突破曲线（BTC）是研究细菌在多孔介质中迁移的有效工具。本文介绍基于微流控装置并结合显微镜观察与流式细胞计数的技术，用于获取突破曲线（BTC）。
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摘要
摘要
理解微生物在多孔介质中的运移、扩散和沉积是一个复杂的科学问题，涉及流体动力学、生态学和环境工程等多个领域。在不同空间尺度上对多孔环境中细菌的运移进行建模，对于更准确地预测细菌运移的后果至关重要，然而现有模型常常难以从实验室条件外推至野外实际环境。本文介绍了一套可在两个空间尺度上研究多孔介质中细菌运移的实验工具。这些工具的目标是获取注入透明多孔基质中的细菌的宏观可观测参数（如穿透曲线或沉积分布）。在小尺度（10–1000 µm）上，将微流控装置与光学视频显微镜和图像处理技术相结合，以获得穿透曲线，同时在孔隙尺度上追踪单个细菌细胞的运动轨迹。在较大尺度上，则结合流式细胞术与自制的机器人加样装置来获取穿透曲线。我们以溪流潜流带等复杂多孔介质中细菌的运移为例，展示了这些工具的应用价值。由于这些工具能够实现跨尺度的同步测量，因而为建立基于机制的模型提供了可能，这对于尺度上推至关重要。这些工具的应用不仅有助于开发新型生物修复技术，还可能为揭示微生物在多孔基质中定殖的生态策略提供新的见解。
引言
旨在理解微生物在多孔介质中迁移过程的研究，主要源于对污染问题1、疾病传播2以及生物修复3的关切。在这一领域中，细菌在迁移模型中通常被视为颗粒4，而过滤、截留、重力沉降或从生物膜中再悬浮等过程被认为是影响微生物滞留或迁移的关键机制5。然而，研究细菌在多孔环境中的迁移过程，也有助于揭示其在这些复杂生境中取得生态成功背后的策略。但实现这一目标需要在单细胞、种群或微生物群落水平上开展新颖的实验并建立相应的数学模型。
自然多孔环境（例如溪流和河流的潜流带）通常被多种能够形成生物膜的微生物群落高度定殖6。生物膜形成的结构会改变流体流动，从而影响液相中细菌的迁移与扩散7,8。在孔隙尺度上，细菌的迁移受到多孔介质中空间受限的影响，而依赖运动能力的扩散可能通过减少在种群密度较低区域的资源竞争，有效提高个体适应性 。另一方面，具有运动能力的细菌还能够到达多孔介质中更为孤立的区域，对这些区域的广泛探索可能为运动型种群带来生态优势10。在更大的空间尺度上，生物膜的生长会改变流体路径，导致孔隙发生（部分）堵塞，从而形成更加集中化和异质化的流动条件11。这将影响营养物质的供给以及细菌扩散的频率和距离。例如，优势流可以形成所谓的"快速通道"，运动型细菌在这些通道中的移动速度甚至可超过局部流速12。这是一种有效提升新栖息地探索能力的方式。
研究运动性和非运动性细菌（及颗粒）在多孔介质中迁移的工具多种多样。数值模型具有强大的预测能力，对实际应用具有重要意义，但通常受限于其内在假设4。结合突破曲线（BTC）建模的实验室尺度实验13, 14 已揭示了细菌细胞表面特性对粘附效率的重要影响15。通常，通过恒定速率释放并在实验装置出口处测量细胞数量，获得突破曲线（即在固定位置处颗粒浓度的时间序列）。在此背景下，突破曲线反映了细菌在多孔基质中的对流-弥散动力学，可通过引入描述附着的汇项进行扩展。然而，仅对突破曲线进行建模无法揭示多孔基质或生物膜的空间结构在迁移过程中的作用。其他宏观可观测量，如弥散度或沉积分布，已被证明能够提供有关滞留颗粒或生长群落空间分布的重要信息。微流控技术可通过显微观察手段研究多孔介质中的迁移过程9,12,16，但除最近的一项研究外10，实验系统通常局限于单一尺度的分辨率，即孔隙尺度或整个微流控装置尺度。
