通过经口胃管暴露于四氯化碳（CCl4）在大鼠中诱导急性肝损伤

摘要

本方案描述了一种通过四氯化碳（CCl₄）诱导急性肝损伤（ALI）的常见且可行的方法₄ 通过口服胃管暴露。CCl₄ 暴露通过在肝脏生物转化过程中产生活性氧物种诱导急性肝损伤（ALI）。该方法用于分析ALI的病理生理学机制，并评估不同的肝保护策略。

摘要

急性肝损伤（ALI）在肝功能衰竭的发生发展中起着关键作用，其特征为严重的肝功能障碍，包括肝性脑病和蛋白质合成受损等并发症。合适的动物模型对于研究ALI的机制和病理生理过程，以及探索不同的肝保护策略至关重要。由于四氯化碳（CCl₄）具有进行化学转化的能力，可通过产生活性氧物种在肝脏中广泛用于诱导ALI。CCl₄暴露可通过腹腔注射、吸入或经口胃管给药。本文描述了一种通过口胃管给予CCl₄诱导ALI的啮齿类动物模型。该方法成本低、操作简便，且危险性极小。该模型具有高度可重复性，可广泛用于评估潜在肝保护策略的有效性，并检测肝损伤标志物。

引言

肝脏受到毒性损伤的频率日益增加，尤其是由酒精和药物滥用所致。急性肝损伤（ALI）具有较高的死亡率，已引起临床关注^1,2。毒性损伤可激活肝脏中的细胞死亡信号通路，导致肝细胞发生凋亡、坏死或焦亡。ALI 在肝衰竭的发生发展中起关键作用，肝衰竭的特征是严重的肝功能障碍，包括肝性脑病和蛋白质合成能力受损等并发症^3,4。尽管近期研究加深了我们对伴随肝衰竭发生的生理与病理变化的认识，但尚未完全阐明影响细胞死亡机制的病理分子特征。此外，目前尚无药物可用于逆转 ALI 患者的进行性恶化。当前唯一具有显著疗效的治疗方法是肝移植^5,6。

为了研究急性肝损伤（ALI）的机制和病理生理学，并测试不同的肝保护策略，研究人员采用多种动物模型来诱导ALI。理想的ALI动物模型应通过一种可靠、经过验证、成本低廉且易于操作的方法，模拟疾病的病理过程。实验模型的示例包括肝毒性物质、手术操作（如全肝或部分肝切除）、完全或暂时性去血管化，以及感染性操作^7,8,9。已知的肝毒性物质包括半乳糖胺、对乙酰氨基酚、硫代乙酰胺、偶氮甲烷和CCl₄。其中，尽管CCl₄尚未被充分表征，但其应用最为广泛^10,11,12,13。

CCl₄ 是一种无色有机液体化合物，具有甜味，在较低温度下几乎不燃。暴露于高浓度的 CCl₄ 可对中枢神经系统造成损害，包括肝脏和肾脏功能退化。CCl₄ 通过在肝脏中的生物转化诱导急性肺损伤（ALI），该过程产生活性氧。这一反应由细胞色素 P450 酶 2E1 介导，生成具有活性的代谢产物，并通过大分子结合、增强脂质过氧化以及破坏细胞内钙稳态导致细胞损伤¹⁴。此外，CCl₄ 模型还可用于刺激星形胶质细胞在 RNA 合成水平的活动¹⁵。这种肝毒素已通过腹腔内、门静脉内、口服和胃内途径给药¹⁶。

在本实验方案中，我们详细描述了通过经口胃管给予四氯化碳（CCl₄）在大鼠中诱导急性肝损伤（ALI）的方法。该方法可诱导出显著且可重复的急性肝损伤，适用于ALI发病机制的研究。肝病严重程度的评估通过检测血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶（GPT）、谷草转氨酶 （GOT）活性及总胆红素（TB）水平进行，并结合苏木精-伊红（H&E）染色肝组织的明确组织病理学诊断。通过经胃途径暴露于CCl₄是一种操作简便、成本低廉、微创且风险较低的方法。

