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方法文章

联合使用尾静脉转移实验与活体实时成像技术定量分析乳腺癌肺部转移定植及负荷

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DOI：

10.3791/60687

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2019年12月19日

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1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

本文内容

摘要

所述方法结合了实验性尾静脉转移模型与活体动物实时成像技术，可实现对乳腺癌转移灶形成和生长的实时监测，同时还能对肺部转移灶的数量和大小进行定量分析。

摘要

转移是癌症相关死亡的主要原因，而转移性疾病患者的治疗选择十分有限。为了鉴定和验证新的治疗靶点，推动开发更有效的转移性疾病治疗方法，需要借助临床前的体内模型。本文展示了一种用于检测乳腺癌转移定植及后续生长的同源小鼠模型。将转移性癌细胞通过病毒载体稳定转导，使其表达萤火虫荧光素酶和ZsGreen蛋白。随后在表达荧光素酶/ZsGreen的癌细胞中对候选基因进行稳定调控，再将这些细胞通过小鼠尾静脉注射进入体内，以检测其转移定植和生长能力。利用活体成像设备检测活体动物体内肿瘤细胞的生物发光或荧光信号，从而定量分析转移负荷随时间的变化。由于荧光蛋白的表达，实验结束时无需进行组织切片或组织学染色，即可定量肺部转移灶的数量和大小。该方法为研究候选基因在转移定植和生长过程中的作用提供了一种相对快速且简便的手段，并比传统的尾静脉转移实验提供了更丰富的信息。通过该方法，我们发现，在乳腺癌细胞中同时敲低Yes相关蛋白（YAP）和含PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ），可导致肺部转移负荷降低，这种减少是由于转移定植能力显著受损以及转移灶生长减缓所致。

引言

癌症仍然是全球第二大死亡原因1，而转移是导致这些死亡的主要原因2,3。然而，对调控转移性定植及后续生长的分子机制了解有限，阻碍了针对转移性疾病的有效治疗手段的开发。要鉴定新的治疗靶点，需要一种能够检测候选基因表达或功能改变如何影响转移形成和生长的实验方法。尽管原位小鼠模型具有其优势，但构建过程耗时且成本高昂，因此更适用于靶点验证而非靶点发现。相比之下，移植模型系统可在体外对癌细胞中的候选基因进行干预，然后在体内评估其对转移潜能的影响，这类系统成本较低且通量更高。此外，可用于稳定递送RNAi、CRISPR/CAS9和转基因的病毒载体广泛可得，使得在癌细胞系中干预几乎任何目标基因或基因组合都相对容易实现。该方法还可通过将细胞移植到免疫缺陷小鼠或人源化小鼠体内，用于检测候选基因在人类癌细胞系中对转移性定植和生长的作用。

用于检测移植癌细胞在体内形成转移瘤的两种实验方法是自发转移实验和实验性转移实验。在自发转移实验4,5中，将癌细胞注射到小鼠体内，使其形成原发性肿瘤，随后检测自发转移的形成及其后续生长情况。该模型的优点在于，细胞必须完成转移过程的所有步骤才能形成转移性肿瘤。然而，许多癌细胞系在自发转移模型中不能有效转移，且任何影响原发性肿瘤生长的细胞操作都可能干扰转移实验的结果。为避免这些问题，可采用实验性转移实验，即将癌细胞直接注射入血液循环中。常见的实验性转移实验包括尾静脉注射6,7,8（本文中展示的方法）、心脏内注射9和门静脉注射10。

