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澄清与成像 白色念珠菌 生物膜

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DOI：

10.3791/60718

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2020年3月6日

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1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University, 2Department of Pharmacology, Second Military Medical University

本文内容

摘要

观察和量化内部特征 白色念珠菌 生物膜，我们制备经过固定的完整样本，并通过折射率匹配使其透明化。随后，可利用光学切片显微技术对生物膜的整个厚度进行三维成像，获取三维图像数据。

摘要

微生物真菌Candida albicans可从共生定植转变为致病状态，这一过程与其从酵母形态生长向菌丝形态生长转换的能力密切相关。启动该过程的细胞会黏附于表面以及彼此之间，进而形成生物膜菌落。这种情况不仅常见于酵母感染中的黏膜组织表面，也出现在导管等医疗植入物上。众所周知，生物膜中的细胞对抗真菌药物具有耐药性，且从生物膜脱落的细胞可导致危险的全身性感染。由于折射率的异质性，生物膜的透明度从高度半透明到不透明不等，因此难以通过光学显微镜对其进行研究。为了观察其内部结构、细胞及亚细胞特征，我们采用逐步溶剂置换法对固定完整的生物膜进行透明化处理，使其达到最佳的折射率匹配状态。对于C. albicans生物膜，使用水杨酸甲酯（n = 1.537）即可实现充分透明化，从而在600 µm厚的生物膜中从顶端到底部进行共聚焦显微观察，且信号衰减极小。在本可视化实验方案中，我们详细阐述了相衬折射率测定、实验室生物膜的培养、固定、染色、溶剂置换、共聚焦荧光显微镜的设置以及典型实验结果。

引言

Candida albicans 是一种通常在人体内共生的微生物真菌。该生物体具有多种形态，因此在生物学上具有重要研究价值。例如，作为对某些环境信号或应激因素的响应，酵母形态的出芽细胞会转变为丝状生长形式，形成由高度伸长的细胞组成的有隔菌丝链，即菌丝。这种形态转换是单细胞与多细胞基因表达程序之间表型变化的一个典型实例，具有重要意义。同样，C. albicans 也具有重要的生物医学研究价值，因为该生物体是一种著名的机会性病原体。它可引起黏膜酵母菌感染，如鹅口疮（口腔念珠菌病）、泌尿生殖系统感染，并可在免疫功能低下患者中导致危险的侵袭性或系统性感染。

该生物的致病潜力与其多种形态型及其他遗传可塑性特征密切相关1,2,3,4。芽管延伸是向菌丝生长转变的第一个可见阶段，其发生速度足以使被吞噬的 C. albicans 细胞突破吞噬细胞，从而逃避免疫宿主的细胞免疫应答早期阶段5。此外，菌丝形成之前及过程中，细胞间和细胞与表面之间的黏附性显著增强，这归因于一类被称为黏附素的细胞壁蛋白的调控表达6,7,8,9。在多种条件下，黏附与菌丝形成的联合作用导致生长模式从浮游的单细胞状态显著转变为与表面相关的集落生长，进而形成生物膜。C. albicans 生物膜可在常见的植入性医疗器械（如静脉导管）上发育。当此类生物膜开始出芽并释放酵母样细胞进入血液循环时，可能引发播散性感染。多项研究表明，与浮游细胞相比，生物膜中的细胞对抗真菌药物具有更强的耐药性10,11，这可能部分归因于代谢水平的降低12。此外，生物膜整体的高黏附性可能为菌丝向宿主组织内高效侵袭性生长提供所需的锚定作用1。