方案

实验遵循《赫尔辛基宣言》和《东京宣言》的建议，以及欧洲共同体实验动物使用指南进行。实验经内盖夫本-古里安大学动物护理委员会批准。

注意：CCl₄ 模型已在先前的研究中建立并使用¹⁷。实验方案的时间线见表1。

1. 实验操作前大鼠的准备

注意：选择体重为 300−350 g 的成年雄性 Sprague Dawley 大鼠。

1. 获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）对实验的批准。
2. 将大鼠饲养在室温（22 °C ± 1 °C）条件下，保持12小时光照与12小时黑暗的循环周期。自由供应大鼠饲料和饮水。
3. 所有实验均在上午6:00至中午12:00之间进行。
4. 剃除大鼠毛发，并用酒精对皮肤进行消毒。

2. 血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶和总胆红素基线水平的测定

1. 麻醉
   1. 准备持续异氟烷给药系统以诱导麻醉。确保蒸发器系统已充满异氟烷。
   2. 使用2%异氟烷对大鼠进行麻醉。通过观察其对外部刺激的运动反应和足底反射，确认大鼠已完全麻醉。
      注意：麻醉诱导和维持可使用1−5%异氟烷。
2. 使用22 G导管插入股静脉。
3. 在基线时采集0.5 mL血液样本。确保采集的血量不超过IACUC指南规定的限制。
4. 进行血液生化分析，包括血清GOT、GPT和TB的测定，方法如前所述¹⁸。
   注意：肝酶和TB水平检测在索罗卡医学中心的生化实验室进行。使用化学分析仪通过荧光法对血液样本进行分析（材料表）。

3. 大鼠急性肝损伤的诱导

警告：暴露于高浓度的四氯化碳（CCl₄）中，包括通过蒸气吸入或皮肤吸收，可能对中枢神经系统产生不良影响，并导致肝和肾的退行性病变。长期暴露可引起昏迷或死亡。

1. 通过将四氯化碳（CCl₄）与橄榄油按1:1比例混合，配制50%的CCl₄溶液（材料表）。
   注：该溶液应根据IACUC关于非药用级化合物的指南进行配制。
2. 通过经口胃管给予CCl₄，体内诱导肝毒性。
   1. 将一根16 G的经口胃管（插入深度3英寸）经口腔插入大鼠体内。
   2. 使用注射器将以下稀释液之一注入大鼠胃内，使其暴露于不同剂量的CCl₄：每千克体重1 mL（轻度急性肝损伤，ALI）、每千克体重2.5 mL（中度ALI）或每千克体重5 mL（重度ALI）的50%溶液。对于假手术对照组，仅给予每千克体重5 mL的橄榄油。

4. 24 小时后血清 GOT、GPT 和 TB 水平的测定

1. 麻醉
   1. 准备持续异氟烷给药系统以诱导麻醉。确保蒸发器系统内已充满异氟烷。
   2. 使用2%异氟烷麻醉大鼠。通过观察大鼠对外界刺激的运动反应和足底反射，确认其已完全麻醉。
2. 在四氯化碳（CCl₄）暴露后24小时采集血样。
3. 进行血液生化分析，包括测定血清谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）和总胆红素（TB）。

5. 用于组织学检查的肝脏采集

1. 通过将吸入的气体混合物更换为20% O₂/80% CO₂处死大鼠。确保CO₂按照IACUC指南以预定速率输送。
2. 通过检查无心跳迹象确认死亡，并依据IACUC指南采用第二种方法进行二次确认。
3. 将大鼠置于解剖板上，背侧朝下，腹侧朝上。剃除大鼠腹部的毛发。
4. 使用手术刀从肛门至下颌沿腹中线全长切开皮肤。分离皮肤后，用手术刀从肛门至剑突软骨切开腹壁，暴露腹腔内脏器。
5. 使用剪刀和镊子通过分离韧带和附着组织游离肝脏。从肝门开始，小心进行肝切除，逐一分离所有肝叶的附着结构。解剖并切断所有韧带和血管。
6. 将肝脏转移至培养皿中。用4%缓冲甲醛溶液（材料表）固定肝脏，至少固定24小时。

