方法文章

用于研究人类原代细胞核结构的3D多色DNA FISH技术

DOI：

10.3791/60712

⸱

2020年1月25日

 ,  ,  , 
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi", INGM

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D 多色 DNA FISH 是一种用于在三维保存的细胞核内可视化多个基因组位点的工具，能够在单细胞水平上明确界定这些位点在细胞核空间内的相互作用及其定位。本文介绍了一种适用于多种人类原代细胞的逐步实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞生物学中的一个核心问题是基因组在细胞核空间内的组织方式，以及染色质结构如何影响基因表达、细胞身份和分化等过程。目前用于研究基因组三维结构的多种方法可分为两个互补的类别：基于染色体构象捕获的技术（C-技术）和成像技术。前者基于在固定细胞群体中捕获染色体构象及邻近DNA相互作用，而后者则基于在三维结构保存的细胞核上进行DNA荧光原位杂交（FISH），可在单细胞水平上同时可视化多个基因位点（多色），从而研究它们在细胞核内的相互作用和空间分布（三维多色DNA FISH）。三维多色DNA FISH技术的局限性在于只能可视化少数预先确定的基因位点，无法对细胞核结构进行全面分析。然而，鉴于其结果的可靠性，三维多色DNA FISH结合三维显微镜成像与图像重建，可作为验证基于C-技术结果的一种可行方法，并能够明确地在单细胞水平上研究特定基因位点的位置与组织方式。本文提出了一种适用于多种人类原代细胞的三维多色DNA FISH逐步操作方法，并详细讨论了在不同生物学背景下获得成功且具有信息量的三维多色DNA FISH实验所需的所有实际操作步骤、关键环节、三维成像概念及数据分析方法。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高等真核生物需要在微小的细胞核三维空间内系统性地压缩和致密化大量的遗传信息1,2,3,4。目前我们已知，基因组在空间上被组织成不同的区室和拓扑关联结构域5，DNA多层次的折叠可导致不同基因组区域之间形成相互作用，可能涉及染色质环的形成6,7。染色质的三维动态成环可影响多种生物学过程，如转录8,9、分化与发育10,11、DNA修复12,13，而其异常则与多种疾病14,15,16以及发育缺陷15,17,18相关。

已开发出多种方法用于研究三维基因组结构。基于染色体构象捕获的技术（C-技术，3C、4C、5C、Hi-C及其衍生技术）已被用于研究固定细胞中的基因组结构3,4,19,20。这些方法依赖于捕获在空间上邻近的基因组位点之间的相互作用频率。C-技术根据其复杂程度不同，可检测细胞群体中的全局三维基因组结构和细胞核拓扑结构3,4,19,20。然而，三维相互作用在时间和空间上具有动态性，在单个细胞之间表现出高度异质性，包含多重相互作用，且存在广泛的多样性21,22。

三维多色DNA荧光原位杂交（FISH）是一种可在单细胞水平上可视化特定基因组位点的技术，能够以与C技术互补的方式直接研究细胞核的三维结构。该技术目前常用于明确验证C技术所得结果。三维多色DNA FISH利用与目标基因组位点互补的荧光标记探针。通过使用不同的荧光染料以及合适的显微镜设备，可在细胞核空间内同时可视化多个靶标23,24。近年来，FISH已与显微镜技术的进步相结合，实现了高分辨率下精细结构的可视化25,26，或与CRISPR-Cas技术联用，实现活细胞成像中核酸的可视化27,28。尽管该技术已被广泛采用，但由于所用生物材料需要特殊处理，三维多色DNA FISH在许多实验室中仍被认为具有操作难度。

本文提供了一套完整的三维多色DNA荧光原位杂交（3D multicolor DNA FISH）实验方案，涵盖从细胞与探针制备到数据分析的全过程，适用于多种人类原代细胞，可实现多个基因组位点的可视化，同时保持细胞核的三维结构。为了研究细胞核结构，必须完整保留细胞核的三维构象。因此，与以往其他已有方案29,30,31不同，本方法避免使用酒精梯度脱水以及将盖玻片长期储存在酒精中，因为这些步骤可能影响染色质结构32。本方法基于已有的保留三维结构的DNA FISH方案24,33进行优化，适用于多种人类原代细胞，无论是体外分离的细胞还是体外培养的细胞。针对不同细胞核形态和细胞学特征（如核压缩程度不同、细胞骨架丰度差异等）34，本方案提供了相应的通透和去蛋白化参数。而这些参数在其他方案中通常仅被笼统描述24,33，缺乏针对不同类型细胞操作步骤的明确区分。此外，我们开发了一个名为NuCLεD（nuclear contacts locator in 3D）的专用分析工具16，提供了一套自动化数据分析原则，可更准确地评估不同基因位点之间的三维空间邻近性及其在细胞核空间内的拓扑分布。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 使用缺口平移法进行DNA探针的制备与标记

