bio500-1	细胞培养基添加剂
Flow Jo（软件）	Flow Jo	版本: Flow Jo_9.9.4	数据分析
荧光光源	Nikon	Cat: C-HGFI	荧光光源
GFAP (APC)	Invitrogen	Cat.: 50-9892-82	流式细胞术抗体
山羊抗小鼠 IgG (FITC)	Kirkeegood&Perry Lab (KPL)	Cat.: 172-1806	免疫荧光抗体
HBSS - 亨克氏平衡盐溶液	Gibco	Cat: 14175079	细胞培养基
HEPES	Sigma Aldrich	Cat: H4034	细胞培养基添加剂
IC 固定缓冲液	Invitrogen	Cat: 00-8222-49	流式细胞术细胞固定
倒置显微镜	Nikon	型号: ECLIPSE TS100	显微镜
异氟烷	Cristália	Cat: 21.2665	吸入性麻醉剂
甲醇	Synth	Cat: 01A1085.01.BJ	免疫荧光固定
微型刮勺	ABC stainless	不可用	手术材料
1.5 mL 微量离心管	Axygen	Cat: MCT-150-C	塑料材料
单克隆抗体 (mAb) 2C2 抗 Ssp-4	非商业化	非商业化	免疫荧光抗体
多通道移液器 (p200)	Corning	Cat: 751630124	移液试剂
NIS Elements 软件	Nikon	版本 4.0	图像采集与分析
脱脂奶粉	Nestlé	Cat: 9442405	免疫荧光封闭液
轨道摇床培养箱	ThermoScientific	型号: 481 Cat: 11	分离小胶质细胞与星形胶质细胞
多聚甲醛 (PFA)	Sigma Aldrich	Cat: P6148	免疫荧光固定
PBS	非商业化	非商业化	中性缓冲液
青霉素 G	Sigma Aldrich	Cat: P-7794	细胞培养基添加剂
通透缓冲液 (10x)	Invitrogen	Cat: 00-8333-56	流式细胞术细胞通透
培养皿 60 mm x 15 mm（一次性，无菌）	Prolab	Cat: 0303-8	塑料材料
pH 计	Kasvi	K39-1014B	pH 溶液校准
RPMI 1640 培养基	Gibco	Cat: 31800-014	细胞培养基
剪刀	ABC stainless	Cat: LO9-W4	手术材料
10 mL 移液管	Corning	Cat: 4101	塑料材料
5 mL 移液管	Corning	Cat: 4051	塑料材料
单通道移液器 (p1000)	Gilson Pipetman	Cat: F123602	移液试剂
单通道移液器 (p200)	Gilson Pipetman	Cat: F123601	移液试剂
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	Cat: S6297	细胞培养基添加剂
硫酸链霉素	Sigma Aldrich	Cat: S9137	细胞培养基添加剂
Triton X-100	Sigma Aldrich	Cat: T9284	免疫荧光通透
胰蛋白酶	Gibco	Cat: 27250-018	消化酶
镊子	ABC stainless	Cat: L28-P4-172	手术材料
水浴锅	Novatecnica	型号: 09020095	37 °C 下用胰蛋白酶消化组织