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方法文章

植物病原菌分泌效应子中RNA沉默抑制子的筛选与鉴定

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DOI：

10.3791/60697

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2020年2月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai Key Laboratory of Plant Molecular Sciences, College of Life Sciences, Shanghai Normal University, 2College of Agriculture, Yangtze University, 3Laboratory of Molecular Genetics, China National Tobacco Corporation, Guizhou Institute of Tobacco Science

本文内容

摘要

本文介绍了一种改进的筛选方法，可广泛用于快速筛选植物病原体中的RNA沉默抑制因子。

摘要

RNA沉默是真核生物中一种在进化上保守的、具有序列特异性的基因调控机制。一些植物病原体已进化出能够抑制寄主植物RNA沉默通路的蛋白质。与病毒效应蛋白不同，目前仅有少数细菌、卵菌和真菌病原体分泌的效应蛋白被证实具有抑制RNA沉默的能力，且大多数效应蛋白的分子功能仍不清楚。本文详细描述了一种经过轻微改进的共浸润实验方法，该方法可作为观察RNA沉默现象以及鉴定植物病原体分泌效应蛋白的通用手段。该方法的关键步骤包括：选择健康且充分展开的叶片，将细菌培养物调整至600 nm处的适当光密度（OD），并在浸润后的叶片上于最佳时间点观察绿色荧光蛋白（GFP）荧光，以避免遗漏具有较弱抑制活性的效应蛋白。这一优化后的实验方案将有助于快速、准确且广泛地筛选RNA沉默抑制因子，并为深入研究这些蛋白的分子功能提供一个优良的起点。

引言

在过去的二十年中，对引起植物病害的微生物进行基因组测序的速度不断加快，导致基因序列信息与编码蛋白的生物学功能之间的知识差距日益扩大1。测序项目揭示出的一类分子是效应分子，这类分子可抑制植物的先天免疫并促进病原菌在宿主中的定殖；这些因子由具有破坏性的植物病原体（包括细菌、线虫和丝状微生物）分泌。为应对这些威胁，宿主植物进化出了能够识别这些效应分子的新型受体，从而恢复免疫反应。因此，效应分子受到多种选择压力，导致不同病原体谱系间的效应分子库发生多样化2。近年来研究表明，来自植物病原体的候选效应分子可通过干扰宿主细胞的多种生理过程，以多种方式促进微生物的侵染，包括破坏信号通路、转录调控、细胞内运输、细胞骨架稳定性、囊泡运输以及RNA沉默等过程3,4,5。然而，大多数病原体效应分子，尤其是来自丝状病原体的效应分子，其功能仍不明确。

RNA沉默是一种在真核生物中保守的、基于序列同源性的基因失活机制。该过程由长双链RNA（dsRNA）触发，以序列特异性方式靶向同源的单链RNA（ssRNA），并调控多种生物学过程，包括抗病毒防御6。为了克服宿主的天然免疫反应，一些病毒进化出抵消RNA沉默的能力，例如在细胞内区室中复制或逃避被沉默机制识别的信号。然而，病毒保护其基因组免受RNA沉默导致基因功能丧失的最普遍策略是编码能够抑制RNA沉默的特异性蛋白7,8。目前已建立多种机制不同的方法用于筛选和鉴定病毒RNA沉默抑制因子（VSRs），包括农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）共浸润、表达候选抑制因子的转基因植物、嫁接实验以及细胞培养等方法9,10,11,12,13。

每种检测方法都有其优缺点，并以各自独特的方式鉴定病毒抑制因子（VSRs）。其中最常用的方法之一是基于单个样本的共浸润实验 A. tmuefaciens 含有潜在病毒蛋白和报告基因（通常为绿色荧光蛋白 [GFP]）的培养物 Nicotiana benthamiana 16c 植物组成型表达 GFP 在花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下。在缺乏活性病毒沉默抑制因子的情况下，GFP被宿主细胞识别为外源物质，并在侵染后3天内（dpi）被沉默。相比之下，如果病毒蛋白具有抑制活性，则GFP的表达水平在侵染后3至9天仍保持稳定。9该共浸润实验操作简便、快速，但其稳定性和灵敏度均不高。尽管如此，该实验已成功鉴定出多种RNA病毒中具有不同蛋白质序列和结构的病毒抑制子（VSRs）。7,8.

