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方法文章

逆行示踪 果蝇 使用亲脂性荧光染料标记胚胎运动神经元

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DOI：

10.3791/60716

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2020年1月12日

 ,  , 
1Department of Cellular Biology, University of Georgia

本文内容

摘要

我们描述了一种逆行示踪的方法 果蝇 使用脂溶性荧光染料标记胚胎运动神经元。

摘要

我们介绍一种逆行标记运动神经元的技术 果蝇我们使用溶解于油中的脂溶性染料，通过显微注射器将微小液滴递送至胚胎肌片标本。凡接触该液滴的运动神经元膜均可被快速标记。单个运动神经元可实现持续标记，从而清晰显示其精细结构。由于脂溶性染料具有多种颜色，该技术还可实现相邻神经元的多色标记。因此，该示踪技术适用于研究运动神经系统中的神经元形态发生及突触连接性 黑腹果蝇.

引言

Drosophila 的胚胎运动神经元系统为研究中枢神经系统（CNS）发育机制提供了一个强大的实验模型1,2,3。该运动神经元系统适用于生化、遗传、成像和电生理学技术，利用这些技术可在单个运动神经元水平上进行遗传操作和功能分析2,4,5,6。

在神经系统早期发育过程中，神经母细胞通过分裂产生大量胶质细胞和神经元。此前已对神经母细胞的去层化过程与其基因表达谱之间的时空关系进行了深入研究7,8,9。以运动神经元系统为例，胚胎期神经肌肉接头（NMJ）的形成已利用aCC（anterior corner cell）、RP2（raw prawn 2）和RP5运动神经元进行了广泛研究2,10。例如，当RP5运动神经元形成新生突触连接时，突触前和突触后的丝状伪足会相互交错11,12,13。这种直接的细胞间通讯对于启动NMJ的形成至关重要。然而，与我们对周围神经分支的了解相反，关于运动神经元树突如何在中枢神经系统（CNS）内启动突触连接的知识仍十分有限。

本报告中，我们介绍了一种通过微毛细管递送脂溶性染料对胚胎中的运动神经元进行逆行标记的技术。该技术使我们能够追踪产卵后15小时（AEL）每个半体节中支配30块体壁肌肉的38个运动神经元14。利用该技术，我们的研究团队已系统研究了多种功能获得性/功能缺失性等位基因15,16,17。我们近期揭示了驱动运动神经元树突连接起始的分子机制，并证明Dscam1-Dock-Pak相互作用决定了aCC运动神经元树突发育的位点17。总体而言，该技术适用于对野生型或突变型品系中任何胚胎期运动神经元进行表型分析，有助于深入理解黑腹果蝇（Drosophila）神经系统的功能结构设计。

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方案

1. 仪器与耗材

  1. 收集胚胎和训练成虫产卵的材料
    1. 通过截断一个50 mL离心管，并在管盖上切开一个孔，将孔径为100 µm的筛网滤器（材料表）置于管体与管盖之间，制备过滤装置。
      注意：也可使用孔径为100 µm的细胞筛（材料表）进行胚胎收集时的过滤步骤。
    2. 根据说明书使用葡萄糖琼脂预混粉（材料表）制备琼脂平板。简要步骤如下：将1包粉末轻轻搅拌加入500 mL室温（RT，23 °C）去离子水（dH2O）中，微波加热至剧烈沸腾。冷却至70−75 °C后，将混合物倒入培养皿（60 mm）。琼脂凝固后，于4 °C保存备用。
    3. 将活性干酵母（材料表）与水混合成糊状，制备酵母糊，并于4 °C保存。
    4. 使用适用于60 mm培养皿的产卵笼（材料表），以保证充足的空气流通。
  2. 解剖针和染料注射微毛细管的制备
    1. 使用内径0.6 mm、外径1.2 mm的同一类型毛细管（材料表）制备染料注射微毛细管和解剖针。用微毛细管拉制仪（材料表）在最大输出电压170 V下以7%的拉力拉制毛细管，形成尖端长度约0.4 cm的锐利针头。
    2. 对于染料注射，使用微毛细管斜面仪（材料表）按照仪器手册中所述的气泡斜面技术对微毛细管进行修整。
      1. 简要步骤：用润湿剂（材料表）浸湿磨具，防止水“拖拽”针尖。将针头固定在微毛细管夹具上，角度为25−30°，并将针尖置于斜面表面距中心约三分之二半径处。在用连接管路的注射器向针内持续通入空气的同时进行研磨，以确保微毛细管内部无玻璃碎屑堵塞。
      2. 使用细头永久性记号笔在微毛细管上标记斜面处理后尖端开口的位置，因为该开口以一定角度形成，难以直接观察其狭窄的开口位置。

2. 胚胎收集的准备工作

  1. 为了获得理想的卵收集效果，需确保成年果蝇（20−40只野生型Canton-S或white果蝇，雌雄均有）处于年轻（<7天）且健康的状态。
    注意：为了促进产卵，应在卵收集前数天将果蝇置于卵收集笼中进行训练，每天至少在涂有酵母糊的琼脂平板上放置一次。