本文介绍了一套结合多种方法的研究体系，用于在不同尺度上研究运动性和非运动性细菌在多孔环境中的迁移过程。我们通过突破曲线（BTC）分析，将孔隙尺度上的细菌迁移观测结果与更大尺度的信息相结合。采用软光刻技术以聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备的微流控装置具有良好的生物相容性，耐多种化学物质，成本低且可重复制造，同时具备优异的光学透明性和极低的自发荧光，适用于显微观察。基于PDMS的微流控技术此前已被用于研究微生物在简单通道17或更复杂几何结构12中的迁移。然而，传统的微流控实验通常局限于短期观测，且对活细胞的落射荧光显微观察往往仅限于基因改造菌株（例如GFP标记菌株）。本文中，我们提出结合显微镜技术与基于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA，又称有机玻璃）的大尺寸装置及流式细胞术，利用PDMS微流控装置研究细菌迁移。PDMS与PMMA在气体通透性和表面特性方面存在差异，因而为研究细菌迁移提供了互补的实验条件。微流控装置可提供更精确的控制环境，而大尺寸装置则适用于长时间实验或使用天然细菌群落的研究。在PDMS微流控装置中，通过在特定区域进行高时间分辨率的显微计数，获得突破曲线（BTC）。为从PMMA装置中获取用于BTC建模的细胞数量，我们引入了一种自制的自动液体分配仪，并结合流式细胞术进行检测。在此系统中，细胞流经流体装置后被依次分配至96孔板中。时间分辨率受限于可精确分配的最小体积，从而取决于流体装置中的介质流速。孔板中的固定剂可抑制细胞生长，并便于后续进行DNA染色及流式细胞计数。为防止迁移实验过程中细菌增殖，我们采用最低限度培养基（称为运动缓冲液）。
由于不同尺度下流体装置制备的实验方案已广泛可得，本文仅简要介绍此类装置的制备技术，而重点聚焦于记录突破曲线（BTCs）的实验操作流程。类似地，微生物的流式细胞术计数已有多种常规方法，但用户需具备专业知识以解读流式细胞术所得结果。本文报道了一种将微流控装置与显微成像技术相结合以记录荧光标记细胞突破曲线（BTCs）的新方法。在孔隙尺度上，通过图像处理获取局部流速和细胞运动轨迹。此外，我们还展示了基于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的流体装置与流式细胞计数相结合的应用，用于观察在天然溪流生物膜定植的多孔环境中，运动性与非运动性细菌的迁移行为。
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方案
1. 细菌培养条件
- 在超净工作台内操作，取100 μL甘油保存的GFP标记的Pseudomonas putida KT2440菌种（浓度为1 × 107 mL-1，-80 °C保存），接种于5 mL LB（Luria-Bertani）培养基中。在30 °C、250 rpm振荡条件下过夜培养。
- 次日，取100 μL过夜培养物重悬于5 mL LB培养基中，在相同条件下继续培养5小时（对数生长期）。取1 mL培养液转移至2 mL离心管中，室温静置冷却约15分钟，随后离心（2300 × g，5分钟）。
- 弃去上清液，向菌体沉淀中加入1 mL运动缓冲液。短暂涡旋振荡以混匀样品。根据需要稀释至目标细胞浓度，例如5 × 105 mL-1。
- 对于涉及自然群落（如溪流来源微生物群落）的实验，需配制非选择性培养基。例如，可使用经无菌过滤并高压灭菌的溪流水，或添加复杂碳源（如LB培养基）的人工溪流水培养基。
2. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置的制备
- 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计所需的多孔几何结构18，该结构由一系列圆形矩阵组成（即对流动不可渗透的障碍物），以半径尺寸和圆心坐标描述。
注意：在图1A中提供了具有随机化颗粒与孔隙尺寸的多孔几何结构示例。在出口附近设置无障碍物的观测通道，有助于获取突破曲线（BTCs）。 - 根据选定的几何结构，采用标准SU-8光刻技术制备模具18。