最近，已从细菌、卵菌和真菌植物病原体中鉴定出多种能够抑制细胞RNA沉默活性的效应蛋白14,15,16。这些发现表明，抑制RNA沉默是大多数生物界病原体促进侵染的普遍策略。理论上，许多甚至所有效应蛋白都可能编码RNA沉默抑制子（RSSs）；然而迄今为止，仅发现少数几种，主要原因是缺乏可靠且通用的筛选策略。此外，绝大多数植物病原体中的RNA沉默抑制子尚未得到研究17。

本报告中，我们提出了一种经过优化且具有普适性的实验方案，用于通过农杆菌浸润实验鉴定能够抑制局部和系统性RNA沉默的植物病原菌效应子。本研究的主要目标是强调该方案的关键要点，并详细描述各个操作步骤，从而提供一种适用于几乎所有植物病原菌效应子的筛选方法。

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方案

注意：该实验步骤的所有操作均应在室温（RT）下进行。

警告：将含有致病微生物的所有培养基，以及实验中使用过的植物和植物组织，均需放入适当的废弃物容器中，并在丢弃前进行高压灭菌处理。

1. 含假定效应因子的质粒构建物的制备

  1. 根据RNA测序（RNA-Seq）结果，并结合定量实时PCR（qRT-PCR）技术，筛选在感染过程中高表达的候选分泌效应子。
  2. 使用SignalP18等软件工具确定每个效应子的信号肽切割位点。
  3. 设计引物，利用高保真DNA聚合酶通过PCR扩增目标效应子基因。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，随后使用无缝克隆试剂盒（材料表）将扩增产物克隆至Gateway入门载体pQBV3中，再通过LR重组反应19转入目的表达载体pEG100。
  4. 将3−5 µL的LR反应混合物转化至100 µL的感受态E. coli细胞（如TOP10、DH5α）中，将转化后的细菌涂布于添加50 µg/mL卡那霉素的Luria-Bertani（LB）琼脂培养基上，于37 °C培养16−20 h。
    注：阳性转化子可通过菌落PCR20鉴定，并进一步通过质粒小提和测序分析确认。
  5. 将50−100 ng携带效应子蛋白的重组质粒加入100 µL化学感受态A. tumefaciens细胞（如GV3101或C58C1）中，轻轻混匀后在液氮中冷冻1分钟，随后在37 °C水浴中解冻5分钟。
  6. 加入500 µL LB液体培养基，于30 °C轻度振荡培养4−6 h，然后将全部农杆菌细胞转移并涂布于添加50 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL利福平的LB琼脂培养基上，于30 °C培养2天。
    注：阳性克隆可通过菌落PCR验证。
  7. 除非另有说明，使用单个转化菌落进行农杆菌浸润实验。
    注：在本研究中，所有测试的效应子基因均不含预测的内含子；每个基因均直接从Phytophthora sojae分离株的基因组DNA中扩增获得。推荐使用无任何标签的Gateway植物表达载体，但并非必需。