  1. 使用特定试剂盒（材料表）纯化和清洁细菌人工染色体（BACs）、质粒或PCR产物，用ddH2O重悬，通过琼脂糖凝胶电泳检测并定量。
  2. 在0.5 mL低吸附DNA管中，根据表1混合所有试剂，对第1.1步获得的1.5−2 µg DNA进行切口平移反应，终体积为50 µL。
    注意：直接标记的探针可提高信噪比。市面上有通过切口平移法使用不同Alexa荧光染料制备直接或间接标记探针的试剂盒。
  3. 将切口平移反应混合物置于恒温混匀仪中，在16 °C孵育一定时间，具体时间取决于起始DNA材料的长度：PCR产物（每份2,000 bp的PCR产物混合物）孵育45分钟，BAC DNA和质粒则最长孵育4小时。
  4. 通过2.2%琼脂糖凝胶电泳检测第1.3步生成的探针大小。
    注意：最佳探针大小为<200 bp（图1A）。
    1. 如果DNA消化不足，向反应体系中加入5 U DNA聚合酶I和0.05 U DNase I，在16 °C继续孵育1−2小时，随后重新检测。用0.5 mM EDTA（终浓度）终止反应。探针可储存于-20 °C。
  5. 针对每次DNA FISH实验，根据探针来源的起始DNA材料沉淀相应量的探针：来自切口平移PCR产物的探针取200 ng，来自切口平移BAC的探针取100 ng，或来自切口平移质粒的探针取300 ng。加入ddH2O至终体积150 µL，20 µg未标记的鲑鱼精DNA，3.5 µg物种特异性Cot-1 DNA，3倍体积的100%乙醇，以及1/10体积的3 M乙酸钠（pH 5.2）。在-80 °C沉淀1小时。
  6. 在4 °C以最大转速离心1小时，弃去上清液。用70%乙醇洗涤沉淀两次。
  7. 将沉淀物溶于2 µL 100%甲酰胺（pH 7.0）中，在40 °C振荡30分钟（可能需要数小时），然后加入等体积的4x盐-柠檬酸钠（SSC）/20%硫酸葡聚糖。
    1. 配制20x SSC：将175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸钠溶于终体积为1 L的H2O中。高压灭菌、过滤并分装。
      注意：对于多色DNA FISH实验，不同探针可共同沉淀，但可能相互退火的探针除外。在此类特定情况下，应分别处理，按探针数量比例分配第1.5−1.7步所述试剂进行沉淀和重悬。仅在甲酰胺中重悬后才将探针混合。若使用大于或小于10 mm的玻璃盖玻片，应根据载玻片面积按比例调整第1.5−1.7步所用试剂的体积。杂交探针可在-20 °C长期保存（最长可达两个月）。