本方案的目的是提供一种体内实验性转移检测方法，使研究人员能够实时监测转移灶的形成与生长过程，并在同一小鼠肺组织中定量终点转移灶的数量和大小。为实现这一目标，将传统的实验性尾静脉转移检测方法6,7,8 与活体动物成像技术相结合，使用活体成像设备9,11,12,13,14 进行检测。将稳定表达荧光素酶和荧光蛋白的肿瘤细胞通过小鼠侧尾静脉注射，随后利用活体成像设备随时间测量肺部转移负荷的变化（图1）。然而，活体动物成像设备无法区分或测量单个转移灶的大小。因此，在实验结束时，使用荧光体视显微镜对肺组织中荧光标记的转移灶进行计数并测量其大小，无需进行切片、组织学或免疫组织化学分析（图1）。该方案可用于检测候选基因表达或功能改变对转移灶形成和生长的影响，也可用于评估潜在治疗化合物（如小分子化合物或功能阻断型抗体）的效果。

为了验证这一方法，我们首先进行了一项概念验证实验，其中在转移性小鼠乳腺癌细胞中敲低了关键的复制因子——复制蛋白A3（RPA3）。结果显示，与注射对照细胞的小鼠相比，注射RPA3敲低细胞的小鼠在各个时间点的转移负荷均显著降低。对含有转移灶的肺组织进行分析表明，这种转移负荷的减少是由于转移性定植能力显著下降，以及所形成的转移灶生长受损所致。为进一步展示该技术的应用，我们检测了同时敲低Yes相关蛋白（YAP）和含有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）是否会影响转移性定植或后续生长。YAP和TAZ是两个相关的转录共激活因子，为Hippo信号通路的关键下游效应分子。我们15,16及其他研究者已将YAP和TAZ与肿瘤转移联系起来（详见综述17,18,19），提示这些蛋白是潜在的治疗靶点。与此一致，我们发现注射YAP/TAZ敲低细胞的小鼠转移负荷显著减轻。肺组织分析显示，YAP/TAZ敲低细胞形成的转移灶数量明显减少，且所形成的转移灶体积更小。这些实验表明，实验性转移检测技术可使研究人员快速、低成本地评估候选基因在转移形成与生长过程中的作用。同时，这些结果也进一步说明，活体动物成像与全肺组织中转移灶的荧光定量分析相结合，有助于研究人员更深入地理解转移性定植过程中的各个步骤。

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方案

本方案涉及小鼠和生物危害性材料的使用，需获得相应机构安全委员会的批准。本文所述所有体内实验均已获得奥尔巴尼医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

注意：有关实验方案概述，请参见图1中的示意图。

1. 包装所有必需的逆转录病毒和慢病毒

注意：本方案采用慢病毒或逆转录病毒载体，以稳定表达荧光素酶和荧光蛋白，并调控候选基因的表达。这些病毒在 HEK-293FT 细胞中进行包装，具体步骤如下所述。

  1. 第1天：在6孔板中接种HEK-293FT细胞，每孔加入2 mL完全培养基（含10%胎牛血清的DMEM，添加1%青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺），使细胞在第2天达到40–60%融合度。于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
  2. 第2天：针对每种待包装的病毒载体，将40–60%融合度的HEK-293FT细胞孔分别转染逆转录病毒或慢病毒载体，以及编码病毒包膜蛋白和包装蛋白的相应辅助载体。
    注：本方案使用VSVG作为包膜蛋白，psPAX2用于慢病毒包装，gag-pol用于逆转录病毒包装（载体列表详见补充表1）。
  3. 为每个孔配制共转染混合物，步骤如下：
    1. 将4 μL转染用脂质溶液（参见材料表）与96 μL转染缓冲液混合，室温孵育5分钟。
    2. 加入1 μg病毒载体、0.5 μg包膜蛋白载体（VSVG）和0.5 μg包装蛋白载体（psPAX2或gag-pol），孵育20分钟。
    3. 将步骤1.3.2中所得共转染混合物轻柔加入第1.1步接种的HEK-293FT细胞孔中，于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
  4. 第3天：吸除各孔中含有转染物的培养基，每孔轻柔加入2 mL完全培养基。于37 °C、5% CO2条件下继续孵育约24小时。
  5. 第4天：使用3 mL注射器收集各孔的病毒上清液，并通过0.45 μm滤器过滤至2 mL微量离心管中。
  6. 可选步骤：如需收集第二批病毒，可向每孔轻柔加入2 mL完全培养基，于37 °C、5% CO2条件下继续孵育约24小时。
  7. 第5天（可选）：参照步骤1.5收集第二轮病毒上清液。
    注：可通过冷冻保存病毒上清液暂停实验流程。

