本文介绍了一种利用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测细胞内总活性氧（ROS）的实验方案。该方法可通过荧光显微镜观察贴壁细胞中活性氧的定位，并利用荧光酶标仪对活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便、高效且成本较低。
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摘要
摘要
氧化应激在生理和病理条件下均是一个重要的事件。在本研究中，我们以结直肠癌细胞系为例，演示如何通过使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色检测总活性氧（ROS）来定量氧化应激水平。本方案详细描述了DCFH-DA溶液的配制、细胞与DCFH-DA溶液的孵育以及归一化荧光强度的测定步骤。DCFH-DA染色是一种简单且经济有效的方法，可用于检测细胞内的活性氧。该方法可用于评估化学处理或基因修饰后活性氧的生成情况。因此，它有助于研究环境应激下细胞的氧化应激状态，为机制性研究提供线索。
引言
细胞代谢产生的三种具有生理意义的主要活性氧（ROS）是超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢1。在低浓度时，它们参与正常的细胞生理过程；但在高浓度时，会对细胞信号通路产生不利影响1。人体已进化出抗氧化系统，可有效对抗过量的活性氧。然而，当活性氧的产生超过机体的解毒能力时，就会发生氧化应激，这与多种病理状态相关，包括炎症、癌症和神经退行性疾病2,3,4。本方法旨在利用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色法测定贴壁细胞中的总细胞内活性氧水平。其原理在于，DCFH-DA被氧化为2',7'-二氯荧光素（DCF）的方法已被广泛用于总活性氧的检测，包括羟基自由基（•OH）和二氧化氮（•NO2）。从机制上讲，DCFH-DA被细胞摄取后，细胞内的酯酶会切除其乙酰基团，生成DCFH。DCFH被活性氧氧化后转化为DCF，后者在激发波长485 nm和发射波长530 nm处发出绿色荧光。与流式细胞术及其他替代方法相比5，使用荧光显微镜和酶标仪进行检测的优势在于可以获得清晰可见的荧光图像，且操作简便、高效且成本较低。该方法已被广泛应用于各种研究条件下细胞活性氧的检测6,7,8。本实验方案适用于贴壁细胞中总活性氧的检测。若用于悬浮细胞中活性氧的检测，可能需要进行一些调整。
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方案
1. 细胞接种
- 在24孔板中每孔接种 2 x 105 个 HCT116 结直肠癌细胞，并在 37 °C 条件下于杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养过夜。
- 将培养基更换为含或不含 100 µM 硫酸亚铁（FS）或 10 µM 阿霉素（DOX）的培养基，继续孵育 24 小时。
2. DCFH-DA 溶液的配制
- 将 4.85 mg DCFH-DA 溶解于 1 mL 二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 10 mM 储存液。
- 使用预热的 DMEM 将储存液稀释成 10 µM 工作液，再加入孔板中。
- 将工作液涡旋振荡 10 秒。
3. DCFH-DA 染色
- 移除含药物的培养基，并用 DMEM 洗涤一次。
- 向每孔中加入 500 µL DCFH-DA 工作液，在 37 °C 孵育 30 分钟。
- 移除 DCFH-DA 工作液，用 DMEM 洗涤一次，再用 1× 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤两次。
- 向每孔中加入 500 µL 1× PBS。
4. 成像采集与强度测量
- 使用荧光显微镜的绿色荧光蛋白（GFP）通道，为每个孔拍摄具有代表性的荧光图像。
- 拍摄图像后，移除 PBS，并向每孔中加入 200 µL 放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液。
- 冰上孵育 5 分钟，然后将细胞裂解液收集至 1.5 mL 离心管中。
- 在 4 °C 条件下，以 21,130 × g 离心 10 分钟。
- 将 100 µL 上清液转移至黑色 96 孔板中，使用荧光酶标仪在激发波长 485 nm 和发射波长 530 nm 下测定荧光强度。
- 取 1 µL 上清液转移至含有 100 µL 1× 蛋白检测试剂的透明 96 孔板中，采用 Bradford 法测定蛋白浓度9。
- 用蛋白浓度对荧光强度进行归一化处理。
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结果
为诱导氧化应激，将 HCT116 结直肠癌细胞用 100 µM FS 或 10 µM DOX 处理7。如图1所示，FS 和 DOX 均显著增强了绿色荧光，结果符合预期。为定量分析相对荧光强度变化，在拍摄图像后裂解细胞，并根据蛋白质浓度进行归一化处理。定量结果显示，FS 或 DOX 均显著提高了 HCT116 细胞中的荧光强度。
图 1：铁处理增加结直肠癌细胞中的活性氧（ROS）水平。 使用荧光显微镜拍摄的代表性荧光图像，并通过荧光酶标...
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讨论
本文所述实验方案易于重复，可用于检测细胞内总活性氧（ROS）。关键步骤包括：新鲜配制DCFH-DA溶液并避免光照，尽量减少对细胞状态的干扰，以及在成像前进行充分的PBS洗涤。在配制DCFH-DA工作液时，应于加入24孔板前，将储备液直接加入预温的DMEM培养基中。原因是陈旧溶液或光照会导致本底荧光升高或发生光漂白。大多数研究使用1× PBS或1× Hanks平衡盐溶液（HBSS）稀释DCFH-DA，并作为反应缓冲液10。然而，在使用HCT116和RKO细胞时，若用PBS稀释DCFH-DA储备液并加入无胎牛血清的DMEM，即使未经处理的细胞也会出现较高的本底信号，这可能是由于细胞状态受到干扰所致。此外，DCFH-DA工作液应沿孔壁缓慢加入，剧烈操作引起的细胞状态扰动会导致荧光信号显著高于未受扰动的邻近区域。成像前至少用PBS洗涤两次，以降低含酚红的DMEM产生的自发荧光。虽然无酚红DMEM可能是更优选择，但本文结果显示，PBS洗涤已足以将自发荧光降至最低。如图1所示，即使在未经处理的对照组中，不同批次的实验也可能获得不同的代表性图像...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（K01DK114390）、美国癌症协会研究学者奖（RSG-18-050-01-NEC）、新墨西哥大学环境健康特色项目与超级基金研究试点项目资助（P42 ES025589）、新墨西哥大学综合癌症中心共享资源试点项目奖和研究项目支持试点项目奖（P30CA118100），以及新墨西哥大学医学院专项健康研究基金新研究员奖的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| 盐酸多柔比星 | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| 七水合硫酸亚铁 | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto 成像系统 | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | 或任何其他荧光显微镜 |
| Bradford 蛋白检测试剂 | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 微孔板读板仪 | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | 或任何其他荧光微孔板读板仪 |
参考文献
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- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17(2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
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- Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
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- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
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重印与许可
