金属浸出在固定金属亲和力色谱中的定量

摘要

我们提出了一种检测方法，用于对使用固定金属亲和色谱法制备的样品引入的金属进行易定量。该方法使用羟基纳普霍尔蓝色作为色度金属指示器，使用 UV-Vis 分光光度计作为探测器。

摘要

酶与从固定金属亲和色谱谱（IMAC）柱中浸出的金属的污染是酶学家的主要关切，因为IMAC树脂中使用的许多常见的二价和三价阳离子对酶有抑制作用。然而，金属浸出的程度以及各种浸出和还原试剂的影响，在很大程度上，由于缺乏使用通常可用的设备的简单和实用的过渡金属定量协议，人们不太了解生物化学实验室。为了解决这个问题，我们开发了一种协议，以快速量化使用IMAC作为净化步骤制备的样品中的金属污染量。该方法使用羟基纳普霍尔蓝色（HNB）作为样品溶液中金属阳离子含量的色度指标，而UV-Vis光谱法则根据647nm的HNB光谱变化，量化纳米摩尔范围内的金属含量。虽然溶液中的金属含量历来是使用原子吸收光谱或电感耦合等离子体技术确定的，但这些方法需要在典型的生物化学实验室范围之外进行专门的设备和培训。这里提出的方法为生物化学家提供了一种简单快捷的方法，即使用现有设备和知识在不牺牲准确性的情况下确定样品的金属含量。

引言

自Porath和同事¹创立以来，固定金属亲和色谱（IMAC）已成为一种选择方法，根据蛋白质与过渡金属离子（如Zn^{2+、Ni 2+、Cu2+}和Co^2+）粘结的能力，快速分离蛋白质。这是最常见的通过工程多异氨酸标记完成，现在是最常见的色谱纯化技术之一，用于分离重组蛋白^2。IMAC还发现了除重组蛋白纯化以外的应用，作为分离奎诺酮、四环素、氨基糖苷、大纤维和β-乳糖的一种用途，用于食品样品分析^3，并作为识别肝癌和胰腺癌的血清蛋白标记物的一个步骤^。毫不奇怪，IMAC也成为分离一些本地生物能量酶^{6，7，8，9，10}的首选方法。然而，这些纯化方法的成功实施，研究酶活性生物能量蛋白取决于是否存在从柱基质渗入渗出至渗出的可忽略的金属阳离子水平。IMAC中常用的二价金属阳离子具有已知的....

方案

1. 测试组件制备

1. 确定使用 280 nm 的光学吸收度或蛋白质定量的替代方法测定要测定的色谱分数，以确定蛋白质富集度分数。
   注:为了这项工作，我们使用了二极管阵列UV-Vis分光光度计。为了增加吞吐量，可以使用能够测量 UV-Vis 吸光度的板式读取器。
2. 制备必要的测定组件
   1. 在 pH 值介于 7 和 12 之间准备或获取 10-100 mM 缓冲液（"样品缓冲器"）。
      注:在中性或基本pHH下，常见的生化缓冲液，如Tris、HEPES、MOPS和磷酸盐，均可接受测定。三丁和分氨酸可以使用，但需要校准曲线，因为它们都实质上会促进金属离子的利用。图^例20中显示了对分氨酸的校准示例。
   2. 在样品缓冲液中使用120毫克HNB试剂制备12%无（20倍浓缩）的羟基苯甲酸蓝（HNB）分散液溶液。"
      注意:HNB暴露在眼睛上会造成严重的损伤和刺激。处理 HNB 时应使用护目，处理后应彻底清洗双手。
      注:海航主要科学试剂供应商在KCl上作为分散剂出售。因此，溶液中的实际浓度因不同制造商、批次和瓶中HNB分散剂的采用程度而异。理想情况下，在 647 nm 时，在 647 nm 处的吸光度应在库存稀释 20 倍之间。

2. 样品制备和测量

1. 准备用于数据收集的分光光度计
   1. 打开并预热....

结果

图2显示了在中性pH（黑线）处的自由HNB光谱和从MS1E3D1²⁹分离中测定为^Ni2+的代表性分数谱。与HNB控制相比，成功的测定系列应表明647nm的吸收率降低，这与在过渡金属存在的情况下形成HNB复合物相对应。在 647 nm 处的吸收率增加将表明测定失败。或者，从 647 nm 的初始吸光度降低 90% 以上，表明金属含量过高，需要测定更多稀释分数。自由 HNB 控制没有吸光性变化的测定不一定表示故障。样品可能基本上不含浸出金属。然而，这是不可能的，任何显示没有吸光性变化的样品都应该准备并再次测量，最好用较少的稀释剂来确认结果。总共，大多数未能观察到预期的吸收率变化的原因可能是样品制备过程中的移液不当、测量前的孵育时间不足或pH值超出建议的7-12范围。

为了证明这种测定的应用， 我们分析了2个His-标签膜支架蛋白MSP1E3D1（孤立如杰尼索夫，I.G.等人29），MSP2N2（隔离在格林科娃，Y.V.30），和

讨论

使用 HNB 对金属进行彩色检测提供了一种简单的方法来量化 IMAC 树脂中过渡金属离子对蛋白质污染程度。正如我们在参考文献20中所确立的，Ni²⁺与HNB结合，具有1:1的测结和与pH值一起变化的Ni-HNB复杂变化的解散常数。但是，对于所有建议的 （7-12） pH 值，复合 K_d处于子 nM 范围内。实际上，这意味着只要不存在像EDTA这样的其他强合合试剂，任何测试分数中的所有Ni²⁺都将与HNB结合。所有这些特性一起产生了线性Ni²⁺滴定曲线，我们对此进行了实验观察。在^该报告20中，我们还确定，由于金属染料复合地层引起的光谱变化在整个7-12pH范围内将是相同的。检测受到与 2.7-27 nM Ni²⁺对应的最小可靠吸收变化测量值（10^-4 + 10^-3 OD，取决于使用的分光光度计）的限制。上限受海因公司存在的数量限制。在我们的工作中，我们使用 ±15 μM，对应于 647 nm 时 ±0.6 的 OD。但是，如果需要，这可以增.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2xYT 肉汤	Fisher Scientific	BP9743-500	用于大肠杆菌生长的培养基
HEPES、游离酸	BioBasic	HB0264	替代缓冲液
HisPur Ni-NTA 树脂	Thermo Scientific	88222
羟基萘酚蓝二藻盐	Sigma-Aldrich	219916-5g
咪唑	Fisher Scientific	O3196-500
咪唑	BioBasic	IB0277
MOPS，游离酸	BioBasic	MB0360	替代缓冲液
氯化钠	Fisher Scientific	S271-500
磷酸钠	Fisher Scientific	S369-500	替代缓冲液
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris 碱	费舍尔科学	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500