所述方法结合了实验性尾静脉转移模型与活体动物实时成像技术，可实现对乳腺癌转移灶形成和生长的实时监测，同时还能对肺部转移灶的数量和大小进行定量分析。
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摘要
摘要
转移是癌症相关死亡的主要原因，而转移性疾病患者的治疗选择十分有限。为了鉴定和验证新的治疗靶点，推动开发更有效的转移性疾病治疗方法，需要借助临床前的体内模型。本文展示了一种用于检测乳腺癌转移定植及后续生长的同源小鼠模型。将转移性癌细胞通过病毒载体稳定转导，使其表达萤火虫荧光素酶和ZsGreen蛋白。随后在表达荧光素酶/ZsGreen的癌细胞中对候选基因进行稳定调控，再将这些细胞通过小鼠尾静脉注射进入体内，以检测其转移定植和生长能力。利用活体成像设备检测活体动物体内肿瘤细胞的生物发光或荧光信号，从而定量分析转移负荷随时间的变化。由于荧光蛋白的表达，实验结束时无需进行组织切片或组织学染色，即可定量肺部转移灶的数量和大小。该方法为研究候选基因在转移定植和生长过程中的作用提供了一种相对快速且简便的手段，并比传统的尾静脉转移实验提供了更丰富的信息。通过该方法，我们发现，在乳腺癌细胞中同时敲低Yes相关蛋白（YAP）和含PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ），可导致肺部转移负荷降低，这种减少是由于转移定植能力显著受损以及转移灶生长减缓所致。
引言
癌症仍然是全球第二大死亡原因1，而转移是导致这些死亡的主要原因2,3。然而，对调控转移性定植及后续生长的分子机制了解有限，阻碍了针对转移性疾病的有效治疗手段的开发。要鉴定新的治疗靶点，需要一种能够检测候选基因表达或功能改变如何影响转移形成和生长的实验方法。尽管原位小鼠模型具有其优势，但构建过程耗时且成本高昂，因此更适用于靶点验证而非靶点发现。相比之下，移植模型系统可在体外对癌细胞中的候选基因进行干预，然后在体内评估其对转移潜能的影响，这类系统成本较低且通量更高。此外，可用于稳定递送RNAi、CRISPR/CAS9和转基因的病毒载体广泛可得，使得在癌细胞系中干预几乎任何目标基因或基因组合都相对容易实现。该方法还可通过将细胞移植到免疫缺陷小鼠或人源化小鼠体内，用于检测候选基因在人类癌细胞系中对转移性定植和生长的作用。
用于检测移植癌细胞在体内形成转移瘤的两种实验方法是自发转移实验和实验性转移实验。在自发转移实验4,5中，将癌细胞注射到小鼠体内，使其形成原发性肿瘤，随后检测自发转移的形成及其后续生长情况。该模型的优点在于，细胞必须完成转移过程的所有步骤才能形成转移性肿瘤。然而，许多癌细胞系在自发转移模型....
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方案
本方案涉及小鼠和生物危害性材料的使用，需获得相应机构安全委员会的批准。本文所述所有体内实验均已获得奥尔巴尼医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
注意：有关实验方案概述，请参见图1中的示意图。
1. 包装所有必需的逆转录病毒和慢病毒
注意：本方案采用慢病毒或逆转录病毒载体，以稳定表达荧光素酶和荧光蛋白，并调控候选基因的表达。这些病毒在 HEK-293FT 细胞中进行包装，具体步骤如下所述。
- 第1天：在6孔板中接种HEK-293FT细胞，每孔加入2 mL完全培养基（含10%胎牛血清的DMEM，添加1%青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺），使细胞在第2天达到40–60%融合度。于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
- 第2天：针对每种待包装的病毒载体，将40–60%融合度的HEK-293FT细胞孔分别转染逆转录病毒或慢病毒载体，以及编码病毒包膜蛋白和包装蛋白的相应辅助载体。
注：本方案使用VSVG作为包膜蛋白，psPAX2用于慢病毒包装，gag-pol用于逆转录病毒包装（载体列表详见补充表1）。 - 为每个孔配制共转染混合物，步骤如下：
- 将....