注意：也可向专业的微加工机构订购模具。为了在水平面内获得非均质流体流动，微流控腔室的厚度应设计为与平均孔喉尺寸处于同一数量级。但需确保微流控装置的尺寸适用于显微镜下观察（例如，在显微镜载玻片上操作）。 - 使用无针头的注射器，按重量比将10%的交联剂（二甲基、甲基氢硅氧烷共聚物）加入90%的弹性体中，配制50 g PDMS。在洁净条件下操作，并尽可能避免灰尘污染。将两种试剂在洁净的一次性容器中混合，并在100 mbar下抽真空30分钟，以去除粘稠PDMS中的溶解空气和气泡。
- 将模具放入培养皿（直径100 mm，高15 mm）中。将PDMS浇注至模具上至所需高度（例如2–5 mm）。盖上培养皿，并在60 °C下加热4小时（较厚层可过夜固化）以完成固化。
注意：为便于可视化观察，光线应能穿透PDMS，因此建议使用2 mm至5 mm之间的薄层。较厚的层（>5 mm）会降低装置透明度，而过薄的层在使用过程中易发生形变。 - 将模具从烘箱中取出，使微流控装置冷却至室温。冷却后，用解剖刀小心切下所需部分的PDMS。
注意：对模具施加过大压力会导致模具破裂。切勿用手直接接触PDMS，指纹会影响其光学透明性。 - 暂时用胶带密封PDMS通道底部（即已雕刻所需几何结构的一面）。使用直径为0.5 mm的活检打孔器，在微流控通道上穿孔，形成与0.5 mm（内径）管路匹配的入口和出口。
注意：PDMS材质柔软，插入管路后可确保密封性。PDMS与玻璃封接后无法再加工入出口通道。 - 通过高频发生器（等离子体键合仪，材料表）使用氧等离子体键合技术密封微流控通道。首先用乙醇清洗硅酸盐玻璃片（25 mm × 75 mm）并晾干。移除PDMS通道上的胶带，将通道放置于台面，使多孔面朝上。在室温下对硅酸盐玻璃片和PDMS表面进行约45秒的等离子体处理。
- 将PDMS通道置于硅酸盐玻璃片上，并在加热板上于100 °C加热30分钟。
- 将微流控装置从加热板上取下并冷却至室温。将PDMS通道的入口与管路连接。抽真空30分钟以去除PDMS中的空气，PDMS对液体几乎不渗透，但对气体具有渗透性。
- 配制100 mL运动缓冲液（10 mM磷酸钾，0.1 mM EDTA，添加1% w/v葡萄糖，pH 7.0），并使用注射泵以10 µL min-1的流速向微流控装置注入1 mL缓冲液。
注意：由于PDMS在先前的抽真空步骤中处于气体欠饱和状态，气泡将在约30分钟内消失。
3. 聚甲基丙烯酸甲酯微流控装置的制备
- 使用 CAD 软件设计所需的几何结构。如适用，确保尺寸适合在显微镜下观察（例如，标准 96 孔板的尺寸配合适当的支架）。该流体装置由一块 PMMA 基底（127 × 127 × 12 mm）和一块 PMMA 盖板（127 × 127 × 12 mm）组成。
注意：建议具备 CAD 软件操作经验。示例技术图纸见图 1A。 - 为制备孔室，采用高精度微铣削（WF31SA，Mikron），从底部 PMMA 层去除 0.5 mm 材料，并铣削一条用于橡胶 O 形圈的凹槽（1.1 × 1.1 mm）。钻 12 个螺纹孔（M5）。此部分将作为流体装置的基底。
注意：流体装置的尺寸需根据显微镜载物台和焦距进行调整。技术图纸见图 S1。 - 在流体装置的上部钻两个螺纹孔（1/4-28UNF 型），用于进液口和出液口，另钻 12 个孔（5.5 mm），用于固定螺钉。此部分将作为流体装置的盖板。
注意：建议具备微铣削经验；作者通过专业加工车间提供支持。 - 为在每次使用前和使用后清洁并灭菌流体装置，将流体装置的基底和盖板浸泡于 7% 盐酸（HCl）中，并用去离子水冲洗三次。
- 利用 12 个螺纹孔将基底和盖板拧紧固定。
4. 自动分配器的设置
