应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统

摘要

细菌细胞成像是一种新兴的系统生物学方法，旨在解析调控大型大分子机器功能的静态与动态过程。本文通过整合定量活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术，用于研究Legionella pneumophila IV型分泌系统的结构与功能。

摘要

Legionella pneumophila 的 Dot/Icm 分泌系统是一种复杂的 IV 型分泌系统（T4SS）纳米机器，定位于细菌极区，介导蛋白质和 DNA 底物向靶细胞的递送，该过程通常需要直接的细胞间接触。我们最近通过冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）解析了 Dot/Icm 装置的结构，发现其形成一个跨越细胞包膜的通道，并与一个细胞质复合物相连。结合两种能够保持样品天然结构的互补方法——活细胞荧光显微镜和 cryo-ET，可在原位可视化观察蛋白质，并整合各机器组分相对于其他 Dot/Icm 亚基的化学计量比及其表达时序。为了研究极区定位的需求以及表征与 T4SS 机器生物发生相关的动态特征，我们将编码超折叠绿色荧光蛋白的基因在其染色体上的天然位置与 Dot/Icm ATP 酶基因进行融合。以下方法整合了对活细胞的定量荧光显微镜分析和 cryo-ET 技术，用于在完整细菌细胞中定量分析这些蛋白质的极区定位、动态行为及结构特征。将这些方法应用于研究 Legionella pneumophila 的 T4SS，有助于表征 Dot/Icm 系统的功能，并可推广用于研究多种利用 T4SS 或其他类型细菌分泌复合物的细菌病原体。

引言

Legionella pneumophila（L. pneumophila）是军团菌病的致病因子，存在于淡水储库中，在自然环境中通过感染并复制于自由游动的水生原生动物体内进行增殖。L. pneumophila 可通过饮用水源产生含菌气溶胶，经人体吸入后引发疾病暴发。在感染细胞内，L. pneumophila 通过干扰宿主细胞通路，延缓其所处液泡的内吞体成熟过程，并促进形成一种支持细菌复制的特殊细胞区室。该过程由一种称为 Dot/Icm 的细菌特异性 IVB 型分泌系统（T4BSS）及其在感染期间转运至宿主细胞质的 300 多种"效应子"蛋白共同驱动，以调控宿主细胞功能^1,2,3,4,5。缺乏功能性 Dot/Icm 装置的突变株无法将效应子递送至宿主细胞质，不能在细胞内有效复制，并在疾病动物模型中表现为无毒力^6,7。

许多细菌物种已进化出极为复杂且动态的多组分机器，这些机器是感染过程所必需的。其他IV型细菌分泌系统（T4BSS），如Dot/Icm系统，对于诸如Coxiella burnetii和Rickettsiella grylli等细菌病原体的胞内复制也至关重要。尽管T4BSS在进化上与介导DNA转移并可递送有限种类效应蛋白的原型IV型A系统（type IVA systems）相关，但Dot/Icm系统的机器组分数量几乎是其两倍，并能够递送多种多样的效应蛋白。推测这种组分数量的增加使Dot/Icm装置能够更轻松地容纳和整合新的效应蛋白^8,9。

我们最近利用冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）原位解析了 Dot/Icm 装置的结构，发现其形成一个跨越细胞包膜的通道，并与一个胞质复合物相连。进一步分析表明，胞质 ATP 酶 DotB 通过与胞质 ATP 酶 DotO 相互作用，定位于 L. pneumophila 细胞极性部位的 Dot/Icm 系统。我们发现，在大多数细菌细胞中，DotB 表现出胞质内的运动性，表明该 ATP 酶不仅存在于动态的胞质群体中，还能与极性部位的 Dot/Icm 复合物结合。此外，DotO 形成由 DotO 二聚体组成的六聚体结构，并与内膜复合物相关联，而一个 DotB 六聚体则连接到该胞质复合物的基部。DotB-DotO 能量复合物的组装形成了一个胞质通道，引导底物通过 IV 型分泌系统（T4SS）进行转运（图 1）¹⁰。