2. 稳定表达荧光素酶和荧光蛋白的癌细胞的制备

注意：以下方案描述了如何首先使用带有独特筛选基因的两种载体，通过萤光素酶（firefly luciferase）和荧光蛋白（ZsGreen）对4T1细胞进行稳定标记。随后进行3rd 病毒载体可用于调控候选基因的表达。然而，同时递送荧光蛋白和进行基因操作的病毒载体也可作为替代方法（如以下代表性实验所示）。其他癌细胞系亦可使用，但步骤2.1和2.7.1中的细胞数量需进行优化。

  1. 将4T1细胞以1.5 × 10⁵接种5 12孔板中每孔接种细胞，加入完全培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM），于37 °C、5% CO₂条件下培养2 过夜。
  2. 按照以下步骤，用第1步中制备的病毒上清液感染4T1细胞。
    1. 吸弃细胞中的培养基，加入500 μL荧光素酶病毒上清液和500 μL荧光蛋白病毒上清液，同时用荧光素酶和荧光蛋白病毒上清液感染细胞。
    2. 加入1 μL 8 mg/mL的六亚甲基溴化铵（见 材料表).
    3. 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞，直至细胞融合度达到75-90%（通常为24-48小时）。
  3. 用500 μL胰蛋白酶消化4T1细胞2-5分钟（细胞应可轻松从孔底脱落）。将所有细胞转移至含4 mL筛选培养基（含适当抗生素的完全生长培养基）的6 cm培养皿中，以终止胰蛋白酶消化作用。同时，在相同的筛选培养基中接种一皿未感染的对照细胞。
    注意：应在实验前通过测试多个剂量来确定合适的抗生素浓度。此外，也可使用荧光激活细胞分选技术替代药物筛选，以富集荧光标记的细胞。
  4. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞2 在筛选培养基中培养，并根据需要进行细胞传代，直至所有未感染的对照细胞死亡（具体时间取决于筛选基因和细胞系）。
  5. 使用倒置荧光显微镜，在50-100倍放大倍数下，采用绿色激发（450-490 nm）/发射（500-550 nm）滤光片组，确认感染的4T1细胞表达ZsGreen荧光蛋白。
  6. 使用市售的荧光素酶活性检测试剂盒，按照以下步骤确认感染的4T1细胞是否表达荧光素酶。
    1. 使用最小体积的1×被动裂解缓冲液裂解表达荧光素酶的4T1细胞以及不表达荧光素酶的对照4T1细胞，轻轻振荡30分钟。
    2. 向96孔白底板中加入20 µL细胞裂解液，然后加入50 µL荧光素酶检测试剂盒中的荧光素酶检测试剂。
    3. 使用酶标仪的发光检测模式，测量细胞在光谱所有波长下的发光信号。
      注意：可通过冻存稳定转导的细胞来暂停该实验方案。
  7. 以下列方式调控候选基因的表达：
    1. 接种 6 × 105 将步骤2.6中标记的4T1细胞接种于60 mm培养皿中，加入4 mL完全培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养2 过夜。
    2. 吸弃每孔中的生长培养基，加入含有4 μL 8 mg/mL聚凝胺（hexadimethrine bromide）的2 mL完全生长培养基。
    3. 将步骤1获得的2 mL病毒上清液加入步骤2.7.2中已铺板的细胞中，于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 过夜。
    4. 用500 μL胰蛋白酶消化4T1细胞2-5分钟（细胞应可轻松从孔底脱落）。将所有细胞转移至含10 mL筛选培养基（含适当抗生素的完全生长培养基）的10 cm培养皿中，以中和胰蛋白酶。同时将部分未感染的对照标记4T1细胞接种于相同的筛选培养基中。
    5. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞2 在筛选培养基中培养，并在必要时传代细胞，直至所有未感染的细胞死亡。
    6. 使用蛋白质印迹等标准方法验证候选基因的表达是否发生改变20 或qPCR21.
    7. 按照步骤2.5–2.6检测发光和荧光信号，以确定对照细胞与敲低细胞中的信号相似程度，因为该值可能发生变化（见讨论部分）。
      注意：可通过冻存稳定转导的细胞来暂停该实验方案。