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结果
为了验证上述方法，我们进行了一项概念验证实验，其中在一种转移性小鼠乳腺癌细胞系（4T122）中敲低了一个关键的复制因子RPA3。尽管本方案描述了在基因操作之前用荧光素酶和荧光蛋白对细胞进行标记，但我们采用了一种改良方法，因为RNAi载体本身也递送ZsGreen（图2A）。首先，将4T1细胞通过慢病毒载体稳定转导，该载体编码萤火虫荧光素酶和潮霉素抗性（pHAGE-Luciferase-IRES-Hygro）。经过潮霉素筛选后，进行荧光素酶检测以确认萤火虫荧光素酶的稳定表达（图2A）。随后，将4T1-Luciferase细胞通过逆转录病毒载体稳定转导，这些载体表达ZsGreen以及一种对照miR30型shRNA，或一种先前已被证明可有效靶向小鼠RPA3的miR30型shRNA16,23
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讨论
方法的关键步骤
针对特定的细胞系和小鼠品系，优化注射的细胞数量（步骤3）至关重要，因为这会显著影响所形成转移灶的数量以及实验的持续时间。如果注射的细胞过多，或转移灶生长时间过长，则可能难以准确计数转移灶，从而难以评估基因操作的效果。然而，如果注射的细胞数量过少，则可能形成极少甚至没有转移灶。因此，应先进行预实验，使用不同数量的细胞，以确定最佳的细胞注射数量及转移灶生长的合适时间。为了确保每组内小鼠的转移灶数量具有一致性，必须向每只小鼠注射等量的活细胞。由于细胞在离心管和注射器中可能发生沉降，因此在装填注射器前应轻轻重悬细胞，并且细胞悬液在注射器中放置时间不宜过长（步骤4.3.2）。细胞在悬液中时间越长，活力越低，因此从胰酶消化到完成细胞注射的时间间隔不应超过一小时（步骤4.2.5）。不得注射气泡或大的细胞团块，因为这些可能导致栓塞并致小鼠死亡。此外，通过针头吸取细胞可能造成细胞剪切损伤，因此应在不安装针头的情况下先完成注射器的装填。为确认各小鼠注射的细胞数量相对一致，可在注射后立即进行活体动物成像（图2B
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Emily Norton 在病毒感染实验和文稿审阅方面提供的帮助。我们还感谢 Ryan Kanai 在获取肺组织图像方面给予的支持，以及 Kate E. Tubbesing 在肺部绿色转移灶图像分析方面的协助。感谢动物实验设施工作人员为本视频的制作所提供的支持与帮助。本研究工作得到了 Susan G. Komen 职业催化剂基金的资助，该基金授予 J.M.L.（#CCR17477184）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% SDS-PAGE 凝胶 | 用于蛋白质印迹实验 | ||
| 2.5% 胰蛋白酶 | Gibco | 15090-046 | 组织培养用胰蛋白酶 |
| 96孔平底白色检测板 | 康宁 | 3922 | 用于检测培养细胞中的荧光素酶和海肾荧光素酶信号 |
| 酒精棉片 | 尾静脉注射前对注射部位进行消毒 | ||
| BALB/C 小鼠（雌性，6 周龄） | Taconic | BALB-F | 尾静脉转移定植与负荷检测 |
| BSA常规 | VWR Ameresco | 97061-416 | 用于蛋白质印迹实验 |
| 细胞裂解缓冲液 | 细胞信号传导 | 用于收集蛋白质样品 | |
| Celltreat 滤器，PES 30 mm，0.45 μm μm | Celltreat | 40-229749-CS | 用于过滤病毒上清液 |
| CO2 和安乐死舱室 | 用于安乐死小鼠 | ||
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | E1960 | 用于检测培养细胞中的荧光素酶和海肾荧光素酶信号 |
| 杜尔贝科&磷酸盐缓冲液 | Himedia | TS1006 | 用于 PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | 用于稀释组织培养用胰蛋白酶 |
| FBS 100% 美国来源 | VWR | 97068-085 | 完全培养基的组分 |
| 富士胶片 LAS-3000 凝胶成像系统 | 富士胶片 | 用于蛋白质印迹实验 | |
| GAPDH(14C10) 兔单克隆抗体 | 细胞信号传导 | 2118 | 用于蛋白质印迹实验 |
| 山羊抗兔IgG（H+L）二抗，HRP标记 | 赛默飞世尔科技 | 31460 | 用于蛋白质印迹实验 |