3. 胚胎分期

  1. 让果蝇在室温下产卵过夜（或至少15小时），以收集15小时龄胚胎（AEL），即16期18，用于观察aCC和RP3运动神经元的树突发育。早晨时，收集带有卵的培养皿。
    注意：15小时龄的胚胎将具有明显的四腔肠道18。如需观察不同发育阶段，请依据其特定的形态学标准和培养条件进行。
  2. 为收集胚胎，使用50%次氯酸钠溶液对培养皿上的卵处理5分钟以去除卵壳。
  3. 一旦卵壳被清除，将培养皿中的内容物倒入过滤装置或细胞筛中，以分离胚胎。使用洗瓶中的水稀释残留于培养皿中的次氯酸钠，并通过倾倒混合液至滤膜上，尽可能多地收集胚胎。
  4. 在滤膜上用清水冲洗胚胎3–4次，或直至次氯酸钠气味完全消失。将滤膜从装置上取下，用水将胚胎冲洗至另一干净培养皿中。倾去盛有胚胎的新培养皿中的水分。
  5. 准备一块载玻片，在其中心覆盖两层乙烯基胶带，形成一个矩形区域。用刀片在胶带上切割出一个矩形凹槽。在凹槽的上端贴一条细的双面胶带，胚胎将被放置于此处，如图1所示。
  6. 使用精细镊子，单独挑选5–10个15小时龄的胚胎，将其背侧朝上放置于双面胶带上。向解剖凹槽中加入昆虫林格氏液19，以防止胚胎干燥（图1）。

4. 解剖与染色

  1. 在解剖显微镜下（材料表），使用玻璃针从胚胎后端至前端沿其表面中线切开。然后将胚胎从胶带上的卵黄膜中拉出并置于载玻片上（图1 中标出区域）。注意不要损伤胚胎内部组织。
  2. 将上皮组织从中部翻起，并将表皮边缘贴附于载玻片表面（图1，插图）。
  3. 使用连接毛细管、尖端开口约 300 µm 的针头（通过折断解剖针的细尖端制备），吸取或吹入空气以分离并移除背侧纵行气管干及任何残留的肠道组织。
  4. 用含 4% 多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下固定胚胎 5 分钟。随后用 PBS 洗涤胚胎 3 次。
  5. 将 1 µL 与 Cy3 染料偶联的抗辣根过氧化物酶抗体（anti-HRP Cy3）（材料表）加入 200 µL PBS 中，孵育胚胎 1 小时进行染色。染色后用 PBS 洗涤 3 次。
    注意：可根据所选用的脂溶性染料种类调整 anti-HRP 所使用的荧光染料。

5. 注射微量移液管的填充

  1. 使用前，将亲脂性染料（DiO 或 DiD，5 mg/mL，材料表）在乙醇与植物油按 1:10 混合的溶液中加热至 60 °C。
  2. 准备用于注射移液管的溶于油的染料载玻片。将移液管放入毛细管固定器中（图 2，#1）。使用显微操作器（Table of Materials），调节移液管位置使其位于染料载玻片上方。然后调节载物台，将移液管置于染料上（图 2，#2）。
  3. 使用显微注射仪（Table of Materials）（图 2，#3）填充移液管。通过设定 Pi（注射压力）为 200−500 hPa（百帕），Ti（注射时间）为 0.1−0.5 s，Pc（补偿压力）为 0 hPa，持续 5 分钟，使染料进入移液管（图 2，#4）。
  4. 染料吸入完成后，移除染料载玻片，并将样品放置于显微镜载物台上。随后，在将移液管插入样品前，将 Pc 提高至 20−60 hPa，以防止毛细作用导致 PBS 被污染。

6. 神经元染料注射

  1. 使用10倍物镜的显微镜（材料表）将胚胎置于视野中央，并使微量移液管与胚胎对齐。
    注意：染料液滴的大小可通过调节Pi或微量移液管尖端开口的尺寸来控制。液滴直径应为10−20 µm，约等于一条肌肉的宽度。
  2. 将物镜更换为水浸式40倍物镜（材料表），并将镜头浸入PBS中以观察胚胎。
    1. 使用荧光显微镜观察由抗-HRP Cy3标记的神经元形态，并确定注射位点。
    2. 注射过程中使用明场显微镜观察染料液滴。当胚胎处于清晰对焦状态时，调整微量移液管的位置，使其尖端轻柔接触目标轴突（例如aCC、RP3）。
    3. 在aCC或RP3神经肌肉接头处的右侧腹段（A2−A6）半节段，使用DiD或DiO染料进行染料滴注（图3），并依据抗-HRP Cy3标记的神经元定位。通过手控装置（鼠标；图2，5）释放染料，在滴注完成后利用显微操作器移开微量移液管，然后进入下一个注射位点。
      注意：与其他可通过缝隙连接扩散至邻近细胞的染料（如荧光黄、钙黄绿素）不同，脂溶性染料会结合于细胞膜，不会转移至相邻细胞。然而，由于染料液滴相对较大，该技术也会导致配对肌肉被标记（图3A）。
  3. 染料滴注后，在室温下孵育样品1小时再进行成像。
    注意：在封片前可在此处暂停实验流程，样品可在4 °C下保存过夜。如有现成的细胞内直流（DC）放大器，也可采用电泳法递送脂溶性染料20。

