逆行示踪 果蝇 使用亲脂性荧光染料标记胚胎运动神经元

摘要

我们描述了一种逆行示踪的方法 果蝇 使用脂溶性荧光染料标记胚胎运动神经元。

摘要

我们介绍一种逆行标记运动神经元的技术 果蝇我们使用溶解于油中的脂溶性染料，通过显微注射器将微小液滴递送至胚胎肌片标本。凡接触该液滴的运动神经元膜均可被快速标记。单个运动神经元可实现持续标记，从而清晰显示其精细结构。由于脂溶性染料具有多种颜色，该技术还可实现相邻神经元的多色标记。因此，该示踪技术适用于研究运动神经系统中的神经元形态发生及突触连接性 黑腹果蝇.

引言

Drosophila 的胚胎运动神经元系统为研究中枢神经系统（CNS）发育机制提供了一个强大的实验模型^1,2,3。该运动神经元系统适用于生化、遗传、成像和电生理学技术，利用这些技术可在单个运动神经元水平上进行遗传操作和功能分析^2,4,5,6。

在神经系统早期发育过程中，神经母细胞通过分裂产生大量胶质细胞和神经元。此前已对神经母细胞的去层化过程与其基因表达谱之间的时空关系进行了深入研究^7,8,9。以运动神经元系统为例，胚胎期神经肌肉接头（NMJ）的形成已利用aCC（anterior corner cell）、RP2（raw prawn 2）和RP5运动神经元进行了广泛研究^2,

方案

1. 仪器与耗材

1. 收集胚胎和训练成虫产卵的材料
   1. 通过截断一个50 mL离心管，并在管盖上切开一个孔，将孔径为100 µm的筛网滤器（材料表）置于管体与管盖之间，制备过滤装置。
      注意：也可使用孔径为100 µm的细胞筛（材料表）进行胚胎收集时的过滤步骤。
   2. 根据说明书使用葡萄糖琼脂预混粉（材料表）制备琼脂平板。简要步骤如下：将1包粉末轻轻搅拌加入500 mL室温（RT，23 °C）去离子水（dH₂O）中，微波加热至剧烈沸腾。冷却至70−75 °C后，将混合物倒入培养皿（60 mm）。琼脂凝固后，于4 °C保存备用。
   3. 将活性干酵母（材料表）与水混合成糊状，制备酵母糊，并于4 °C保存。
   4. 使用适用于60 mm培养皿的产卵笼（材料表），以保证充足的空气流通。
2. 解剖针和染料注射微毛细管的制备
   1. 使用内径0.6 mm、外径1.2 mm的同一类型毛细管（材料表）制备染料注射微毛细管和解剖针。用微毛细管拉制仪（材料表）在最大输出电压170 V下以7%的拉力拉制毛细管，形成尖端长度约0.4 cm的锐....

结果

aCC和RP3运动神经元的代表性图像如图所示 图3C 用于展示15小时AEL时运动神经元的多色标记。胚胎间的树突形态基本一致。抗HRP抗体的染色模式以灰色显示。分别在肌肉1或肌肉6/7的神经肌肉接头处沉积少量DiO或DiD染料。 图4 展示了定量测量目标表型的能力。我们统计了野生型与突变型（例如， dscam1^-/-).

图1：解剖槽的装置示意图。 玻璃载片上所见的蓝色区域由乙烯基胶.......

讨论

与基因细胞标记技术相比，使用染料标记研究神经元形态具有多项优势。染料标记技术可最大限度地缩短标记和成像运动神经元形态所需的时间。该染料标记过程非常快速，耗时不到2小时，即可清晰界定神经元投射的轮廓。作为替代方法，可选择在aCC中表达酵母GAL4转录因子的GAL4品系，并将其与受上游激活序列（UAS）调控的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因品系进行杂交，从而实现aCC运动神经元的可视化²¹。此类GFP标记技术需要进行遗传杂交，因此需额外耗费数天时间。

染料标记的另一个优势是能够以极高的密度对质膜进行标记。脂溶性染料可以在膜的每一部分达到足够高的密度，从而使我们能够分辨出标记结构的精细细节。相比之下，GFP分子的密度通常取决于UAS-GAL4系统启动后的等待时间。例如，aCC从孵化后10小时开始表达GFP，而在孵化后15小时我们观察时，GFP分子的密度仍不足以覆盖整个细胞膜，导致神经元精细突起的标记不充分（D.K.，未发表数据）。

尽管该技术具有多项优势，但在运动轴突投射出现明显错误的情.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10倍物镜	Nikon		Plan
40倍水浸物镜	Nikon		NIR Apo
毛细玻璃管	Frederick Haer&Co	27-31-1
共聚焦显微镜	Andor	N/A	Dragonfly Spinning disk 共聚焦成像系统
盖玻片	Corning		22x22 mm 方形 #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
体视显微镜	Nikon	N/A	SMZ-U
双面胶带	Scotch	665
道康宁高真空润滑脂	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11252-20
果蝇产卵笼	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	已停产	FemtoJet 4i (货号 5252000021)
ImageJ	NIH		图像处理软件
显微操作仪	Sutter	MP-225
微电极斜面抛光仪	Sutter	BV-10-B
拉针仪	Narishige	PC-100
果蝇营养培养基（葡萄糖琼脂预混粉）	FlyStuff	47-102
尼龙网滤膜	Millipore
16% 多聚甲醛溶液，电镜级	Electron Microscopy Sciences	15710	任何电镜级产品均可
PBS	Roche	11666789001	可在 sigmaaldrich 购买，盒装 10x 溶液
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	润湿剂
正置荧光显微镜	Nikon	N/A	Eclipse Ci 配备 LED 光源
乙烯基电工胶带	Scotch	6143
VWR 细胞筛	VWR	10199-659
酵母粉	FlyStuff	62-103	活性干酵母（RED STAR）