尽管近期取得了一些进展，但关于 Dot/Icm 系统如何发挥作用，以及各个蛋白质如何组装形成有活性的装置，目前仍知之甚少⁸。揭示 Dot/Icm IV 型分泌系统（T4SS）的调控回路，对于理解宿主-病原体相互作用的分子机制至关重要。因此，我们将讨论如何利用活细胞显微镜和冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET），检测并表征被超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）标记的嗜肺军团菌（L. pneumophila）Dot/Icm 系统中的关键组分。通过定量荧光显微镜，将在野生型背景或 IV 型分泌系统缺失的背景下，明确 DotB 的极性定位。此外，将利用延时显微镜定量分析 Dot/Icm 胞质 ATP 酶之间在定位和动态行为上的差异。

联合应用活体成像和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）这两种互补的方法，相较于其他体外系统具有优势。这两种方法均在完整细胞中进行，能够保持T4BSS的天然环境，从而在样品制备过程中最大限度地减少对天然结构的破坏。由于蛋白过表达可能破坏分泌装置的化学计量比，因此通过等位基因交换将sfGFP融合蛋白回插至Legionella染色体中，使每个融合蛋白以单拷贝形式存在，并由内源启动子驱动表达。对染色体编码融合蛋白的可视化，可实现对特定时间点蛋白表达水平的精确定量。冷冻电子断层扫描（cryo-ET）在解析分泌系统结构方面也具有诸多优势。其中最显著的优势在于，cryo-ET样品由冷冻的完整细胞组成，能够在细菌细胞结构背景下保存天然复合物。因此，与生化纯化方法相比，cryo-ET可能更具优势，因为后者会提取膜复合物，可能导致外周蛋白从核心装置上脱落或改变整体结构。此外，使用sfGFP等大分子蛋白对目标蛋白进行标记后，所增加的质量可被cryo-ET检测到，有助于将Dot/Icm装置的不同亚复合物定位到cryo-ET获得的结构上。

该方法是揭示在细菌细胞膜中组装的多分子复合物结构信息的有力工具。利用这些技术解析出的结构将有助于领域内研究人员理解T4BSS组分的功能机制、为何需要如此多的组分才能实现功能、各组分在更大复合物中的相互作用方式，以及这些亚复合物所执行的具体功能。

方案

注意：所有涉及嗜肺军团菌（L. pneumophila）的培养、操作和成像步骤，均应在符合当地规范的生物安全二级实验室中进行。

1. 使用等位基因交换和双重筛选策略将 sfGFP 插入 L. pneumophila 染色体（图 2，图 3）

1. 克隆至基因替换载体 pSR47S 中¹¹ 以下序列：目标位点上游1,000 bp，随后为sfGFP序列，随后为目标位点下游1,000 bp（图2）。sfGFP序列应通过含有4到8个氨基酸的连接子与目标蛋白的N端或C端保持阅读框一致。将构建好的载体转化至 E. coli DH5αλpir。随后划线 L. pneumophila 在活性炭-酵母提取物（CYE）琼脂上寻找单菌落（受体）¹² 含100 µg/mL链霉素，于37 °C培养5天（图3).
2. 划线 L. pneumophila 在CYE-agar-链霉素培养基上划线，37 °C培养2天（浓密接种）¹⁰划线接种 E. coli 携带 pRK600 辅助质粒的 DH5α（辅助菌）¹³ 在含有 25 µg/mL 氯霉素的 LB 琼脂平板上划线。 E. coli DH5αλpir（供体）接种于含 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板。
3. 进行三亲交配：将一菌落辅助菌、一菌落供体菌和受体菌混合，分别在无选择压力的CYE琼脂平板上共培养，于37 °C孵育4–8小时。作为阴性对照，将辅助菌与受体菌混合物、供体菌与受体菌混合物在相同条件下孵育相同时间。
4. 将交配反应物重悬于 500 µL 的 ddH₂O 中₂O. 在含有100 µg/mL链霉素和10 µg/mL卡那霉素的CYE琼脂平板上分别点样20 µL和50 µL的反应产物，于37 °C培养5天。将获得的4个克隆在含有100 µg/mL链霉素的CYE琼脂平板上划线，于37 °C培养5天。
5. 在含有5%蔗糖和100 µg/mL链霉素的CYE琼脂平板上划线接种16个克隆，于37 °C培养5天。随后，将其中32个克隆分别划线接种于含有100 µg/mL链霉素的CYE琼脂平板以及含有100 µg/mL链霉素和10 µg/mL卡那霉素的CYE琼脂平板，于37 °C培养5天。