2. 准备N. benthamiana 16c 植物

  1. 准备混合育苗土，其组成为（按体积计）50% 泥炭藓、30% 珍珠岩和 20% 蛭石，并在 120 °C 下高压灭菌 20 分钟。
  2. 用植物营养液（1 g/L）浸泡灭菌后的育苗土，分装至较小的育苗盆中（80 mm × 80 mm × 75 mm），并将育苗盆置于较大的托盘内（540 mm × 285 mm × 60 mm）。
  3. 在每个育苗盆的土壤表面播种一至两粒 N. benthamiana 16c 种子。用塑料罩盖住托盘，促进种子萌发。
  4. 将托盘置于光照与温度可控的生长室中，培养条件为：温度 23−25 °C，相对湿度 50−60%，长日照光周期（14 小时光照/10 小时黑暗，光照强度为 130−150 µE·m-2s-1）。
  5. 种子萌发后（3−4 天）移去塑料罩，继续在与萌发阶段相同的条件下培养幼苗。
  6. 每 2−3 天适量浇水，保持土壤湿润但不积水；每 10 天施加一次营养液以促进生长。在正常条件下维持 N. benthamiana 16c 植株的生长直至使用；此时植株应至少具有五片完全展开的真叶，无可见的腋芽或花芽，叶片呈健康的绿色。
  7. 使用 3−4 周龄的 N. benthamiana 16c 叶片进行局部 RNA 沉默检测，使用幼嫩的 N. benthamiana 16c 植株（10−14 天龄）进行系统性 RNA 沉默检测。
    注意：不同实验室的植物生长条件和设施存在差异；应选择健康、发育良好且完全展开的叶片用于浸润实验。

3. 准备 农杆菌 用于浸润的培养物

  1. 从LB平板上挑取一个阳性克隆，接种到含有50 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL利福平的5 mL LB培养基的玻璃试管中。在30 °C、200 rpm振荡条件下培养24−48小时。
  2. 将100 µL菌液转移至5 mL LB培养基中，该培养基添加有相同抗生素、10 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES；pH 5.6）和20 µM乙酰丁香酮（AS）。在30 °C、200 rpm振荡条件下培养16−20小时。
  3. 在4,000 × g 条件下离心10分钟。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于2 mL 10 mM MgCl2缓冲液中。
  4. 重复步骤3.3，以确保完全去除抗生素。
  5. 通过测定600 nm处的光密度（OD600）来确定农杆菌（Agrobacterium）菌液的浓度。用10 mM MgCl2缓冲液调节菌液至OD600为1.5−2.0。
  6. 向最终的菌液悬浮液中加入10 mM MES（pH 5.6）和150 µM乙酰丁香酮（AS），在室温下静置孵育至少3小时。
    注意：最终的菌液悬浮液不可过夜放置。

4. 共同侵染N. benthamiana叶片

  1. 等体积混合 农杆菌 含有35S-GFP的培养物 农杆菌 含有35S-黄瓜花叶病毒抑制子2b（CMV2b）、假定效应子或空载体（EV）的菌株
  2. 在叶片的远轴面小心且缓慢地注入混合的农杆菌悬浮液 N. benthamiana 使用1 mL无针注射器对16c叶片进行处理。
  3. 用软纸巾从叶片上除去残留的细菌悬浮液，并用记号笔圈出浸润区域的边缘。
  4. 将已接种的植物置于相同的生长条件下，在培养室中继续培养。
    注意：出于安全与健康考虑，渗透操作期间应佩戴护目镜和口罩。为防止交叉污染，每次渗透之间应更换手套或用乙醇消毒。通常每片叶片渗透需要至少1 mL农杆菌悬浮液。对于系统性沉默实验，至少需要对两片叶片进行渗透。

5. GFP 成像分析

  1. 在接种后2周（系统性RNA沉默）或接种后3−4天，使用长波紫外（UV）灯目视检测整株植物新生叶片中的GFP荧光，或检测叶片接种区域的GFP荧光，无需采集叶片。
  2. 使用配备紫外滤光片和黄色滤光片的数码相机拍摄采集的植株和/或离体叶片。
    注意：对于局部沉默抑制活性的检测，应观察N. benthamiana 16c叶片的接种区域；而对于系统性沉默抑制活性的检测，则应观察新生叶片。不同效应子的RNA沉默抑制活性可能存在差异，因此应从接种后第3天开始，连续数天观察接种区域或叶片。以CMV2b和EV分别作为阳性对照和阴性对照。

