应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统

摘要

细菌细胞成像是一种新兴的系统生物学方法，旨在解析调控大型大分子机器功能的静态与动态过程。本文通过整合定量活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术，用于研究Legionella pneumophila IV型分泌系统的结构与功能。

摘要

Legionella pneumophila 的 Dot/Icm 分泌系统是一种复杂的 IV 型分泌系统（T4SS）纳米机器，定位于细菌极区，介导蛋白质和 DNA 底物向靶细胞的递送，该过程通常需要直接的细胞间接触。我们最近通过冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）解析了 Dot/Icm 装置的结构，发现其形成一个跨越细胞包膜的通道，并与一个细胞质复合物相连。结合两种能够保持样品天然结构的互补方法——活细胞荧光显微镜和 cryo-ET，可在原位可视化观察蛋白质，并整合各机器组分相对于其他 Dot/Icm 亚基的化学计量比及其表达时序。为了研究极区定位的需求以及表征与 T4SS 机器生物发生相关的动态特征，我们将编码超折叠绿色荧光蛋白的基因在其染色体上的天然位置与 Dot/Icm ATP 酶基因进行融合。以下方法整合了对活细胞的定量荧光显微镜分析和 cryo-ET 技术，用于在完整细菌细胞中定量分析这些蛋白质的极区定位、动态行为及结构特征。将这些方法应用于研究 Legionella pneumophila 的 T4SS，有助于表征 Dot/Icm 系统的功能，并可推广用于研究多种利用 T4SS 或其他类型细菌分泌复合物的细菌病原体。

引言

Legionella pneumophila（L. pneumophila）是军团菌病的致病因子，存在于淡水储库中，在自然环境中通过感染并复制于自由游动的水生原生动物体内进行增殖。L. pneumophila 可通过饮用水源产生含菌气溶胶，经人体吸入后引发疾病暴发。在感染细胞内，L. pneumophila 通过干扰宿主细胞通路，延缓其所处液泡的内吞体成熟过程，并促进形成一种支持细菌复制的特殊细胞区室。该过程由一种称为 Dot/Icm 的细菌特异性 IVB 型分泌系统（T4BSS）及其在感染期间转运至宿主细胞质的 300 多种"效应子"蛋白共同驱动，以调控宿主细胞功能^1,2,3,4,5。缺乏功能性 Dot/Icm 装置的突变株无法将效应子递送至宿主细胞质，不能在细胞内有效复制，并在疾病动物模型中表现为无毒力^6,7。

许多细菌物种已进化出极为复杂且动态的....

方案

注意：所有涉及嗜肺军团菌（L. pneumophila）的培养、操作和成像步骤，均应在符合当地规范的生物安全二级实验室中进行。

1. 使用等位基因交换和双重筛选策略将 sfGFP 插入 L. pneumophila 染色体（图 2，图 3）

1. 克隆至基因替换载体 pSR47S 中¹¹ 以下序列：目标位点上游1,000 bp，随后为sfGFP序列，随后为目标位点下游1,000 bp（图2）。sfGFP序列应通过含有4到8个氨基酸的连接子与目标蛋白的N端或C端保持阅读框一致。将构建好的载体转化至 E. coli DH5αλpir。随后划线 L. pneumophila 在活性炭-酵母提取物（CYE）琼脂上寻找单菌落（受体）¹² 含100 µg/mL链霉素，于37 °C培养5天（图3).
2. 划线 L. pneumophila 在CYE-agar-链霉素培养基上划线，37 °C培养2天（浓密接种）

结果

通过双筛选两步法同源重组构建了sfGFP的定点插入。第一步采用三亲本杂交，其中pRK600接合质粒（一种IncP质粒）来自 E. coli 辅助菌株MT616被转移到供体菌中 E. coli 含有sfGFP基因的自杀型载体pSR47S菌株，该基因两侧为两段同源区域、转移起始位点oriT以及 枯草芽孢杆菌 反向筛选基因 sacB接下来，利用pRK600的接合系统将pSR47S衍生物转移至 L. pneumophila (Lp01, 图2A). 通过单次交叉事件成功整合pSR47S的克隆因含有卡那霉素抗性基因Kan而被筛选出来^R 并进行传代以允许发生第二次交换。丢失了该基因的克隆 sacB 第二次交换过程中，通过将细胞铺板于反向筛选剂蔗糖上筛选出目标基因图2, 图3）。使用抗GFP抗体.......

讨论

阐明细菌分泌系统的功能对于全面理解宿主与病原体之间的相互作用至关重要。分泌系统是一种复杂的分子机器，能够将效应蛋白注入宿主细胞内，某些情况下还能促进形成支持细菌复制的亚细胞微环境。上述方法为研究呼吸系统细菌病原体Legionella pneumophila的Dot/Icm分泌系统提供了重要的新工具，揭示了效应蛋白转运机制的关键线索，而该机制对其致病性至关重要。通过结合活体细菌细胞成像与结构研究，该方法可推广应用于其他分泌系统，以在分子水平上解析其功能。这可以通过利用延时视频显微镜研究荧光标记的分泌系统组分在时空上的动态行为来实现。

我们构建了洁净且无标记的突变体，其中基因被一个修饰后的等位基因标记或替换，这是从分子水平理解致病机制以及定义可能促进药物疗法开发的结构-功能关系的基本方法^24,25。通过基因改造使L. pneumophila中单个Dot和Icm蛋白缺失的菌株，可用于通过冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）解析Dot/.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 nm 胶体金颗粒	Aurion	25486
100x Plan Apo 物镜（1.4 NA）	Nikon
ACES	Sigma-Aldrich	A9758
活性炭	Sigma-Aldrich	C5510
Agaroze GPG/LMP，低熔点	American bioanalytical	AB00981
Bacto 脱水琼脂	BD	214010
CoolSNAP EZ 20 MHz 数字黑白相机	Photometrics
Gene Frame，1.7×2.8 cm，125 µL	Fisher Scientific	AB-0578
带孔碳支持膜 R 2/1 Cu 200 目	Quantifoil	Q225-CR1
硝酸铁九水合物	Sigma-Aldrich	216828
用于冷冻电镜的 K2 Summit 相机	GATAN
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C7352
显微镜盖玻片 22×22 mm	Fisher Scientific	12-542B
显微镜盖玻片 24×50 mm	Fisher Scientific	12-545K
显微镜载玻片 25×75×1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Intelligent Imaging Innovations
Spectra X 光源系统	Lumencor
Taq 2X Master Mix	New England BioLabs	M0270
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific
酵母提取物	BD	212750