通过折射率匹配实现对C. albicans生物膜的光学透明化，极大地提升了我们观察该微生物群落结构的能力，并有助于发现基因表达与表型之间的关系。在实验室条件下，在测试表面的液体培养基中培养48小时后，生物膜呈现为一层致密且较厚的灰白色涂层，足以导致其不透明（图1）。因此，许多有趣的生物膜表型特征无法被直接观察。在37 °C条件下，使用YPD、RPMI-1640或Spider培养基培养24小时的野生型生物膜厚度可达300 µm，而48小时的生物膜厚度通常可达500 µm。这种不透明性源于光散射，其本质是折射率的不均一性：真菌细胞壁的折射率高于周围培养基，而细胞质的折射率又略高于细胞壁。因此，天然生物膜具有很高的光学密度，使用普通显微镜甚至共聚焦扫描显微镜观察时，深度超过30 µm的结构均被遮蔽（图2）。然而，通过将固定后的生物膜浸润于折射率较高的液体中，使其折射率大致匹配细胞主要组分的折射率，即可实现显著的透明化效果。透明化处理后，几乎任何C. albicans生物膜的整个厚度均可通过共聚焦显微镜以亚微米分辨率进行成像13。在野生型样本中可以清晰地观察到，生物膜由长而缠绕的菌丝、出芽酵母样细胞或假菌丝细胞的聚集体、空腔区域以及一定量的胞外基质组成。此外，生物膜通常具有分层结构，表现出细胞类型、细胞密度以及出芽或分支细胞分布上的空间异质性。在突变株形成的生物膜中，上述一个或多个特征的多种变异已被观察到14,15。此外，报告基因菌株还显示出基因表达在空间上的原位差异16,9,13。这种相对简单且成本较低的方法所能达到的惊人透明化程度，还使得人们能够观察到许多生物膜中存在顶端菌丝和基底侵袭性菌丝，其延伸距离可达毫米级。

在本可视化实验方案中，我们演示了使用一种简单的细胞壁标记物作为染料，对C. albicans生物膜进行固定、标记、透明化和成像的步骤。本方案当前版本的来源是我们在观察到经甲醛固定的生物膜浸入97%乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA）后，其透明度显著提高：GMA随后发生聚合，将生物膜包埋于一种折射率中等偏高（n = 1.49）的硬质塑料中。接着，我们采用常规相差显微镜，并结合一系列已知折射率的参照液体，更准确地测定生物膜的对比度反转点（即最大透明度）（图3）。对于C. albicans生物膜而言，该点出现在折射率接近n = 1.530处，这一数值出乎意料地高，因为像毛发角蛋白这类致密蛋白质结构的折射率也仅为1.54–1.55。尽管该值位于图3所示最佳范围的上限，我们仍在本方案中选用了水杨酸甲酯（冬青油，n = 1.537），因其长期以来已被广泛用于胚胎学与组织学显微观察中的透明化处理，具有低毒性和低蒸气压的优点，且在我们使用中等数值孔径油浸物镜的试验中表现出优异的成像效果。

此处应说明四点：

（1）除了少数例外情况，显微镜观察的理想状况是，样品的折射率应等于物镜浸没液的折射率17,18,13。对于需要深层聚焦的三维（3D）成像研究，这一点始终至关重要。

（2）我们实验测得的最佳透明化折射率（n = 1.525–1.535）略高于标准浸油（n = 1.515，1.518），因此违反了条件（1），在使用标准油浸物镜时会引入球面像差的来源。解决该问题的一种方法是使用专为较高折射率范围设计的物镜。由于对透明化样本成像的兴趣重新兴起，具备所需校正功能的特种物镜正逐渐上市。另一种解决方案是通过添加少量丁醇（n = 1.399），将透明介质的折射率下调至1.515或1.518，以实现最佳油浸成像性能，但需接受清晰度略有下降的结果。

（3）对完整生物膜（以及此尺度的其他样品）进行显微观察时，需要较大的工作距离以容纳样品的厚度，这是一个重要的实际考虑因素。较长的工作距离使光学系统仅能采用中等数值孔径（NA = 0.6–1.25），这虽然限制了分辨率，但同时也减轻了球面像差的严重程度。

（4）对于其他类型的固定样本，透明处理的最佳折射率可能有所不同。应使用相差显微镜和一系列折射率参比液体对样本进行相应测试，如图3所示。

方案

1. 生物膜培养物的培养

注意：Candida albicans 是一种人类病原体。在某些机构，培养该生物体需要在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。