2. 细胞固定、预处理和透化

注意：透化和去蛋白步骤是关键步骤。反应时间及试剂浓度很大程度上取决于细胞类型、细胞质丰度以及细胞核形态。

  1. 人原代T淋巴细胞的细胞固定、预处理和通透
    注意：本方案适用于细胞体积小、细胞核小且胞质含量少的细胞。
    1. 使用玻璃盖玻片（直径10 mm，厚度1.5H）。
    2. 用ddH2O清洗玻璃，再用70%乙醇清洗，晾干。每孔24孔板使用一片玻璃。
    3. 直接在玻璃上加入200 µL 0.1% 聚-L-赖氨酸（w/v）（材料表），形成液滴。注意保持液滴停留在玻璃表面，避免接触孔壁，孵育2−5分钟。小心移除液滴，让玻璃在室温下干燥30分钟。
    4. 重复步骤2.1.3两次。
    5. 直接在玻璃上加入200 µL悬浮细胞（2 × 106/mL，体外原代T淋巴细胞的PBS悬浮液），在室温（RT）下孵育30分钟，使细胞贴附。
    6. 快速移除液滴，加入新配制的4%多聚甲醛（溶于PBS/0.1% TWEEN 20，pH 7.0，过滤），在室温下固定贴附的细胞10分钟。
    7. 在室温下用0.05% Triton X-100/PBS（TPBS）洗涤三次，每次5分钟。在室温下用0.5% TPBS通透10分钟。
    8. 进行RNase处理：在24孔板中每孔加入250 µL PBS和2.5 µL RNase混合液（材料表），37 °C孵育1小时。
    9. 用PBS冲洗，加入20%甘油/PBS，在4 °C下过夜（ON）孵育。
      注意：此步骤时间可从1小时至过夜。载玻片可在4 °C下保存于20%甘油/PBS中最多7天。
    10. 在干冰上冷冻（15−30秒），在室温下逐渐解冻，然后浸入20%甘油/PBS中。重复步骤2.1.9三次。
    11. 在室温下用0.5% TPBS洗涤5分钟。在室温下用0.05% TPBS洗涤两次，每次5分钟。在室温下用0.1 N HCl孵育12分钟。用2x SSC冲洗。
    12. 在室温下用50%甲酰胺（pH 7.0）/2x SSC过夜（ON）孵育。
      注意：孵育时间可优化并适当缩短。载玻片可在50%甲酰胺/2x SSC中保存数天。
  2. 人原代成肌细胞的细胞固定、预处理和通透
    注意：本方案适用于细胞体积大、胞质含量高的细胞。
    1. 在24孔板的盖玻片上，使用生长培养基（DMEM高糖培养基，含20%胎牛血清（FBS）、25 ng/mL成纤维细胞生长因子（FGF）、10 ng/mL表皮生长因子（EGF）、10 µg/mL人胰岛素、1×谷氨酰胺、1×青霉素/链霉素）直接培养人原代成肌细胞，至少24小时（达到50−70%汇合度）。
      注意：为促进细胞贴附，可在接种前用明胶、胶原或聚-L-赖氨酸对盖玻片进行包被处理。
    2. 用PBS换液冲洗2−3次。加入新配制的4%多聚甲醛，在室温下固定细胞10分钟。
    3. 在室温下用0.01% TPBS洗涤三次，每次3分钟。在室温下用0.5% TPBS通透10分钟。
    4. 进行RNase处理：在24孔板中每孔加入250 µL PBS和2.5 µL RNase混合液（材料表），37 °C孵育1小时。
    5. 用PBS冲洗，加入20%甘油/PBS，在室温下过夜（ON）孵育。
      注意：此步骤时间可从1小时至过夜。载玻片可在4 °C下保存于20%甘油/PBS中最多7天。
    6. 在干冰上冷冻（15−30秒），在室温下逐渐解冻，然后浸入20%甘油/PBS中。重复此步骤三次。
    7. 在PBS中洗涤三次，每次10分钟。在室温下用0.1 N HCl孵育5分钟。用2x SSC冲洗。
    8. 在室温下用50%甲酰胺（pH 7.0）/2x SSC过夜（ON）孵育。
      注意：孵育时间可优化并适当缩短。载玻片可在50%甲酰胺/2x SSC中保存数天。
    9. 将保存在50%甲酰胺/2x SSC中的载玻片在2x SSC中平衡2分钟，然后在PBS中平衡3分钟。
    10. 根据细胞类型，使用0.01 N HCl/0.0025%胃蛋白酶处理数秒至5分钟。在此步骤中，需在光学显微镜下观察细胞，一旦细胞核与胞质分离但仍保持完整结构（例如核仁仍清晰可见且完整），立即终止反应（步骤2.2.11）。
    11. 用50 mM MgCl2/PBS洗涤两次，每次5分钟，以灭活胃蛋白酶。
    12. 在1% PFA/PBS中后固定1分钟。在PBS中洗涤5分钟。在2x SSC中洗涤两次，每次5分钟，然后加入50%甲酰胺/2x SSC，孵育至少30分钟。