| 人胚胎肾细胞，HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | 用于病毒包装的细胞系 |
| HyClone DMEM/高糖 | GE Healthcare生命科学 | SH30243.01 | 完全培养基的组分 |
| 潮霉素B，超纯级 | VWR Ameresco | 97064-810 | 用于感染细胞的抗生素筛选 |
| I3-P/i3 多模式微孔板/EA | 分子装置 | 用于检测培养细胞中的荧光素酶和海肾荧光素酶信号 | |
| ImageJ | 用于肺转移灶图像分析：阈值设为25 &和 100 | ||
| 免疫印迹PVDF膜 | 伯乐（Bio-Rad） | 1620177 | 用于蛋白质印迹实验 |
| 异氟烷 | 用于小鼠麻醉 | ||
| IVIS Lumina XRMS 活体成像系统（活体动物活体成像装置） | PerkinElmer | CLS136340 | 用于体内成像检测转移负荷 |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G（GFP 和明场滤光片） | 徕卡显微系统 | 用于肺部转移灶成像、计数及拍照的显微镜与相机；10倍放大，3.5秒曝光，1.4增益 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-081 | 完全培养基的组分 |
| Lipofectamine 3000 | 生命技术 | L3000008 | YAP/TAZ-TEAD 报告基因转染 |
| Living Image 3.2（图像软件程序） | PerkinElmer | IVIS 软件 | |
| 小鼠乳腺癌细胞，4T1 | 卡曼诺斯癌症研究所 | Aslakson, CJ 等，1992 | 小鼠转移性乳腺癌细胞系 |
| Multi-Gauge 版本 3.0 | 富士胶片 | 用于定量 Western 印迹条带强度的软件 | |
| Opti-MEM（转染缓冲液） | Gibco | 31985-062 | 用于病毒包装和转染 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | 完全培养基的组分 |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 23225 | 用于定量蛋白质浓度 |
| Pierce 磷酸酶抑制剂迷你片剂 | 赛默飞世尔科技 | A32957 | 加入细胞裂解缓冲液 |
| Pierce 蛋白酶抑制剂迷你片剂 | 赛默飞世尔科技 | A32953 | 加入细胞裂解缓冲液 |
| Polybrene（六亚甲基溴化铵） | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | 用于感染 |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | 用于感染细胞的抗生素筛选 |
| 啮齿类动物固定器 | 用于小鼠尾静脉注射时的固定 | ||
| SDS-PAGE电泳缓冲液 | 用于蛋白质印迹实验 | ||
| TAZ (V3886) 抗体 | 细胞信号传导 | 4883 | 用于蛋白质印迹实验 |
| TBST缓冲液 | 用于蛋白质印迹实验 | ||
| TC20 自动细胞计数仪 | 伯乐（Bio-Rad） | 用于细胞计数 | |
| 载体 | 参见表1以获取载体的完整列表 | ||
| VWR 倒置荧光显微镜 | VWR | 89404-464 | 用于观察ZSGreen标记细胞中的荧光 |
| Western 转印缓冲液 | 用于蛋白质印迹实验 | ||
| XenoLight D-荧光素钾盐 | PerkinElmer | 122799 | 用于活体生物发光IVIS成像的小鼠底物注射 |
| X-tremeGENE 9 DNA转染试剂（用于转染的脂质溶液） | 罗氏 | 6365787001 | 用于病毒包装 |
| YAP (D8H1X) XP 兔单克隆抗体 | 细胞信号传导 | 14074 | 用于蛋白质印迹实验 |
参考文献
- Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. , Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A.
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重印与许可