  1. 将筛选的菌株划线接种于酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）琼脂平板上，在30 °C下培养48小时。
  2. 从平板上挑取单菌落，接种至含有5 mL YPD培养基的15 mL培养管中，在30 °C下于旋转摇床（转速52–55 rpm）中进行过夜好氧培养。
  3. 使用过夜培养物进行40至50倍稀释后测定细胞密度。计算所需稀释倍数，使细胞密度达到硅基质表面为3 × 106 个细胞/mL，或刀豆蛋白A（ConA）或麦芽凝集素（WGA）处理的盖玻片表面为0.6–1.2 × 106 个细胞/mL（见讨论部分）。
  4. 在12孔板中进行生物膜培养（图1），每孔加入2.0 mL无菌菌丝化培养基，并将培养板置于37 °C湿化培养箱中预热。多种培养基均可诱导菌丝化，尤其在较高温度（37 °C）并添加血清时效果更显著。推荐使用胎牛血清（FBS）。推荐培养基包括YPD、Spider-Mannitol或RPMI-1640。
  5. 用无菌镊子将预先准备好的基质放入已预热的培养板各孔中，并去除气泡。将过夜培养的接种物加入各孔，使细胞密度达到步骤1.3中推荐的浓度。设一孔不接种作为视觉空白对照，以检测污染情况。
  6. 将培养板置于37 °C湿化空气培养箱内的60 rpm轨道摇床上，孵育90分钟以促进细胞黏附。90分钟后，移除培养基和未黏附的细胞，用无菌培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后将已接种的基质转移至含有预热菌丝化培养基的培养皿或另一多孔板中。使用多孔板时，可方便地使用第二个板进行洗涤步骤，并用第三个板（每孔含2.0 mL预热培养基）接收洗涤后的接种基质。每次转移前均需对镊子进行灭菌处理。
  7. 将培养板放回37 °C湿化空气培养箱中，在60 rpm轨道振荡条件下继续培养生物膜，最长可达48小时，以保证充分通气。在此过程中，各培养孔中应几乎无浮游生长，除非发育中的生物膜正在脱落酵母形态细胞。以此方法培养的生物膜如图1所示。

2. 成像样本处理

注意：醛类固定剂具有挥发性和危险性。应在通风橱中配制固定剂稀释液，不得在生物安全柜中操作。切勿将固定剂放入用于活细胞培养的孵育箱中。使用稀释后的固定剂时，应在通风橱或通风良好的台面上以加盖的培养皿进行操作。固定剂及固定后洗涤液应作为危险废物妥善处置。

  1. 配制新鲜的固定液，即含4%甲醛或聚甲醛的PBS溶液，可选择性地加入最多2%的戊二醛。常规工作可使用稀释至4%的福尔马林溶液。
    注意：特别是戊二醛会增加宽带自发荧光，并可能减弱可表达荧光标签（如dTomato）的荧光信号。
  2. 从样品中移除培养基，并用PBS替换，以稀释去除血清蛋白；或将附着于基质上的生物膜转移至PBS中，处理数分钟。
  3. 将样品转移至固定液中，将加盖的培养皿置于缓慢旋转混合仪上固定20分钟。处理较厚样品时应适当延长固定时间（见讨论）。每个培养皿中应加入足量固定液，确保完全浸没所有生物膜生长区域，包括培养皿内壁上的部分。
  4. 移除固定液，并用PBS重新充满培养皿以洗去残留固定剂。将废弃固定液作为危险废物处理。重复进行数次短时间洗涤，随后进行较长时间洗涤，以便残留固定剂从生物膜或琼脂块中充分扩散出来。洗涤时间取决于固定时间（见讨论）。
  5. 所需染色剂量取决于生物膜的量。染色前应清除培养皿非目标区域的所有生物膜，或在染色前将固定的样品转移至新的培养皿中。切勿让生物膜排液或干燥。  始终保持其浸没于PBS中。
  6. 向培养皿中加入染料（见讨论），加盖后置于缓慢旋转混合仪上过夜孵育（见讨论）。避光保存。
  7. 次日早晨，移除染色液，并用PBS重新充满培养皿以稀释未结合的染料。将培养皿置于缓慢旋转混合仪上脱色数小时。