3. 3D 多色 DNA FISH 杂交

  1. 在 80 °C 下使探针变性 5 分钟，然后迅速置于冰上。
  2. 将杂交探针加样至洁净的显微镜载玻片上。将带有细胞的盖玻片细胞面朝下覆盖在探针液滴上。
  3. 用橡胶胶水密封盖玻片，待橡胶胶水完全干燥后，将载玻片置于加热块上，在 75 °C 下变性 4 分钟。
    注意：变性时间与温度可适当调整，最高可达 80 °C。
  4. 在漂浮于水浴中的金属盒内，于 37 °C 过夜杂交。
    注意：为提高信噪比，杂交温度可升至 42 °C。
  5. 去除橡胶胶水，将载玻片浸入 2x SSC 溶液中，小心剥离玻璃盖玻片，并转移至 6 孔板中的 2x SSC 溶液内。
  6. 在 37 °C、90 rpm 振荡条件下，于 2x SSC 溶液中洗涤 3 次，每次 5 分钟；随后在 60 °C、90 rpm 振荡条件下，于 0.1x SSC 溶液中洗涤 3 次，每次 5 分钟；最后用 4x SSC/0.2% TWEEN 20 溶液短暂漂洗。

4. 3D 多色 DNA FISH 检测

注意：对于直接标记的探针，跳过步骤 4.1 和 4.2。

  1. 在24孔板中，加入4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% 牛血清白蛋白（BSA），37 °C下封闭20分钟，置于摇床培养箱中，转速为20 rpm。
  2. 加入适当浓度的抗地高辛抗体（1:150）和/或链霉亲和素（1:1,000）（材料表），用4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% BSA稀释，在37 °C黑暗湿润环境中孵育35分钟。
  3. 在6孔板中，用4x SSC/0.2% TWEEN 20于37 °C洗涤3次，每次5分钟，摇床培养箱中转速为90 rpm。
  4. 用PBS平衡后，在24孔板中用2%甲醛/PBS于室温固定2分钟。
    注意：直接标记的探针无需进行后固定。
  5. 用PBS短暂洗涤5次。在室温下用1 ng/mL DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）/PBS染色5分钟。
  6. 用PBS短暂洗涤5次。用抗荧光淬灭封片液（材料表）封片。

5. 三维多色DNA FISH显微镜观察与分析

  1. 使用显微镜系统获取三维图像。
    注意：此处使用的是宽场显微镜，连续光学切片之间的轴向距离为 0.2−0.25 μm（图 1B）。
  2. 使用不同的软件和工具分析三维图像堆栈（本实验中使用 NuCLεD 或三维核接触定位器 Nuclear Contacts Locator in 3D）。
    注意：NuCLεD 工具的开发旨在自动分析荧光细胞图像 z 堆栈中的三维多色 DNA FISH 数据。NuCLεD 可在三维空间中重建细胞图像堆栈中的细胞核，并检测和定位荧光三维斑点。该工具可测量斑点在细胞核内的相对位置（例如，距细胞核质心和/或细胞核边缘的距离）、每个细胞核的最大半径以及斑点间的距离。该工具及其所用算法在 Cortesi 等人16的研究中已有详细描述。
  3. 分析由 NuCLεD 获取的数据（例如，特定基因组位点与细胞核质心之间的三维距离以及接触频率）。
    注意：对于特定基因组位点与细胞核质心之间的三维距离，应将距离值根据每个细胞核的最大半径进行归一化处理，并以归一化距离的频率分布图表示这些数据。在长距离相互作用研究中，预期接触频率范围为 10−20%21，斑点间距离的阈值可能有所变化，通常设定在约 2 µm35。
    1. 为进行统计分析，每份生物学重复样本应分析约 100 个细胞核。将特定基因组位点间的三维距离表示为低于所选阈值距离的累积频率分布，并采用 t-检验评估分布差异的显著性。同时，计算相互作用阳性细胞核（即斑点间距离低于所选阈值距离）的百分比，并使用 Fisher 精确检验评估百分比差异的显著性。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所述的3D多色DNA FISH方法可实现对固定3D细胞核内不同基因组位点的同时可视化（图1B）。该方案可用于测量等位基因之间以及不同基因组位点之间的距离，以评估其空间邻近性，并分析其在细胞核空间中的位置（例如，位点与细胞核中心或边缘的距离）16。然而，针对所使用的每种细胞类型，必须精确且具体地优化多个关键步骤；为确保3D多色DNA FISH实验成功，建议特别关注以下步骤。