3. 体内实验设计的优化

  1. 根据所需的转移负荷，优化合适的细胞数量和实验持续时间，步骤如下：
    1. 在完全培养基中扩增步骤 2.6 中的荧光和生物发光 4T1 细胞，以确保在预定注射日有充足的细胞可用。
    2. 按照步骤 4.2 所述方法准备尾静脉注射用细胞。为确定最佳注射细胞数量，将细胞用 1x PBS 重悬为多个不同浓度，每份体积为 100 μL。
      注：建议测试每只小鼠 25,000 至 500,000 个细胞的范围。
    3. 将细胞悬液置于冰上直至注射。
    4. 将步骤 3.1.2 中不同稀释度的 4T1 细胞分别通过侧尾静脉（见步骤 4.3）注射至 3–4 只小鼠体内。
    5. 将小鼠放回笼中，并监测 15 分钟以确保其完全恢复。应每周检查 3 次小鼠是否出现疼痛或痛苦的迹象。
    6. 使用活体动物成像设备，在尾静脉注射后 3–6 周内（取决于细胞系和小鼠品系）监测小鼠转移灶的形成与生长（见步骤 5 和 6）。
      1. 根据本机构的标准操作规程，在尾静脉注射后 3–6 周处死小鼠。
      2. 取出肺组织，并按照步骤 7 所述评估转移灶的大小和数量。
      3. 根据所需转移负荷，选择合适的转移灶生长时间（见讨论部分）。

4. 标记癌细胞的尾静脉注射

注意：步骤 4.2.4 已针对在同源 BALB/c 小鼠中生长的 4T1 细胞进行了优化。如果使用其他癌细胞系和小鼠品系，应首先优化注射的细胞数量以及实验的持续时间。

  1. 在完全培养基中，将第2步构建的4T1细胞系接种于两块15 cm培养皿中进行扩增，以确保注射当天有充足的细胞可用。
  2. 按以下步骤准备用于尾静脉注射的细胞：
    1. 吸除培养基，并用1×PBS冲洗细胞培养皿。
    2. 每块15 cm培养皿加入5 mL胰蛋白酶消化2–5分钟（细胞应可轻松从皿底脱落）。将所有细胞转移至锥形离心管中，再用足量完全培养基冲洗残留细胞以中和胰蛋白酶，并将冲洗液一并加入同一锥形离心管中。
    3. 使用自动细胞计数仪计数，确定总细胞数量。
    4. 以122 × g 离心3分钟，吸除上清液，用1×PBS重悬细胞至所需浓度。此处每只小鼠注射100 μL PBS中的2.5 × 104个细胞，因此应将细胞重悬于2.5 × 105个/mL的浓度。细胞悬液在注射前需置于冰上保存。
      注：从胰蛋白酶消化细胞到完成尾静脉注射的时间应控制在约1小时内。
  3. 通过侧尾静脉将第4.2.5步的4T1细胞注射至小鼠体内，操作如下：
    1. 在动物实验设施的生物安全柜中，轻轻但充分地倒置离心管或使用1 mL注射器反复吹打，确保细胞均匀重悬。每次注射前均需确认细胞已充分重悬。
    2. 用1 mL鲁尔锁式注射器吸取细胞悬液，排出多余气泡。安装一根½英寸、30号针头，针尖斜面朝上，并再次排出残留气泡。
    3. 将小鼠轻柔地放入啮齿类动物固定器中。
    4. 侧尾静脉应清晰可见并已扩张。若未明显扩张，可轻轻夹住尾根部，并将尾巴浸入温水中以促进静脉扩张。
      注：也可通过将小鼠笼置于加热灯下和/或加热垫上来实现静脉扩张。
    5. 使用酒精棉片清洁尾部皮肤。将针头斜面朝上刺入尾静脉，缓慢注入100 μL细胞悬液。
      注：若针头正确进入静脉，应能轻松前后滑动，推动针栓时无明显阻力。成功注射后，静脉的蓝色区域会短暂变白，即出现"冲洗"现象，持续数秒。
  4. 缓慢拔出针头，并用无菌纱布轻压注射部位以止血。
  5. 将小鼠放回笼中，观察15分钟以确保其完全恢复。此后应每周3次检查小鼠是否有疼痛或不适迹象。
  6. 使用活体动物成像系统监测小鼠转移灶的形成与生长，持续3–6周（具体时间取决于细胞系和小鼠品系），详见步骤5和6。