注意：市面上可购买的液体分配器价格昂贵，且通常无法灵活地直接从微流控装置的流出端进行分配。因此，建议使用 XY 绘图机器人（材料表）组装一种廉价且灵活的机器人分配系统。
- 为了将微流控装置的流出液分配至96孔板，将机器人分配器安装到一块PMMA板上，并铣削出尺寸为85.8 × 128 mm、深度为1 mm的凹槽，用于固定多个96孔板。
- 将微流控装置的流出管连接至分配器的机械臂上。
- 为操作机器人分配器，请从 GitHub 下载 bCNC：https://github.com/vlachoudis/bCNC，并按照说明安装该程序。
- 从本文的补充材料中下载 dispenser.py。
注意：该 Python 代码为 bCNC 提供了一个用于简单机器人分配器布局的插件。 - 将机器人分配器连接至运行 bCNC 的计算机，并识别正确的 COM 端口。
- 在 bCNC 中，点击“回原点”按钮，使机器人分配器返回初始位置。
注意：“回原点”操作可将机器人分配器复位至已知坐标（x=0, y=0），从而提高分配器的定位精度。 - 实验前，准备足够数量的96孔板，每孔中加入适量固定液（例如，终浓度为3.7%的甲醛）。
注意：例如，在流速为0.2 mL min-1时，每30秒向每个孔中分配100 µL液体。因此，可在每孔中加入10 µL的37%甲醛，使甲醛终浓度保持在2%至4%之间。使用八个96孔板可支持实验持续运行超过6小时，共获得768个数据点。此外，需注意经甲醛固定后，GFP标记的细胞可能失去荧光信号。
5. 使用 PDMS 微流控装置分析细菌转运
- 将先前用运动缓冲液饱和的PDMS微流控装置放置在显微镜载物台上。使用胶带固定管路，以尽量减少载物台移动过程中对流体流动的干扰。
- 移动显微镜载物台至靠近出口的观察通道位置。使用明场显微镜或相差显微镜，将焦平面调整至观察通道中心，并调节放大倍数以清晰观察单个细菌细胞。
- 切换光路设置至荧光显微镜模式，并调整相机曝光时间以分辨单个细菌细胞（例如100 ms），或使细胞的荧光信号强度至少达到背景噪声的3倍以上。
- 随后，将入口管路插入含有细菌悬液的2 mL离心管中。反转泵的运行方向，以1 µL min-1的流速开始抽吸悬液。
- 在整个实验过程中，每2分钟对观察通道的整个横截面进行扫描，并记录一幅复合图像。
6. 基本图像处理
注意：这些基础图像处理程序的目标是统计记录图像中细菌的数量。最佳处理流程取决于显微镜和相机的技术参数，以及实验所用细菌菌株的荧光特性，因此需要进行相应调整。
- 首先将图像以 .tiff 格式导出。
- 将图像导入所需的软件平台（例如 MATLAB、ImageJ、R 或 Python）。
- 去除相机噪声，即图像中像素强度的随机变化，并校正光学像差。可通过在每张图像上应用高斯滤波器实现：滤波器的大小取决于相机传感器的质量（例如 CCD 或 CMOS）。光学像差可通过将每张图像除以在无样品条件下、使用相同光学配置采集的参考图像进行归一化来消除。
- 将图像裁剪至感兴趣区域。
- 确定一个阈值（像素强度），使得高于该阈值的像素包含细菌细胞。
注意：如果图像照明不均（由于光学像差或噪声），应用自适应阈值可能更为有效，该方法根据局部平均强度选择阈值。 - 从每张图像中减去上述定义的阈值。
- 对得到的图像进行二值化处理，使细菌细胞的像素值为 1，背景像素值为 0。
- 去除面积小于最小细菌细胞尺寸的聚类。
- 对二值化图像求和，得到剩余聚类的总像素数。将像素总数除以单个细菌细胞的平均大小（以像素为单位），即可估算出细胞总数。
- 根据已知的视场深度和观测区域面积，将计数值转换为浓度（particles mL-1）。
- 确定注入的细菌悬浮液浓度至关重要。为此，用注射器将 1 mL 细菌培养悬浮液注入洁净微流控装置的观察通道中。记录图像，并按照上述步骤（6.1 至 6.10）计算进水细菌浓度（C0）。