2. 将 sfGFP 整合到 L. pneumophila 染色体中的克隆的分离

1. 将对卡那霉素敏感的克隆在 CYE-琼脂-链霉素平板上划线培养，并通过菌落 PCR 确认 sfGFP 插入染色体。使用与 sfGFP 基因及目标染色体区域互补的引物，扩增插入位点的连接区域。
   1. 取 0.5 µL 的 10 µM 引物溶液各一种，并加入一个菌落，加水至终体积为 12.5 µL，于 95 °C 变性 10 分钟。冰上冷却 10 分钟后，加入 12.5 µL 的 2x PCR 预混液，进行 PCR 分析。
2. 将分离的菌落在 CYE-琼脂-链霉素平板上密集划线，于 37 °C 培养 2 天。使用抗 GFP 抗体通过免疫印迹检测 sfGFP 融合蛋白的表达水平和稳定性。

3. 利用荧光标记的 Dot/Icm 组分对L. pneumophila进行活细胞成像

1. 琼脂糖垫的制备
   1. 制备约 30 mL 的 1% 低熔点琼脂糖水溶液。将溶液置于玻璃烧瓶中，微波加热约 90 秒，期间偶尔摇动，直至琼脂糖完全溶解。
   2. 将两片 22 × 22 × 0.15 mm³ 的玻璃盖片叠放在一片 25 × 75 × 1.1 mm³ 玻片的一侧边缘，另一侧边缘同样叠放另外两片 22 × 22 × 0.15 mm³ 的玻璃盖片。
   3. 用移液器吸取约 1 mL 熔融琼脂糖，注入中间玻片上两片上层盖片之间的区域，然后将另一片 25 × 75 × 1.1 mm³ 玻片轻轻覆盖在熔融琼脂糖上。尽量避免产生气泡。将玻片置于 4 °C 冷却 15 分钟。
   4. 使用解剖刀或剃刀刀片，小心地将凝固的琼脂糖垫切割成约 5 × 5 mm² 的小方块。将一个双面粘性固定框（17 × 28 × 0.25 mm³）贴附于一片 25 × 75 × 1.1 mm³ 玻片上，并将多个琼脂糖垫放置于其上。
2. 图像采集
   注意：以下步骤描述适用于由 SlideBook 6.0 控制、配备固态照明光源、CCD 单色相机和 100 倍物镜（数值孔径 1.4）的显微镜系统。如有需要，可使用其他具备适当硬件和软件配置的显微设备，并根据本实验方案的参数进行自定义设置。
   1. 将一坨浓密的 L. pneumophila 菌体悬浮于 1 mL 去离子水（ddH₂O）中，涡旋混匀后取 2–3 µL 稀释液滴加至琼脂糖垫上。将一片 50 × 24 × 0.15 mm³ 的盖玻片轻轻覆盖在粘性固定框上。
   2. 在采集窗口中将中性密度滤光片（ND）设置为 180， binning 设为 2×2，使用 488 nm 激光通道对样品曝光 500–1,000 毫秒。采用相同成像参数对未标记的 L. pneumophila 进行成像，以验证荧光信号的特异性（图 4）。