6. 浸润叶片中GFP mRNA水平的Northern印迹分析

  1. 使用RNA提取试剂（材料表）从叶片组织中提取总RNA
    1. 在接种后4−7天，采集侵染了N. benthamiana 16c的叶片组织，液氮中研磨成细粉，转移至无菌的2 mL离心管中。
    2. 立即在通风橱中向样品管中加入RNA提取试剂（1 mL/100 mg组织），剧烈振荡以充分匀浆，并在室温下孵育5分钟。
    3. 在通风橱中向每管加入氯仿（200 µL/1 mL RNA提取试剂），剧烈振荡15秒，在室温下孵育5分钟。将匀浆液在4 °C下以12,000 x g离心15分钟。
    4. 将上清液转移至新的无RNase的离心管中，弃去沉淀。向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀数次，在室温下孵育10分钟。
    5. 在4 °C下以12,000 x g离心15分钟，沉淀RNA。
    6. 弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，在通风橱中空气干燥。将RNA溶于焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水中，在65 °C水浴中孵育10−20分钟以溶解。
  2. 侵染叶片中GFP mRNA水平的Northern印迹分析
    1. 在1x MOPS电泳缓冲液中配制1.2%甲醛变性琼脂糖凝胶。
    2. 将RNA与RNA上样染料按1:1混合，在65 °C孵育10分钟进行变性，立即在冰上冷却1分钟。
    3. 将样品上样至凝胶，在100 V电压下电泳50分钟，直至RNA充分分离。
    4. 用20x柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液漂洗凝胶以去除甲醛，并在20x SSC缓冲液中通过毛细作用将凝胶中的RNA转移至尼龙膜上，过夜。将膜浸泡于2x SSC中，并通过紫外交联将RNA固定在湿润的膜上。
    5. 在杂交管中加入适量杂交缓冲液（每100 cm2膜加10 mL；材料表），在60 °C杂交炉中轻轻振荡。
    6. 将膜放入杂交管中，在60 °C孵育60分钟。将5' DIG标记的DNA探针稀释至杂交溶液中（终浓度为50 ng/mL），该溶液含有预热的杂交缓冲液。
    7. 弃去预杂交缓冲液，立即更换为含有DIG标记探针的预热杂交溶液。在60 °C下轻轻振荡，与探针杂交过夜。
    8. 杂交完成后，在60 °C下用逐渐增加严谨性的缓冲液各洗涤膜两次，每次20分钟。轻轻擦拭膜以去除多余的洗涤液，并按照化学发光杂交与检测试剂盒（材料表）说明书添加相应试剂。
    9. 通过化学发光反应结合成像系统检测杂交信号。

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结果

上述内容中，我们描述了一种用于评估RSS活性的改进筛选实验的逐步操作流程 P. sojae RxLR 效应子。整个实验耗时5−6周。随后，可通过该检测鉴定出的RSSs可在功能和分子机制方面进行进一步表征。作为我们方法的一个示例，我们使用了 P. sojae Phytophthora 中的 RxLR 效应子 RNA 沉默抑制因子 1（PSR1），在侵染过程中通过吸器分泌并递送至寄主细胞内。

为验证PSR1具有RSS活性，因而适用于本方法，将每种转化的农杆菌菌株与携带35S-GFP的菌株混合，并共同浸润到本氏烟16c（N. benthamiana 16c）叶片中。EV和CMV2b分别作为阴性与阳性对照（图1）。在浸润后2−3天，所有混合组的叶片中GFP表达均达到最高水平。在6−9天的观察期内，35S-GFP与CMV2b共浸润区域的绿色荧光强度保...