- 通过将出水细菌浓度（C）除以进水细菌浓度（C0）对突破曲线（BTCs）进行归一化，并绘制 C/C0 随时间变化的曲线。
7. 在孔隙尺度上分析细菌的迁移
- 为分析细菌在多孔介质中迁移的局部速度与轨迹，将显微镜载物台移动至目标区域，并调节焦距至微流控装置的中心位置。
- 将显微镜设置为明场或相差模式。
注意：仅当细菌细胞的荧光信号无法支持曝光时间短于细菌平均运动时间时采用此设置；否则应使用荧光显微镜。 - 以能够捕捉细菌位移的曝光时间（短于细菌在像素数量上发生位移的平均时间，且像素位移数小于物体尺寸）进行延时成像，并优化细菌细胞的检测效果（例如，曝光时间为 20 ms，每 50 ms 记录一次图像）。记录足够长时间的图像，以确保最慢轨迹的数量具有统计代表性（例如，3 分钟）。
注意：确保计算机具有足够的磁盘空间。 - 为消除背景噪声，从每幅图像中减去所有记录图像的平均值。具体操作为：构建一个矩阵，其每个像素的值为所有图像在该位置的强度之和，再除以图像总数。
- 对处理后的图像（Im），计算其数值梯度的模
，并以其最大值（max）进行归一化，定义如下：
- 通过强度阈值法对矩阵 B 进行二值化处理，参见步骤 6.7–6.8。
- 对每个时间点，记录细菌坐标（x, y，单位为像素或 mm）及图像采集时间，存入一个三列数据文件。
- 最后，应用粒子追踪脚本处理所记录的数据，计算细菌的运动轨迹。例如，可采用已建立的实验方案19，以及免费提供的 Matlab 粒子追踪代码：(http://site.physics.georgetown.edu/matlab/)。
8. 通过沉积分布研究细菌过滤效果
- 为通过荧光显微镜获得GFP标记的P. putida KT2440细胞的沉积分布图，需在通过微流控装置注入细菌悬液之前和之后，分别记录整个多孔通道的复合图像（即背景图像和注入后的图像）。选择合适的曝光时间（例如100 ms），以确保能够检测到细菌的荧光信号，同时避免荧光漂白。
- 导出图像并导入至所需软件平台（见6.1–6.2节）。
- 从注入细菌后记录的图像中去除背景信号。
- 沿多孔通道的横向截面，对滞留细菌的总荧光信号进行积分。
- 为计算沉积分布图，以积分后的荧光信号为纵坐标，多孔通道长度为横坐标作图。
9. 使用PMMA微流控装置和流式细胞术分析细菌转运
- 使用50 cm（内径1 mm）的管路将蠕动泵与入口连接，并使用相同管路（50 cm，见第4节）将出口与自动分配器连接。
注意：使用泵来分配培养基，并注入细菌细胞。在恒定流速释放过程中，使用鲁尔锁接头和三通阀在培养基和细菌悬液之间切换。 - 将培养基通过流体装置泵入。观察固定在机器人分配器上的出口管路中培养基的到达情况。
- 以0.2 mL min-1的流速开始通过PMMA流体装置注入细菌悬液，
- 当细菌到达流体装置入口时，启动自动分配器。
- 为了实现脉冲式注入，注入细菌悬液若干孔体积（例如30个孔体积），然后切换为注入培养基，直至实验结束。
注意：流体装置的孔体积约为0.2 mL，因此在建议的流速下，每分钟可完全置换一个孔体积。 - 完成一个96孔板后，盖上盖子以减少蒸发，并将其储存在4 °C条件下。
- 按照既定方案20通过流式细胞术分析细菌丰度。
注意：例如，向每个孔中加入25 µL绿色荧光核酸染料（材料表），浓度为0.025 mM（溶于超纯水中）。该染料可标记细菌DNA，从而可通过流式细胞术定量细菌丰度。将样品在避光条件下孵育15分钟，然后使用配备488 nm激光器和515 nm检测器的流式细胞仪进行分析。 - 在进行BTC分析之前，需考虑由于添加固定剂和染料导致的样品稀释效应。通过1.35的校正因子对细菌丰度进行校正，以补偿固定剂和染料的影响。
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结果