5. 使用活体动物成像设备通过荧光监测转移负荷

注意：动物在发出活性生物发光信号时，不得进行荧光成像。

  1. 如果仅进行生物发光成像，则跳至步骤6。
  2. 打开活体动物活体成像设备。
  3. 根据制造商的说明设置活体动物活体成像麻醉系统，向麻醉室和成像室输送1.5%至2%的异氟烷。
  4. 将步骤4中带有荧光标记转移灶的小鼠置于麻醉室中，通入1.5–2.5%异氟烷进行麻醉。
  5. 打开图像软件（参见 材料表）并登录。
  6. 点击 初始化 按钮并等待机器初始化。
  7. 更换 视野 到 D.
    注意： 视野 如果需要更近距离观察小鼠，也可以使用C，但这会限制可同时成像的小鼠数量。
  8. 一旦软件提示相机已达到适当温度，单击 成像向导 按钮，选择 荧光 然后从下拉菜单中选择合适的滤光片组合。
    注意：如果所使用的荧光染料不在可选范围内，请选择 输入 EX/EM 输入所需的激发波长和发射波长。
  9. 将小鼠放入步骤 3.2.4 中所述的实验舱内。
  10. 点击 获取序列.
  11. 成像完成后，将小鼠放回笼中，并观察15分钟以确保其完全恢复。
  12. 重复步骤5.2以及步骤5.7–5.9，至少使用一只无转移的动物。注意：该动物将用于在分析过程中定量并扣除背景信号（步骤8）。
  13. 实验期间每周成像 2-3 次。

6. 使用活体动物活细胞成像设备通过生物发光监测转移负荷

  1. 开启活体动物活体成像设备，并按以下步骤设置程序。
    1. 打开图像软件（参见材料表）并登录。点击初始化按钮，等待设备完成初始化。将视野（Field of View）更改为D。
      注意：视野 C 可用于更近的视野以完整成像小鼠全身；但此设置会限制一次可成像的小鼠数量。
    2. 首次使用时，按如下方式编辑曝光设置：点击编辑 | 首选项 | 采集 | 自动曝光，将最大曝光时间从默认的 60 秒更改为 300 秒，然后点击确定。
      注意：请勿更改自动曝光选项卡中的其他任何参数。
  2. 根据制造商指南设置麻醉系统，向麻醉室和成像室输送 1.5% 至 2% 的异氟烷。
  3. 在进行步骤 6.4 之前，确保相机已达到适当的工作温度。
  4. 将步骤 4 中含有转移灶的小鼠放入麻醉室，使用 1.5–2.5% 异氟烷进行麻醉。
  5. 按以下步骤准备小鼠进行生物发光成像。
    1. 用 1 mL 注射器吸取 D-荧光素（溶于 D-PBS，浓度为 30 mg/mL），然后在注射器上安装一根 ½ 英寸 30 号针头，并排出气泡。
    2. 测量并记录麻醉后小鼠的质量。
    3. 用拇指和食指捏住小鼠颈背部皮肤以固定小鼠，同时用小指和手掌根部夹住尾巴。将小鼠倒置成 45 度角，头部朝下。
    4. 将针头斜面朝上插入小鼠左侧腹腔（IP）空间。通过回抽少量液体确认针头已进入腹腔；若针头位于腹腔内，回抽时针座处不应出现颜色。
    5. 按 150 mg/kg 剂量注射相应体积的 D-荧光素。
    6. 注射 D-荧光素后立即启动计时器，并将小鼠平躺放置于成像设备中，鼻部置于鼻罩内，确保持续输送 1.5–2.5% 异氟烷。若同时成像多只小鼠，应在每只小鼠之间放置隔板。确保小鼠尽可能平躺（即不向一侧倾斜）。
    7. 点击发光和拍照选项，然后在采集控制面板中点击采集。
  6. 持续采集生物发光图像，直至信号达到峰值，并使用信号最强的图像进行分析。
  7. 成像完成后，将小鼠放回笼中，并监测 15 分钟以确保其完全恢复。
  8. 在整个实验期间，每周成像 2–3 次。