6. 组织学检查

1. 样品制备
   1. 固定后，使用切片机将样品切成 5 μm 厚的连续切片。
   2. 用软毛刷将切片轻轻放置在载玻片上，每张载玻片放一片。
   3. 按照先前所述方法进行 H&E 染色¹⁹。
2. 使用 20 mm 物镜（材料表）在显微镜下以 200 倍放大倍数观察切片。
   注意：肝脏切片应由对治疗方案不知情的专职病理学家进行评分。评分为 0 表示无肝脏异常，1–2 分表示轻度肝损伤，3–4 分表示中度肝损伤，5–6 分表示重度肝损伤^20,21,22。

结果

ALI 诱导 24 小时后，TB、GOT 和 GPT 水平显著升高（CCl 浓度越高，升高越明显）₄ 剂量）与假手术对照组相比（p < 0.001) (图1）。TB、GOT 和 GPT 在基线时的水平正常，与假手术对照组相比无显著差异。在 24 小时时，所有三个干预组（1 mL/kg CCl₄₄ (1, 1−2), 2.5 mL/kg CCl₄ (3, 3−4) 和 5 mL/kg CCl₄ (4, 4−5.75)，显著高于假手术对照组 (0, 0−0)（p < 0.05，数据以中位数、25−75% 范围表示）。H&假手术对照组的 E 图像（图2A) 以及暴露于不同 CCl₄ 剂量（图2B−D) 显示在 CCl 处理 24 小时后的组织病理学变化₄ 暴露。四氯化碳对肝细胞结构的...

讨论

在本实验方案中，使用四氯化碳（CCl₄）作为肝毒素在大鼠中诱导急性肝损伤（ALI）。急性肝损伤的特征是肝实质细胞的丧失，以及肝脏代谢和合成功能的继发性失调。药物、病毒、毒素、自身免疫性疾病、代谢性疾病和血管性疾病均可导致肝细胞死亡，继而引发的炎症反应参与了急性肝损伤的发病机制。

肝脏的初始损伤会引发细胞因子的产生、趋化因子的释放，进而导致炎性细胞浸润肝脏。急性肝损伤（ALI）评估中常用的三种生物标志物是GPT、GOT和TB水平。GPT和GOT是通过活性水平测定的酶，而TB水平则通过血清浓度来评估肝功能。当血清酶活性升高时，表明肝细胞或胆管上皮细胞受损²³。快速分光光度法最早由Arthur Karmen于1955年报道²⁴，该方法推动了血清酶活性检测在临床中的广泛应用。自此以后，GOT和GPT的检测也被用于识别肝细胞损伤。其中GPT使用更为频繁，同时检测GOT通常会得到重复性结果。根据受损细胞中GOT和GPT释放速率与清除速率之间活性水平的升高情况，可大致估算细胞损伤...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
22 G 导管 BD Neoflon TM	Becton Dickinson Infusion Therapy AB
4% 缓冲甲醛溶液	Sigma - Aldrich 实验室材料技术
BD Microtainer SST TM 管	Becton Dickinson and Company
四氯化碳	Sigma - Aldrich 实验室材料技术	CAS 56-23-5
异氟烷，USP 100%	Piramal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 生化-免疫分析仪	Olympus (MN, USA)		血液样本分析采用荧光法进行
Olympus BX 40 显微镜	Olympus
大鼠喂食针	ORCHID SCIENTIFICS
1 和 2 ml 注射器套装 MEDI -PLUS	山东淄博山川医用器材有限公司