在DNA探针制备过程中，需确认探针大小小于<200 bp（图1A）。该尺寸可确保三维多色DNA荧光原位杂交（3D multicolor DNA FISH）实验的成功（图1B）。通过缺口平移法产生的次优DNA FISH探针可能出现部分消化（...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方法介绍了一种在多种人类原代细胞上进行三维多色DNA荧光原位杂交（FISH）的逐步操作方案。尽管DNA FISH技术已被广泛应用，但由于所用样本的特性，许多实验室仍难以在保存完好的三维间期细胞核上成功实施三维多色DNA FISH23，24。

探针切口平移是成功实现三维多色DNA荧光原位杂交（FISH）的关键步骤；该反应可使用多种不同的模板（如BAC、fosmid、质粒、PCR产物），并可根据模板长度相应调整反应时间和酶浓度。适当的探针消化至关重要（图1），探针消化不当（图2）将导致无信号或非特异性信号（图3A）。通透化、去蛋白化和胃蛋白酶消化步骤是极为关键的操作环节，其条件选择高度依赖于所用的细胞类型。对于细胞核较小且细胞骨架含量较低的细胞（例如体外分离...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢意大利米兰国家分子遗传学研究所（Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi"（INGM）成像中心）在3D多色DNA FISH图像采集过程中提供的技术支持，特别感谢C. Cordiglieri的协助。本研究工作获得了以下对B.B.的资助：EPIGEN意大利旗舰项目、法国肌病协会（AFM-Telethon，项目编号18754）以及意大利卫生部青年研究人员项目（GR-2011-02349383）。本研究工作还获得了以下对F.M.的资助：Cariplo基金会（青年项目，项目编号2018-0321）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔板赛默飞世尔科技142475
6孔板赛默飞世尔科技140675
抗地高辛素 488DBADI7488
β-巯基乙醇SigmaM3148
bFGFPeproTech100-18B
Biotin 11 d-UTP赛默飞世尔科技R0081
BSA（牛血清白蛋白）SigmaA7030
盖玻片Marienfeld117500
CY3 d-UTPGE HealthcarePA53022
DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）赛默飞世尔科技D21490
鲑鱼精中的单链脱氧核糖核酸SigmaD7656
硫酸葡聚糖（粉末）圣克鲁斯sc-203917A
地高辛-11-dUTP罗氏11093088910
DMEM赛默飞世尔科技21969-035 500mL
DNA聚合酶I赛默飞世尔科技18010-017
DNase ISigmaAMPD1
dNTPs（C-G-A-T）EurocloneBL0423A/C/G
EGFSigmaE9644.2MG
乙醇Sigma02860-1L
FBS Hyclone赛默飞世尔科技SH30109
甲醛溶液SigmaF8775-25mL
甲酰胺SigmaF9037
谷氨酰胺赛默飞世尔科技25030-024 100 mL
甘油SigmaG5516-100mL
糖原赛默飞世尔科技AM9510
HClSigma30721
人类 Cot-1 DNA赛默飞世尔科技15279-001
胰岛素人SigmaI9278-5 mL
MgCl₂2Sigma63069
NaAc（醋酸钠，pH 5.2，3 M）SigmaS2889
NaClSigmaS9888
多聚甲醛Sigma158127-25G
PBS（磷酸盐缓冲盐水）SigmaP4417
青霉素/链霉亲和素赛默飞世尔科技15070-063 100 mL
胃蛋白酶伯乐（Biorad）P6887
PhasePrep BAC DNA 试剂盒SigmaNA0100-1KT
聚-L-赖氨酸溶液SigmaP8920
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂赛默飞世尔科技P36970
PureLink 快速胶回收 & PCR 纯化组合试剂盒赛默飞世尔科技K220001
PureLink 快速质粒小提试剂盒赛默飞世尔科技K210010
RNase 混合酶赛默飞世尔科技AM2288
橡胶水泥Bostik
载玻片VWR631-0114
链霉亲和素 Alexa Fluor 647赛默飞世尔科技S21374
三水合柠檬酸钠Sigma1110379026
Tris-HClSigmaT3253-500g
Triton X-100SigmaT8787-250mL
TWEEN 20SigmaP9416-100mL

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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