7. 使用共聚焦显微镜进行成像

  1. 使用镊子将玻璃载玻片上的双面胶带和乙烯基胶带移除。
  2. 准备盖玻片（22 × 22 mm2，No.1 盖玻片），在四个角上涂抹少量真空脂（材料表），然后小心地将其放置在样品上，避免产生气泡。使用擦拭纸去除多余的 PBS。
  3. 轻压盖玻片，以调节物镜与样品之间的工作距离。用指甲油完全密封盖玻片的边缘。
  4. 使用共聚焦显微镜在 10 倍和 100 倍放大倍数下进行成像。
  5. 使用 ImageJ 软件处理显微镜获取的原始图像（材料表）。
    注意：为获得最佳图像，必须在封片后 10 分钟内开始观察。否则，在室温下，染料会扩散至注射部位邻近区域，导致成像背景干扰。为减缓染料扩散，样品可在 4 °C 下保存数小时。

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结果

aCC和RP3运动神经元的代表性图像如图所示 图3C 用于展示15小时AEL时运动神经元的多色标记。胚胎间的树突形态基本一致。抗HRP抗体的染色模式以灰色显示。分别在肌肉1或肌肉6/7的神经肌肉接头处沉积少量DiO或DiD染料。 图4 展示了定量测量目标表型的能力。我们统计了野生型与突变型（例如， dscam1-/-).

胚胎解剖装置；乙烯基胶带；双面胶带；已解剖胚胎；玻璃载片；实验。
图1：解剖槽的装置示意图。 玻璃载片上所见的蓝色区域由乙烯基胶...

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讨论

与基因细胞标记技术相比，使用染料标记研究神经元形态具有多项优势。染料标记技术可最大限度地缩短标记和成像运动神经元形态所需的时间。该染料标记过程非常快速，耗时不到2小时，即可清晰界定神经元投射的轮廓。作为替代方法，可选择在aCC中表达酵母GAL4转录因子的GAL4品系，并将其与受上游激活序列（UAS）调控的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因品系进行杂交，从而实现aCC运动神经元的可视化21。此类GFP标记技术需要进行遗传杂交，因此需额外耗费数天时间。

染料标记的另一个优势是能够以极高的密度对质膜进行标记。脂溶性染料可以在膜的每一部分达到足够高的密度，从而使我们能够分辨出标记结构的精细细节。相比之下，GFP分子的密度通常取决于UAS-GAL4系统启动后的等待时间。例如，aCC从孵化后10小时开始表达GFP，而在孵化后15小时我们观察时，GFP分子的密度仍不足以覆盖整个细胞膜，导致神经元精细突起的标记不充分（D.K.，未发表数据）。

尽管该技术具有多项优势，但在运动轴突投射出现明显错误的情...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢神山实验室成员对本文稿的评论。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 NS107558 项目资助（资助对象：M.I.、K.B. 和 D.K.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10倍物镜NikonPlan
40倍水浸物镜NikonNIR Apo
毛细玻璃管Frederick Haer&Co27-31-1
共聚焦显微镜AndorN/ADragonfly Spinning disk 共聚焦成像系统
盖玻片Corning22x22 mm 方形 #1
DiDThermoFisherV22886
DiIThermoFisherV22888
DiOThermoFisherV22887
体视显微镜NikonN/ASMZ-U
双面胶带Scotch665
道康宁高真空润滑脂Fisher Sci.14-635-5D
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11252-20
果蝇产卵笼FlyStuff59-100
FemtoJet 5247Eppendorf已停产FemtoJet 4i (货号 5252000021)
ImageJNIH图像处理软件
显微操作仪SutterMP-225
微电极斜面抛光仪SutterBV-10-B
拉针仪NarishigePC-100
果蝇营养培养基（葡萄糖琼脂预混粉）FlyStuff47-102
尼龙网滤膜Millipore
16% 多聚甲醛溶液，电镜级Electron Microscopy Sciences15710任何电镜级产品均可
PBSRoche11666789001可在 sigmaaldrich 购买，盒装 10x 溶液
Photo-Flo 200Kodak146 4510润湿剂
正置荧光显微镜NikonN/AEclipse Ci 配备 LED 光源
乙烯基电工胶带Scotch6143
VWR 细胞筛VWR10199-659
酵母粉FlyStuff62-103活性干酵母（RED STAR）

参考文献

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