预nylation是外周膜结合蛋白上的一种重要修饰。通过改造昆虫细胞，可大量生产法呢基化并羧甲基化的KRAS4b，从而支持对蛋白质-蛋白质及蛋白质-脂质相互作用进行生物物理测量。
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摘要
摘要
蛋白质预nylation是一种关键的修饰，负责将蛋白质靶向至细胞内膜。KRAS4b在22%的人类癌症中发生突变，由于其C末端存在“CAAX”盒基序，因此会经历法尼基化和羧甲基化加工。此前已有研究描述，利用经过改造的杆状病毒系统在昆虫细胞中表达法尼基化和羧甲基化的KRAS4b。本文中，我们详细描述了该蛋白的实用纯化方法及其生化表征。具体而言，采用亲和层析和离子交换层析将蛋白纯化至均一。通过完整质谱和天然质谱验证KRAS4b的正确修饰状态，并确认其与核苷酸的结合能力。最后，利用表面等离子共振光谱法检测法尼基化和羧甲基化的KRAS4b与脂质体的膜结合特性。
引言
翻译后修饰在决定蛋白质功能活性方面起着关键作用。磷酸化和糖基化等修饰已被广泛研究。然而，脂质修饰的特征仍相对不明确。据估计，多达0.5%的细胞内蛋白质可能发生法尼基化1。法尼基化是指将一个15碳的法尼基或20碳的香叶基香叶基脂链转移至含有CAAX基序的受体蛋白上2。已有研究表明，法尼基化蛋白参与多种人类疾病的发展过程，包括早衰症3、阿尔茨海默病4、心脏功能障碍5、脉络膜缺失症6和癌症7。在基础状态下，小GTP酶HRAS、NRAS和KRAS1、核层蛋白以及动粒蛋白CENP-E和F属于法尼基化蛋白。其他一些小GTP酶，如RhoA、RhoC、Rac1、cdc-42和RRAS则发生香叶基香叶基化8，而RhoB既可被法尼基化，也可被香叶基香叶基化9。
小GTP酶KRAS4b作为一种分子开关，主要通过多种蛋白质-蛋白质相互作用，将细胞外的生长因子信号传递至细胞内信号转导通路，从而促进细胞生长与增殖。KRAS4b生物化....
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方案
1. 蛋白质纯化
- 配制缓冲液 A–H，见表1。
| 缓冲液 | 缓冲剂（均为 20 mM） | pH | NaCl (mM) | 咪唑 (mM) | MgCl2 | TCEP |
| A | HEPES | 7.3 | 300 | - | 5 | 1 |
| B | HEPES | 7.3 | 300 | .... |
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结果
该实验方案中最大的变量之一是目标蛋白（His6-MBP-tev-KRAS4b）的表达量。本方案所使用的蛋白来源于一种Trichoplusia ni细胞系Tni-FNL17，该细胞系已适应悬浮培养并实现无血清培养。鉴于不同昆虫细胞系在杆状病毒表达系统中报告的结果差异较大，建议至少在初期使用Tni-FNL细胞系来生产KRAS4b-FMe。
在澄清的裂解液以及洗脱组分中，应能明显观察到一条迁移至约65 kDa的深色蛋白条带（图1A）。该融合蛋白应是裂解液中两条最显著染色条带之一，另一条为共表达的FNTA/B，其共迁移至约48 kDa处。
在纯化过程中，阳离子交换层析（CEX）步骤至关重要，原因有两点：1）该步骤有助于减少蛋白水解程度，因为高变区（HVR）极易发生降解；2）如本方案该步骤的注释所述，该步骤可富集完全加工成熟的蛋白。然而，这也是整个方案中最复杂的部分。其复杂性在于.......