7. 转移灶数量与大小的定量分析

注意：允许转移灶生长的时间长度应针对每种细胞系和小鼠品系进行确定，并会受到注射细胞数量的影响。

  1. 根据标准的机构指南对小鼠实施安乐死。
  2. 分离并取出每只小鼠的肺组织，用1×PBS冲洗以去除多余血液。
  3. 轻柔地将肺组织分离为肺叶。
  4. 使用配备GFP宽波段滤光片（激发光470/40x）的荧光体视显微镜，在10倍明场和荧光条件下获取肺叶中ZsGreen转移灶的图像。
    注意：所有样本应保持相同的放大倍数和亮度。所用放大倍数可根据转移灶的大小、数量、亮度以及显微镜的视野范围进行调整。
  5. 使用图像分析软件对图像中的转移灶数量和大小进行定量分析。
    注意：图像分析的具体步骤取决于所使用的软件，可利用步骤3中的肿瘤样本进行优化。或者，可使用荧光体视显微镜手动计数每片肺组织中的转移灶数量。此步骤完成后可暂停实验流程，步骤8可在所有活体成像数据收集完毕后的任意时间点进行。

8. 体内活体动物成像设备所获取图像的数据处理与分析

  1. 在图像软件中打开每只小鼠的所有图像文件。
    注意：使用生物发光信号最强的图像进行分析
  2. 通过点击图像窗口左上角的箭头，并将其更改为适当的单位，确保生物发光数据的单位为Radiance，荧光数据的单位为Efficiency。
  3. 使用最后一个时间点的图像创建感兴趣区域（ROI），步骤如下：
    1. 在Tool Palette窗口中点击ROI Tools。通过点击箭头并选择1，插入一个ROI。
    2. 点击ROI的边框，并将其移动到小鼠胸部上方。调整ROI的大小，使其覆盖小鼠胸部，且不遗漏信号。
  4. 点击测量ROI，并将原始数值复制或输入到Excel表格中。
    注意：对于生物发光数据，应选择总通量（photons/second），即ROI内所有辐射度的总和。由于转移灶的生长不一定均匀，因此优先使用总通量而非平均辐射度，因为总通量可反映转移负荷的总和。同样，对于荧光数据，应使用总效率%（发射光（photons/second）/激发光（photons/second）），而不是平均效率。
  5. 在图像文件中右键单击，复制步骤8.3中使用的ROI，并将其粘贴到每个图像文件中。
    注意：在定量分析荧光图像时，需对同一只小鼠在无转移状态下成像的相同区域进行定量。将该信号作为背景信号，并从每张含有荧光转移灶的小鼠图像中减去该背景信号。
  6. 将粘贴的ROI移动至每张图像中与步骤8.3.4所选区域相同的位置，并重复步骤8.4。
  7. 按以下方式绘制并分析原始数据（见Supplemental Table 2）：
    1. 使用指定公式（Supplemental Table 2）对每只小鼠的原始数据进行log10转换，并如Figure 2D和Figure 4F所示进行绘图。log10转换可使通常呈几何增长的生长曲线线性化，并减少异方差性。
    2. 使用线性回归法，计算每只小鼠在步骤8.7.1中绘制的log10转换数据拟合直线的斜率（Supplemental Table 2）。参考Supplemental Table 2中的公式，一步完成直线拟合并计算斜率。
    3. 如Figure 2E和Figure 4G所示，绘制斜率的数值。对斜率数据使用Student's t检验或单因素方差分析（当组数大于2时），以确定统计学显著性。