3. 澄清方案：非渗透性基质上的生物膜

  1. 澄清后的生物膜在视觉上难以分辨。因此，如有需要，可用划痕标记每个基质的一侧，以标明接种面。
  2. 所有后续的废液和溶剂转移操作均应使用标记过的长口巴斯德吸管，以避免溶剂之间的交叉污染。
  3. 用镊子将固定后的生物膜从 PBS 转移至含有 5 mL 50:50 PBS:甲醇的 20 mL 玻璃小瓶中，使生物膜朝上。以轨道振荡方式手动混匀，每 1 分钟摇动一次，持续 5 分钟（见讨论部分）。
  4. 将溶剂转移至废液瓶中，注意避免吸管与生物膜接触，或生物膜与小瓶发生接触。轻柔地重新加入 3 mL 纯甲醇。以轨道振荡方式手动混匀，每 1 分钟摇动一次，持续 3 分钟。
  5. 将溶剂转移至废液瓶中，立即重新加入 5 mL 甲醇。以轨道振荡方式手动混匀，每 1 分钟摇动一次，持续 5–10 分钟。随后将溶剂转移至废液瓶中，立即重新加入 3 mL 甲醇。此时生物膜通常比初始状态显得更不透明。
  6. 将溶剂转移至废液瓶中，立即向小瓶中重新加入 5 mL 50:50 甲醇:水杨酸甲酯混合溶剂。以轨道振荡方式手动混匀，每 1 分钟摇动一次，持续 5–10 分钟。在此混合溶剂中，生物膜应呈现半透明状态。
  7. 将溶剂转移至废液瓶中。轻柔地向小瓶中重新加入 3 mL 纯水杨酸甲酯（MS）。以轨道振荡方式手动混匀，每 1 分钟摇动一次，持续 3 分钟。
  8. 将溶剂转移至废液瓶中，立即重新加入 5 mL 纯 MS。以轨道振荡方式手动混匀，每 1 分钟摇动一次，持续 5–10 分钟。此时生物膜应变为透明。将溶剂转移至废液瓶中，立即向小瓶中重新加入 3 mL 纯 MS。处理后的生物膜在此溶剂中保持稳定。
  9. 对于生长在琼脂上的生物膜（见讨论部分），应延长所有溶剂交换的时间，以允许水和溶剂充分扩散穿过琼脂。可通过低倍解剖显微镜结合暗场照明观察溶剂在琼脂中的推进情况，从而估算所需时间。当使用 2% 琼脂时，该方案可实现良好的澄清效果且无明显收缩现象，但在用镊子操作时若挤压会导致澄清后的琼脂发生凝聚。建议使用刮铲进行操作。

4. 共聚焦显微镜成像设置

  1. 以下步骤适用于倒置显微镜的使用。使用带有盖玻片底部且耐溶剂的培养皿，将倒置样品固定在显微镜载物台上（见讨论部分）。
  2. 准备用于支撑倒置样品的垫片。可使用从载玻片（1,000 μm 厚）、盖玻片（170 μm）或 13 mm 硅胶环（330 μm，参见材料表）上裁剪的小矩形，必要时可堆叠使用。将硅胶环预先在水杨酸甲酯中浸泡 1 小时，以尽量减少因溶胀引起的焦距漂移。
  3. 对于生长在医用级硅胶片上的生物膜，将其倒置（即生物膜朝下），放置于培养皿中水杨酸甲酯液滴内的垫片上（图2）。确保样品下方无气泡产生。
  4. 将培养皿牢固地安装在显微镜载物台上，并使物镜通过浸油实现浸没接触（见讨论部分）。
  5. 调节培养皿中水杨酸甲酯（MS）的量，使弯月面通过表面张力将样品牢固压在垫片上。在倒置的基底表面滴加一滴 MS，以减少因表面粗糙造成的光散射，并用玻璃盖板覆盖培养皿以减少蒸发。成像前等待数分钟，使样品稳定沉降到垫片上。
  6. 使用透射光目视检查视野，确定当前焦平面相对于倒置生物膜顶端和基底区域的位置。将聚光镜照明数值孔径（INA）调至最小（关闭聚光镜光圈），以提高对比度，否则透明化的生物膜几乎不可见。操作完成后，关闭透射光源。
  7. 切换至共聚焦荧光模式，设定串行聚焦图像堆栈的上下限，以完整覆盖生物膜厚度。推荐采用向上的焦距驱动步进方式，该方式首先会显示已脱落并沉降在盖玻片上的细胞以及接触玻璃的较长顶端菌丝。在序列的最上方，应能观察到附着在基底上的始祖细胞，位于生物膜底部。根据讨论部分所述的一般准则，设置针孔直径、图像平面内的像素间距以及焦距步进增量。