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讨论
如代表性结果部分所述，纯化过程中最关键的步骤是在低盐条件下对样品的处理。限制样品暴露于低于 200 mM NaCl 条件下的时间，有助于减少沉淀并提高样品得率。如果阳离子交换层析（CEX）的结果图谱与预期不符，则结果的解读可能较为困难（见图 2）。在该方案尚未成为常规操作之前，建议将未继续使用的 CEX 洗脱组分保存于 -80 °C，直至完成完整分子量分析，以确保选择了正确的组分进行后续实验。除上述 CEX 步骤的参数外，本方案在裂解和固定金属离子亲和层析（IMAC）步骤中相对容易修改。值得注意的是，本方案中未包含尺寸排阻层析（SEX）分离步骤。省略该步骤的原因是在早期方法开发过程中观察到了样品损失（未发表结果）。值得注意的是，当蛋白质处于纳米盘（nanodiscs）复合物中时，不会观察到此类损失，表明在缺乏脂质的情况下发生的损失可能是由于蛋白质与层析树脂之间的疏水相互作用所致。
该方法在产量（>10倍以上）和质量（相较于在人源细胞中表达的真实加工型KRAS4b）方面均实现了显著提升，此前文献中尚未见类似报道
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢癌症研究弗雷德里克国家实验室蛋白质表达实验室的Carissa Grose、Jen Melhalko和Matt Drew在克隆与表达方面提供的支持。本项目全部或部分由美国国家癌症研究所、美国国立卫生研究院的联邦资金资助，合同编号为HHSN261200800001E。本出版物的内容不一定反映卫生与公共服务部的观点或政策，提及的商标名称、商业产品或组织亦不意味着美国政府的认可。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.8 mL 安全锁扣管，本色 | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm 带锁不锈钢自动进样瓶插件小瓶 | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酰胆碱（POPC） | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | 以氯仿溶液形式购买 |
| 1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酰-L-丝氨酸（POPS） | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | 以氯仿溶液形式购买 |
| 5427R 离心机 | Eppendorf | ||
| 乙腈，HPLC 级 | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| 乙酸铵 | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| 氩气 | Airgas | ARUP | |
| 384 孔检测板 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 仪器 | GE Healthcare | ||
| 蓝色 Snap-It 密封盖，T/S 型 | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson 超声波清洗仪 | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| 阳离子交换色谱柱（CEX） | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro 微孔板读数仪 | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR 质谱仪 | Thermo Scientific | ||
| 甲酸 | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | 使用试剂级或更高级别 |
| Gilson 7x14 mm 小瓶 | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| 带聚四氟乙烯泡沫衬垫的螺纹玻璃小瓶 | Scientific Specialities | B69302 | |
| 高速/台式离心机 | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | 最高可达 4,000 ×g |
| His6-烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶 | Addgene | 92414 | 根据 Raran-Kurussi 等（2017）方法纯化：TEV 蛋白酶去除亲和标签。见：Burgess-Brown N.（编），大肠杆菌中异源基因表达。《分子生物学方法》，第 1586 卷。纽约，Humana Press |
| 固定化金属亲和色谱柱（IMAC） | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| 内部供水系统，Arium Advance | Sartorius Stedim | 电阻率为 18 MΩ·cm | |
| 脂质挤出器套装（含支架） | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| 液氮 | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH 微流体处理器 | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC 色谱柱，4 µm，3.0 × 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 色谱柱，5 µm，300 Å，2.1 × 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran 软件 | Thermo Scientific | ||
| 甲醇，HPLC 级 | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC 色谱系统 | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 色谱系统 |
| 不含 EDTA 或其他螯合剂的蛋白酶抑制剂混合物 | Millipore Sigma | P8849 | |
| 3 型橡胶盖 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S L1 传感器芯片 | GE Healthcare | 29104993 | |
| 分光光度计 | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | 280 nm 处吸光度 |
| Ultra-15 离心过滤单元，10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES 膜 |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL 离心过滤器 | Amicon | UFC501024 | |
| 超速离心机 | Beckman Coulter | Optima - L80K | 最高可达 100,000 ×g |
| Vanquish UHPLC（泵、柱温箱和液相系统） | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 涡旋振荡器 | Fisher | 12-812 | |
| 水，HPLC 级 | Sigma-Aldrich | 270733-1L | 可使用内部水源（见下文） |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm 注射器滤器 | GE Healthcare - Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | 蛋白质组学软件 |
参考文献
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry.
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