4. Dot/Icm 组分极性定位与动态的定量分析

注意：以下步骤适用于以 2 x 2 binning 模式采集、每个像素对应 0.129 µm 的图像。

1. sfGFP 融合蛋白极性的定量分析（图 5）
   1. 调整图像对比度，使细菌清晰可见。使用区域工具在极性位置放置一个 0.25 × 1.3 µm² 的矩形，并延伸至细胞质内。该矩形必须精确地位于细菌边界之内。
   2. 标记至少 200 个细菌，并使用区域转为掩膜按钮创建感兴趣区域的掩膜。在掩膜统计和掩膜范围下选择对象。然后在特征和强度下勾选平均强度和方差。
   3. 导出数据，并将每个细菌的极性评分计算为方差与平均强度的比值。
   4. 对于高通量应用，使用相差物镜和适当的聚光镜设置，以获取相差和 488 nm 通道的图像。确保选择细菌完全分离的视野。
   5. 将图像的相差通道对比度调整至细菌清晰可见的水平。打开双通道图像，启动创建分割掩膜窗口，并将通道切换为相差通道。
   6. 设置适当的阈值，并使用定义对象按钮去除小物体。在优化掩膜中选择去除边缘对象，随后将彼此相邻的细菌掩膜分离开。
   7. 按照步骤 4.1.2–4.1.3 中所述方法，计算每个细胞在 488 通道信号中的极性评分。
2. sfGFP 融合蛋白动态行为的定量分析（图 6）
   注意：请按照第 3 节中的说明准备用于图像采集的样品。动态行为定义为随时间变化的强度变化，以下步骤适用于短时间成像（即数分钟）。若需更长时间的成像，请在载片上添加适当的补充成分。
   1. 在图像采集窗口中，勾选时间序列，在间隔框中输入时间间隔，并在时间点数量框中输入2。连续采集表达目标荧光蛋白的L. pneumophila的两幅图像。
   2. 调整图像对比度，直至细胞清晰可见。参照图 6A及以下说明，放置三种不同的掩膜。使用区域工具在至少 400 个细胞的中央放置一个 0.25 × 0.25 µm 的正方形。
   3. 使用区域转为掩膜按钮创建正方形区域的掩膜（掩膜 1）。新建一个空掩膜（掩膜 2），使用像素工具或多边形工具标记至少 25 个随机细胞的整个细胞区域，用于计算荧光漂白。再新建一个空掩膜（掩膜 3），使用大号画笔工具标记细胞之间的区域，用于背景扣除。
   4. 在掩膜统计和掩膜范围下，为掩膜 1 和掩膜 2 选择对象。然后在特征和强度下选择平均强度，并导出这两个掩膜的数据。对于掩膜 3，导出整个掩膜的平均强度。
   5. 使用以下公式计算掩膜 1 中每个对象的荧光强度变化：

其中，掩模1是位于细胞中心的0.25 µm × 0.25 µm的正方形，掩模2覆盖整个细胞，掩模3为细胞间的背景区域，t1为第一个时间点的平均强度，t2为第二个时间点的平均强度。

5. 利用冷冻电子断层扫描技术检测 sfGFP 质量密度

1. 样品制备、数据采集与重构
   1. 在 CYE-琼脂-链霉素平板上于 37 °C 培养表达荧光标记 Dot/Icm 蛋白的 L. pneumophila，培养 48 小时。用 ddH₂O 重悬菌体至 OD₆₀₀ ~0.7。向 20 µL 菌悬液中加入 5 µL 胶体金颗粒（BSA Tracer，10 nm）。
   2. 取 5 μL 菌液混合物滴加至新鲜辉光放电处理的有孔碳支持膜载网（R 2/1，铜网，200 目）上，静置 1 分钟。用滤纸吸去多余液体，随后使用重力驱动的压入装置在液态乙烷中快速冷冻，操作方法如前所述^14,15。
   3. 使用配备场发射枪、能量过滤器、Volta 相位板和直接电子探测器的 300 kV 透射电子显微镜对冷冻水合样品进行成像。在 26,000 倍和 42,000 倍放大倍数下采集单轴倾斜系列图像，对应的样品层面像素尺寸分别为 5.4 Å/像素和 3.4 Å/像素。
   4. 使用电子断层成像软件包 SerialEM 在约 0 μm 离焦量下采集图像堆栈，倾斜角度范围为 -60° 至 +60°，步长为 3°，累积电子剂量约为 ~60 e^-/Å^2,16。使用 MotionCor2 对每组图像堆栈中的剂量分帧电影图像进行运动校正¹⁷。使用 TOMOAUTO 组装经漂移校正的图像堆栈¹⁴。
   5. 通过 IMOD 的标记物依赖性对齐方法对漂移校正后的图像堆栈进行对齐¹⁸。采用 SIRT 方法¹⁹ 重构断层图像，用于分割和直接图像分析，同时采用 WBP 方法²⁰ 进行重构。
2. sfGFP 融合样品的亚断层图平均分析
   1. 使用电子断层图分析软件包 I3（0.9.9.3）进行亚断层图分析^14,21,22。
      注：对齐过程为迭代进行，每次迭代包含三个步骤：生成参考图像和分类掩模、对亚断层图进行对齐与分类，以及对各类平均图像进行相互对齐。
   2. 使用 4 × 4 × 4 降采样后的亚断层图进行初始对齐。合并属于类平均图像且显示对应于 sfGFP 的电子密度的颗粒。在对含有 sfGFP 融合蛋白的颗粒进行分类后，使用 2 × 2 × 2 降采样后的亚断层图对感兴趣区域（如 Dot/Icm 胞质 ATP 酶复合物）进行聚焦对齐，以获得高分辨率结构。