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讨论

RNA沉默是植物抵御病毒、细菌、卵菌和真菌病原体的关键防御机制。相应地，这些微生物进化出了沉默抑制蛋白以对抗抗病毒沉默，这些RSSs会干扰RNA沉默通路中的不同步骤22,23。已有多种筛选实验被开发用于鉴定RSSs10。

在此，我们介绍一种改进的效应蛋白分泌筛选方案，该蛋白由 P. sojae 感染时进入宿主细胞，以检测其抑制宿主RNA沉默的能力。该改良检测方法基于病毒共浸润实验，但在多个关键方面有所不同。首先，细菌和 N. benthamiana 16株植物应生长健壮且健康；这对于细菌效应子的稳定表达以及利用完全发育的植株至关重要 N. benthamiana 16c 可确保实验的可重复性和可靠性。我们通常仅在营养生长期选取每株植物的两到三片完全展开的叶片，而过老或新长出的叶片均不适用。其次，OD600 细菌培养物的浓度必须调整至最佳值，通常...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了以下资助项目的资助： "曙光计划" 上海教育发展基金会和上海市教育委员会、中国国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2018YFD0201500）、国家自然科学基金（编号 31571696 和 31660510）、中国青年千人计划、上海市科学技术委员会（18DZ2260500）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-吗啉乙磺酸 (MES)Biofroxx1086GR500缓冲液
2xTaq 预混液Vazyme BiotechP112-AAPCR
3-(N-吗啉代)丙磺酸 (MOPS)Amresco0264C507-1KGMOPS 缓冲液
乙酰丁香酮 (AS)Sigma-AldrichD134406-5G农杆菌诱导剂
琼脂Sigma-AldrichA1296-1KGLB 培养基
琼脂糖Biofroxx1110GR100电泳
Amersham Hybond -N+GE HealthcareRPN303 BNorthern 印迹
Amersham 成像仪GE HealthcareAmersham Imager 600成像
胰蛋白胨BD Biosciences211705LB 培养基
酵母提取物BD Biosciences212750LB 培养基
相机NikonD5100摄影
ChemiDoc MP 成像系统Bio-Rad
dafa 试剂盒化学发光检测模块组分Thermo Fisher Scientific89880化学发光检测
氯霉素Amresco0230-100G抗生素
ClonExpress II 一步克隆试剂盒Vazyme BiotechC112-01连接
DIG Easy HybSigma-Aldrich11603558001杂交缓冲液
Easypure 质粒小提试剂盒TransGen BiotechEM101-02质粒提取
EasyPure 快速凝胶回收试剂盒TransGen BiotechEG101-02凝胶回收
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物Amresco/VWR0105-1KGMOPS 缓冲液
电泳电源六一DYY6D核酸电泳
FastDigest EcoRVThermo Fisher ScientificFD0304载体酶切
凝胶成像系统TanonTanon3500成像
庆大霉素Amresco0304-5G抗生素
硫酸卡那霉素Sigma-AldrichK1914抗生素
LR Clonase II 酶Invitrogen11791020LR 反应
硝酸纤维素印迹膜 0.45 μmGE Healthcare10600002Northern
NORTH2south 生物素随机引物 DNA 标记试剂盒Thermo Fisher Scientific17075生物素标记
PCR 扩增仪Bio-RadT100PCR
泥炭藓PINDSTRUPDark Gold + 黏土植物
Peters 水溶性肥料ICEPeter Professional 20-20-20肥料
Phanta Max 超高保真 DNA 聚合酶Vazyme BiotechP505-d1酶
利福平MP Biomedicals219549005抗生素
RNA 凝胶上样缓冲液 (2X)Thermo Fisher ScientificR0641RNA 凝胶上样缓冲液
乙酸钠水合物Amresco/VWR0530-1KGMOPS 缓冲液
氯化钠Amresco0241-10KGLB 培养基
柠檬酸三钠Amresco0101-1KGSSC 缓冲液
Trizol 试剂Invitrogen15596018RNA 提取试剂
紫外灯Analytik JenaUVP B-100AP观察
UVP 杂交炉Analytik JenaOV2000Northern

参考文献

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