结果

生物膜，例如 图1 呈半透明至不透明状，但通常可采用上述方案进行透明化处理并成像。 图2 显示在 PBS 中固定的生物膜随聚焦深度增加而出现荧光显著衰减，与经折射率匹配后的同一生物膜相比。如图所示 图3通过使用折射率递增的连续互溶溶剂，可快速估算透明度的最大值。再结合常规相差显微镜观察，进一步确定对比度最低（即透明度最高）的点。显然，这种最佳状态并非通过均一折射率匹配实现，因为细胞内不同亚细胞结构的折射率存在微小差异。在此情况下，细胞壁的对比度反转出现在略低于细胞质的溶剂折射率条件下。对于 白色念珠菌 生物膜中，最适值接近 n = 1.530。野生型48 h及 cak1 DX突变体生物膜在 图 4A 是 500 µm 厚度上，但基部的酵母细胞成像清晰度几乎与顶端细胞相当。同样，如图所示 图 4C，荧光衰减与焦点深度之间未表现出强相关性。 图5 在琼脂中显示侵入性菌丝，位于表面生物膜下方数百微米处。成熟的侵入性菌丝在菌丝链的隔膜附近持续产生侧向出芽的酵母细胞，沿侵入性菌丝规律性地形成酵母样细胞的亚克隆群体。

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图1： 澄清前的生物膜培养物。 白色念珠菌（C. albicans）互补型 efg1 ∆/∆ 菌株在含10%胎牛血清的RPMI-1640液体培养基中，于12孔板内的硅胶片上培养24小时形成的生物膜。C4孔为无菌空白对照。  插图为在相同培养基中于6孔板的3.75 mm琼脂基质上培养96小时的野生型生物膜的切割横截面，显示侵入性菌丝。两个图像采用相同比例尺。比例尺 = 2.0 mm。 请点击此处查看该图的高清版本。

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图 2： 通过折射率匹配改善深层成像。 该图显示了固定并用 ConA-Alexafluor 594 染色的 48 小时野生型生物膜的共聚焦图像堆栈的侧视投影。（A）使用 63× 1.0 NA 直接水浸物镜在 PBS 中对样品进行成像，在焦深 30 μm 处衰减严重。（B）经过步骤 3.3–3.8 的透明化处理后，使用 40× 0.85 NA 油浸物镜在水杨酸甲酯中对同一生物膜进行成像，衰减极小。经过背景扣除和三维图像堆栈的侧视投影后，将 40× 数据在空间上重缩放，以与 63× 数据进行比较。（C）示意图显示将透明化后的样品（来自 MS）转移至黑色阳极氧化铝培养皿中，并通过封片胶将盖玻片封底，实现倒置安装（参见讨论部分）。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3： 相差折射率测定法显示，在最佳折射率匹配范围内，细胞结构出现对比度反转现象。 载玻片上的固定生物膜依次从PBS置换至甲醇，再置换至二甲苯（n = 1.496）。随后将这些生物膜逐一从二甲苯置换至一系列折射率参比液体（Series E，Cargille Laboratories，参见材料表），并进行并列目视观察，以确定获得最高透明度的折射率范围。（上图）相差图像：将一份生物膜在二甲苯与该范围内的一组窄区间参比液体之间依次置换。每次置换后，重新定位同一视野，并使用40倍0.85 NA Ph2油浸相差物镜与Ph2聚光镜透过盖玻片进行观察。所有图像均采用相同的光源设置和相机曝光条件采集，以准确反映变化情况。随着折射率升高，细胞壁在n = 1.530时首先出现对比度反转，随后细胞质在n = 1.535时出现对比度反转。比例尺 = 10 μm。（下图）图表显示在最大透明度时生物膜平均亮度达到最低值。生物膜内部强烈的光散射导致其平均亮度高于空白视野。孤立的细胞比空白视野更暗，直至在1.530–1.535范围内发生对比度反转。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4： 突变型与野生型 C. albicans 生物膜的深层成像。 将野生型菌株（DAY185）和细胞周期相关蛋白激酶表达降低的菌株（cak1 DX）14 在液体YPD培养基中的硅胶基质上于37 °C培养48小时。生物膜经固定后，用ConA-Alexafluor 594染色，并通过溶剂交换法透明化处理至水杨酸甲酯中。三维共聚焦显微镜显示，两种生物膜厚度均约为500 μm。图像数据在ImageJ或Fiji软件（https://imagej.nih.gov/ij/ 或 http://fiji.sc）中转换为32位格式，随后使用减去背景功能（滚动球半径设为50像素），对负值像素进行阈值化设为零，进行重新切片，并采用最大强度投影生成侧视图。（A）轴向与侧视投影：侧视投影显示，野生型生物膜厚度达502 μm，基于558层共聚焦图像堆栈。比例尺 = 100 μm（左侧图板）。从顶端（上）到底部（下）的40层轴向投影显示了生物膜不同层次中细胞类型的差异。该示例展示了典型的野生型结构：基底层的黏附细胞产生菌丝，向上延伸形成由假菌丝和酵母样细胞构成的致密中层区域。在中层以上，菌丝再次出现并产生出芽酵母细胞簇。在顶端区域观察到的长菌丝在活体生物膜中可能延伸至培养基中，但在样本处理过程中折叠至生物膜表面。cak1 DX突变型生物膜的厚度为500 μm，由556层图像堆栈的侧视投影可见。该突变体已知在缺乏诱导性应激条件下仍可进行丝状生长14，其形成的结构显著不同。如侧视图和轴向投影（右侧图板）所示，大量分枝细胞形成了辐射状的外生结构。（B）cak1 DX生物膜内分枝菌丝的示例。比例尺 = 10 μm。（C）通过屏蔽背景像素，然后计算每幅图像平面中所有非背景像素的平均数字信号，定量分析透明化处理后的野生型生物膜中荧光随深度的衰减情况。除被凝集素强烈标记的顶端菌丝外，荧光信号在焦深方向上未表现出明显的衰减趋势。请点击此处查看该图的放大版本。