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结果

为了验证上述方法，我们进行了一项概念验证实验，其中在一种转移性小鼠乳腺癌细胞系（4T122）中敲低了一个关键的复制因子RPA3。尽管本方案描述了在基因操作之前用荧光素酶和荧光蛋白对细胞进行标记，但我们采用了一种改良方法，因为RNAi载体本身也递送ZsGreen（图2A）。首先，将4T1细胞通过慢病毒载体稳定转导，该载体编码萤火虫荧光素酶和潮霉素抗性（pHAGE-Luciferase-IRES-Hygro）。经过潮霉素筛选后，进行荧光素酶检测以确认萤火虫荧光素酶的稳定表达（图2A）。随后，将4T1-Luciferase细胞通过逆转录病毒载体稳定转导，这些载体表达ZsGreen以及一种对照miR30型shRNA，或一种先前已被证明可有效靶向小鼠RPA3的miR30型shRNA16,23

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讨论

方法的关键步骤
针对特定的细胞系和小鼠品系，优化注射的细胞数量（步骤3）至关重要，因为这会显著影响所形成转移灶的数量以及实验的持续时间。如果注射的细胞过多，或转移灶生长时间过长，则可能难以准确计数转移灶，从而难以评估基因操作的效果。然而，如果注射的细胞数量过少，则可能形成极少甚至没有转移灶。因此，应先进行预实验，使用不同数量的细胞，以确定最佳的细胞注射数量及转移灶生长的合适时间。为了确保每组内小鼠的转移灶数量具有一致性，必须向每只小鼠注射等量的活细胞。由于细胞在离心管和注射器中可能发生沉降，因此在装填注射器前应轻轻重悬细胞，并且细胞悬液在注射器中放置时间不宜过长（步骤4.3.2）。细胞在悬液中时间越长，活力越低，因此从胰酶消化到完成细胞注射的时间间隔不应超过一小时（步骤4.2.5）。不得注射气泡或大的细胞团块，因为这些可能导致栓塞并致小鼠死亡。此外，通过针头吸取细胞可能造成细胞剪切损伤，因此应在不安装针头的情况下先完成注射器的装填。为确认各小鼠注射的细胞数量相对一致，可在注射后立即进行活体动物成像（图2B