结果

通过双筛选两步法同源重组构建了sfGFP的定点插入。第一步采用三亲本杂交，其中pRK600接合质粒（一种IncP质粒）来自 E. coli 辅助菌株MT616被转移到供体菌中 E. coli 含有sfGFP基因的自杀型载体pSR47S菌株，该基因两侧为两段同源区域、转移起始位点oriT以及 枯草芽孢杆菌 反向筛选基因 sacB接下来，利用pRK600的接合系统将pSR47S衍生物转移至 L. pneumophila (Lp01, 图2A). 通过单次交叉事件成功整合pSR47S的克隆因含有卡那霉素抗性基因Kan而被筛选出来^R 并进行传代以允许发生第二次交换。丢失了该基因的克隆 sacB 第二次交换过程中，通过将细胞铺板于反向筛选剂蔗糖上筛选出目标基因图2, 图3）。使用抗GFP抗体...

讨论

阐明细菌分泌系统的功能对于全面理解宿主与病原体之间的相互作用至关重要。分泌系统是一种复杂的分子机器，能够将效应蛋白注入宿主细胞内，某些情况下还能促进形成支持细菌复制的亚细胞微环境。上述方法为研究呼吸系统细菌病原体Legionella pneumophila的Dot/Icm分泌系统提供了重要的新工具，揭示了效应蛋白转运机制的关键线索，而该机制对其致病性至关重要。通过结合活体细菌细胞成像与结构研究，该方法可推广应用于其他分泌系统，以在分子水平上解析其功能。这可以通过利用延时视频显微镜研究荧光标记的分泌系统组分在时空上的动态行为来实现。

我们构建了洁净且无标记的突变体，其中基因被一个修饰后的等位基因标记或替换，这是从分子水平理解致病机制以及定义可能促进药物疗法开发的结构-功能关系的基本方法^24,25。通过基因改造使L. pneumophila中单个Dot和Icm蛋白缺失的菌株，可用于通过冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）解析Dot/...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 nm 胶体金颗粒	Aurion	25486
100x Plan Apo 物镜（1.4 NA）	Nikon
ACES	Sigma-Aldrich	A9758
活性炭	Sigma-Aldrich	C5510
Agaroze GPG/LMP，低熔点	American bioanalytical	AB00981
Bacto 脱水琼脂	BD	214010
CoolSNAP EZ 20 MHz 数字黑白相机	Photometrics
Gene Frame，1.7×2.8 cm，125 µL	Fisher Scientific	AB-0578
带孔碳支持膜 R 2/1 Cu 200 目	Quantifoil	Q225-CR1
硝酸铁九水合物	Sigma-Aldrich	216828
用于冷冻电镜的 K2 Summit 相机	GATAN
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C7352
显微镜盖玻片 22×22 mm	Fisher Scientific	12-542B
显微镜盖玻片 24×50 mm	Fisher Scientific	12-545K
显微镜载玻片 25×75×1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Intelligent Imaging Innovations
Spectra X 光源系统	Lumencor
Taq 2X Master Mix	New England BioLabs	M0270
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific
酵母提取物	BD	212750