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图 5： 琼脂中的侵袭性菌丝。 表面生物膜中的 C. albicans 菌丝可侵入琼脂基质，深入达毫米级距离（见图 1）。透明化处理后，可从上方透过生物膜观察侵袭结构，也可从琼脂底部自下向上观察。后者需要更大的工作距离。或者，在固定后、染色和溶剂交换前，可用解剖刀或剃刀刀片将琼脂垂直切成 1–2 mm 的薄片，染色和透明化处理后可将其侧立直接进行侧向成像。推荐采用此方法。在此 213 μm 见方的视野投影中，使用彩虹色标对 75 μm 范围内的轴向位置进行编码：蓝色结构位于较浅处，红色结构位于更深层。该视图显示，长菌丝在半规则间隔处出芽形成侧向的酵母样细胞，进而发育为亚克隆群体。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

荧光显微镜在光学切片、分辨率、成像速度、像差的避免或校正、多通道采集以及计算能力方面的进步，推动了对完整样本进行成像的复兴。对于固定样本，传统的以及新兴的透明化和扩展方法均产生了重大影响19,20,21,22,23,24。在本研究中，我们采用了一种快速且简单的基于溶剂的折射率匹配方法，用于研究从高度半透明到不透明的真菌生物膜结构。

上述方案已在多种样本上进行了测试。在我们的实验室中，白色念珠菌（Candida albicans）生物膜通常生长在从医用级硅橡胶片上切割而成的14 mm正方形材料上（参见材料表）。选择这种基质是因为，在液体培养基中浸没的聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面培养已被确立为研究与医疗植入物（尤其是留置导管）相关感染的重要体外模型。处于应激状态并启动菌丝形成的细胞会迅速黏附到非极性表面（如PDMS）。在实际操作中，经清洗并在高压灭菌器中（干循环）重新灭菌的重复使用方片，可为特定菌株提供最一致的生物膜生长结果。生物膜也常在盖玻片、底部为盖玻片的培养皿、标准细菌级聚苯乙烯培养皿以及琼脂上培养。由于白色念珠菌（C. albicans）细胞在玻璃表面黏附能力较弱，盖玻片应使用可结合细胞壁多糖的凝集素进行预处理。我们向每片盖玻片表面加入40 μL浓度为1 mg/mL的刀豆蛋白A（ConA）或麦芽凝集素（WGA）无菌水溶液。待其干燥后，再加入40 μL 1%戊二醛处理3分钟，以交联蛋白形成不溶性薄膜。随后用无菌蒸馏水清洗，以去除固定剂及任何可溶性凝集素，并在空气中干燥。如有需要，处理后的盖玻片或培养皿可在杀菌紫外灯下重新灭菌10分钟。