为了说明所展示工作流程的功能，我们使用基因改造的Pseudomonas putida KT2440进行了实验，这是一种在生物修复和生物技术中具有重要意义的革兰氏阴性运动型细菌。表达GFP的该菌株的基因改造版本可商业化获得。此外，还有一种缺乏运动相关结构基因和调控基因的非运动型P. putida KT2440菌株。利用运动型和非运动型GFP标记的P. putida KT2440，我们在具有随机柱阵列的PDMS微流控装置中进行了一系列实验（图1B），并记录了穿透曲线（BTC）（图2A）。BTC已根据注入细胞的浓度（C0）进行了归一化处理。同时，通过上述图像处理和粒子追踪方法，在孔隙尺度上对细菌运动轨迹进行了可视化观察（图2B）。
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讨论
本文提出了两种在单细胞和群体水平上研究微生物在多孔系统中迁移的方法。尽管利用突破曲线（BTC）模型研究迁移现象已为理解病原体或污染物在生态系统尺度上的扩散提供了重要见解，但从实验室实验外推至野外条件仍存在困难。本文所述工具使研究人员能够通过实验解析空间和时间尺度，从而更深入地理解与多孔环境中微生物迁移相关的生态策略。实验人员可使用或修改这些系统，以研究除运动性之外的其他微生物特性，例如趋化性或群体感应，或改变多孔基质的几何结构及其他生境特征。此外，利用这些系统可将细菌迁移行为与沉积分布剖面直接关联，后者为定殖模式提供了重要信息，并有助于理解生物膜如何改变局部流场。我们预期，对微生物在多孔介质中扩散与定殖策略的更深入理解，将提升模型预测能力，从而有助于控制病原体传播或污染物扩散。对该系统的进一步改进还可能促进新型过滤装置或生物技术工具的开发，其中需要实现细胞的物理分离。
我们推荐在大规模和长期实验中使用基于PMMA的装置，而在小规模、短期实验或需要高时间分辨率的情况下使用基于PDMS的装置。需要注意的是，这两种材料具有不同的特性。例如，PDMS对氧气等气体具有通透性，而PMMA则具有...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢Antoine Wiedmer在机器人分配器的设置以及dispenser.py脚本方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EDTA | Sigma | ||
| 弹性体 Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| NovoCyte 流式细胞仪 | Acea | ||
| 葡萄糖 | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB 肉汤 | BD | ||
| 液体分配器，XY 绘图机器人套件 | makeblock | ||
| Axio Imager 显微镜 | Zeiss | ||
| AxioZoom v16 显微镜 | Zeiss | ||
| 显微镜载玻片，75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 蠕动泵 | Gilson | ||
| 等离子体键合仪 Corona SB | BlackHole Lab | ||
| 磷酸钾 | Sigma | ||
| New Era NE 4000 注射泵 | New Era | ||
| Syto 13 绿色荧光核酸染料 | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon 管路 | Ismatec | ||
| WF31SA 万能铣床 | Mikron |
参考文献
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