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Emily Norton 在病毒感染实验和文稿审阅方面提供的帮助。我们还感谢 Ryan Kanai 在获取肺组织图像方面给予的支持，以及 Kate E. Tubbesing 在肺部绿色转移灶图像分析方面的协助。感谢动物实验设施工作人员为本视频的制作所提供的支持与帮助。本研究工作得到了 Susan G. Komen 职业催化剂基金的资助，该基金授予 J.M.L.（#CCR17477184）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% SDS-PAGE 凝胶用于蛋白质印迹实验
2.5% 胰蛋白酶Gibco15090-046组织培养用胰蛋白酶
96孔平底白色检测板康宁3922用于检测培养细胞中的荧光素酶和海肾荧光素酶信号
酒精棉片尾静脉注射前对注射部位进行消毒
BALB/C 小鼠（雌性，6 周龄）TaconicBALB-F尾静脉转移定植与负荷检测
BSA常规VWR Ameresco97061-416用于蛋白质印迹实验
细胞裂解缓冲液细胞信号传导用于收集蛋白质样品
Celltreat 滤器，PES 30 mm，0.45 μm μmCelltreat40-229749-CS用于过滤病毒上清液
CO2 和安乐死舱室用于安乐死小鼠
双荧光素酶报告基因检测试剂盒PromegaE1960用于检测培养细胞中的荧光素酶和海肾荧光素酶信号
杜尔贝科&磷酸盐缓冲液HimediaTS1006用于 PBS
EDTAVWR97061-406用于稀释组织培养用胰蛋白酶
FBS 100% 美国来源VWR97068-085完全培养基的组分
富士胶片 LAS-3000 凝胶成像系统富士胶片用于蛋白质印迹实验
GAPDH(14C10) 兔单克隆抗体细胞信号传导2118用于蛋白质印迹实验
山羊抗兔IgG（H+L）二抗，HRP标记赛默飞世尔科技31460用于蛋白质印迹实验
人胚胎肾细胞，HEK-293FTInvitrogenR70007用于病毒包装的细胞系
HyClone DMEM/高糖GE Healthcare生命科学SH30243.01完全培养基的组分
潮霉素B，超纯级VWR Ameresco97064-810用于感染细胞的抗生素筛选
I3-P/i3 多模式微孔板/EA分子装置用于检测培养细胞中的荧光素酶和海肾荧光素酶信号
ImageJ用于肺转移灶图像分析：阈值设为25 &和 100
免疫印迹PVDF膜伯乐（Bio-Rad）1620177用于蛋白质印迹实验
异氟烷用于小鼠麻醉
IVIS Lumina XRMS 活体成像系统（活体动物活体成像装置）PerkinElmerCLS136340用于体内成像检测转移负荷
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G（GFP 和明场滤光片）徕卡显微系统用于肺部转移灶成像、计数及拍照的显微镜与相机；10倍放大，3.5秒曝光，1.4增益
L-谷氨酰胺Gibco25030-081完全培养基的组分
Lipofectamine 3000生命技术L3000008YAP/TAZ-TEAD 报告基因转染
Living Image 3.2（图像软件程序）PerkinElmerIVIS 软件
小鼠乳腺癌细胞，4T1卡曼诺斯癌症研究所Aslakson, CJ 等，1992小鼠转移性乳腺癌细胞系
Multi-Gauge 版本 3.0富士胶片用于定量 Western 印迹条带强度的软件
Opti-MEM（转染缓冲液）Gibco31985-062用于病毒包装和转染
青霉素-链霉素Gibco15140-122完全培养基的组分
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒赛默飞世尔科技23225用于定量蛋白质浓度
Pierce 磷酸酶抑制剂迷你片剂赛默飞世尔科技A32957加入细胞裂解缓冲液
Pierce 蛋白酶抑制剂迷你片剂赛默飞世尔科技A32953加入细胞裂解缓冲液
Polybrene（六亚甲基溴化铵）Sigma-Aldrich45-H9268用于感染
嘌呤霉素Sigma-Aldrich45-P7255用于感染细胞的抗生素筛选
啮齿类动物固定器用于小鼠尾静脉注射时的固定
SDS-PAGE电泳缓冲液用于蛋白质印迹实验
TAZ (V3886) 抗体细胞信号传导4883用于蛋白质印迹实验
TBST缓冲液用于蛋白质印迹实验
TC20 自动细胞计数仪伯乐（Bio-Rad）用于细胞计数
载体参见表1以获取载体的完整列表
VWR 倒置荧光显微镜VWR89404-464用于观察ZSGreen标记细胞中的荧光
Western 转印缓冲液用于蛋白质印迹实验
XenoLight D-荧光素钾盐PerkinElmer122799用于活体生物发光IVIS成像的小鼠底物注射
X-tremeGENE 9 DNA转染试剂（用于转染的脂质溶液）罗氏6365787001用于病毒包装
YAP (D8H1X) XP 兔单克隆抗体细胞信号传导14074用于蛋白质印迹实验

参考文献

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