样本厚度会影响方案中所需的孵育时间。固定剂扩散至300 μm厚的生物膜需要数分钟才能达到平衡。该时间随样本厚度的平方增加，对于可能厚达2–3 mm的较厚生物膜或琼脂块样本，应将孵育时间延长至一小时或更久。染色的平衡时间同样取决于样本厚度，其规律与固定和洗脱过程所述相同。然而，由于凝集素的扩散速度比低分子量固定剂更慢，尤其是在琼脂凝胶内部，因此染色时间应延长至过夜。对于过量染料的洗脱，也应采取相同处理。

可在实验方案中加入多种类型的染色剂。我们使用细胞壁染色剂进行结构成像，最常用的是Calcofluor White M2R（荧光增白剂#28）或标记荧光染料的凝集素，例如ConA-Alexafluor 594或WGA-Alexafluor 594。应注意蛋白质的价态。ConA四聚体可能导致生物膜顶端区域高度柔韧的菌丝发生交联，而WGA二聚体则较少出现此现象。这些标记物的经典特异性分别为：Calcofluor针对几丁质，ConA针对甘露糖残基，WGA针对N-乙酰-D-葡萄糖胺和唾液酸残基。

由于溶剂交换方案是从 PBS 或水经甲醇逐步过渡到水杨酸甲酯，因此样本容器必须耐溶剂。水杨酸甲酯（MS）会迅速软化聚苯乙烯塑料器皿，并缓慢软化其他类型的塑料。在使用纯甲醇之前的步骤可以在塑料器皿中进行，但从该步骤开始，我们通常会转为使用带有耐溶剂螺旋盖的标准 20 mL 玻璃闪烁瓶。对于硅胶方形基底上的生物膜，此类小瓶使用方便，因为可以使用精细镊子夹取并转移方形基底。此外，当方形基底平放在小瓶内壁的曲面上时，可将小瓶排空并重新加液，从而避免生物膜接触玻璃表面。将基底浸入直立放置的小瓶中时，应使生物膜面朝上。这些小瓶非常适合长期保存样本。

在透明化方案中，增加梯度溶剂交换步骤可最大限度降低因溶剂混合效应导致的样本变形风险。在基础方案中，为提高速度和操作便利性，共包含四个步骤：1）步骤3.3，将PBS更换为50:50 PBS:甲醇；2）步骤3.4和3.5，将PBS:甲醇更换为纯甲醇；3）步骤3.6，将纯甲醇更换为50:50甲醇:MS；4）步骤3.7和3.8，将甲醇:MS更换为纯MS。甲醇起到过渡性混溶作用。然而，由于水与MS几乎不相溶，因此在引入任何MS之前，必须确保所有水分均已被甲醇完全置换。同样，由于甲醇具有高挥发性，必须用MS完全置换所有甲醇，否则残留甲醇的持续挥发将导致样本内部折射率发生变化。在上述四步流程中，建议通过增加一次甚至两次纯溶剂更换，重复第二步和第四步操作。对于特别脆弱的样本，可采用更小百分比梯度的溶剂更换方案。

使用琼脂块样品时，步骤 3.4 和 3.5（纯甲醇）可能导致琼脂内出现盐晶体，原因是残留的 PBS 盐在甲醇中不溶。为避免此问题，可在第一次混合溶剂步骤中用蒸馏水（DW）替代 PBS，以在水：甲醇置换过程中稀释盐分。固定生物膜的替代溶剂置换流程如下：1）步骤 3.3，将样品从 PBS 转移至 50:50 DW:甲醇（允许更长时间以确保溶剂充分扩散通过琼脂）；2）步骤 3.4，将样品从 50:50 DW:甲醇转移至纯甲醇（重复 2 次，每次均使用甲醇，如同步骤 3.5）；3）步骤 3.6，将样品从甲醇转移至 50:50 甲醇:水杨酸甲酯；4）步骤 3.7，将样品从 50:50 甲醇:MS 转移至纯 MS（重复 2 次，每次均使用 MS，如同步骤 3.8）。

由于水杨酸甲酯会迅速软化聚苯乙烯塑料器皿，我们使用带有盖玻片底部的阳极氧化铝培养皿，将澄清的生物膜置于倒置显微镜的载物台上。盖玻片通过紫外光固化光学胶（Norland Optical Adhesive #61，参见材料表）固定。只要在每天实验结束后用异丙醇清洗培养皿，再用肥皂水清洗并冲洗干净，以去除水杨酸甲酯，粘合的盖玻片可长期使用数月之久。

在大规模成像透明化样本时，物镜的选择至关重要，原因在于需要尽量减少球面像差，并保证足够的工作距离。我们在这些研究中使用过三种物镜。在倒置显微镜系统中，我们采用长工作距离、中等数值孔径（NA）的物镜，将其浸入盖玻片下方的镜油中，而培养皿中位于盖玻片上方的生物膜则浸没在水杨酸甲酯中。我们的大部分工作使用的是蔡司Universal系列消色差物镜（型号461708，40倍，0.85NA，油浸，160/1.5），并配合一个焦距为-160 mm的转接适配器，以实现名义上的无限远共轭（IC）兼容性。该物镜最初设计用于通过1.5 mm厚的显微镜载玻片进行油浸观察，其工作距离为0.35 mm25。当与标准盖玻片（0.17 mm）配合使用时，工作距离显著增加：1.5 + 0.35 – 0.17 = 1.68 mm = 1,680 μm。我们还使用了一款新型蔡司多用途浸没物镜（型号420852，25倍，0.8NA，LD LCI Plan-apochromat），其工作距离超过540 μm，浸没介质校正设置在“油”的高端位置。该物镜具有高度像差校正能力，可提供极佳的成像质量。在正置显微镜上，我们使用了一款新型尼康多用途浸没物镜（型号MRD71120，10倍，0.5NA，CFI Plan-apochromat），其工作距离超过5,000 μm（5 mm），同样将浸没校正设置在“油”的高端（n = 1.518）。尽管该物镜的数值孔径低于其他物镜，但其优势在于可直接浸入水杨酸甲酯中使用。

为了在速度和分辨率方面优化数据采集，共聚焦显微镜的设置应理想地同时满足横向和轴向的奈奎斯特采样密度18。根据常规标准，将共聚焦针孔直径设定为1个艾里单位。在放大坐标系中，

        dP (μm) = 1.22 × 放大倍数 × （发射波长，单位为 μm）/ NA

横向采样（像素间距）不应超过阿贝分辨率极限的 (1/2) 倍。在物空间坐标中，

        ∆x, ∆y = (发射波长，单位为 nm) / (4 NA)

轴向采样（焦距增量）不应超过轴向带宽的倒数，

        ∆z = (浸液折射率) × (发射波长，单位为 nm) / (NA2)

共聚焦光学系统通过至少1/√2的因子扩展了显微镜的带宽，并提高了横向和轴向分辨率。

对于我们最常使用的40倍、0.85数值孔径（NA）物镜，请参见表1，其中列出了在600 nm发射波长（Alexa Fluor 594）下这些公式的计算结果。

公式乘以 1/√2设定值（典型）
dP (μm)34.5 μm-25 或 50 μm
∆x, ∆y176 nm125 nm161 nm
∆z1200 nm848 nm900 nm

表1：针对600 nm发射波长的共聚焦针孔直径、横向采样和轴向采样值。

使用具有这些设置的转盘共聚焦扫描仪和1,392 x 1,040像素的扫描视野，可以以合理的速度和分辨率获取生物膜样本的数据。典型的单色三维图像堆栈大小为0.35–1.55 GB。

广泛使用的透明化介质涵盖了较宽的折射率范围。通过暗场照明和肉眼观察，我们发现固定后的白色念珠菌（C. albicans）生物膜在折射率高于 n = 1.5 时最为透明。进一步通过相差显微镜确定其最佳折射率为 n = 1.530–1.535。出于多种实际考虑，我们选用水杨酸甲酯（n = 1.537）作为最终的折射率匹配溶剂。尽管溶剂交换可能带来样本变形或其他假象的风险，但在固定并透明化处理后的样本中，细胞的细胞体尺寸、菌丝直径以及节间长度均与活体样本相近。

溶剂交换过程有多种可能的变体（例如，使用不同的过渡溶剂或不同的终末溶剂）。甲醇因其高极性和快速扩散特性而被选用，但已有研究表明，作为过渡溶剂时，乙醇能更好地保持红色荧光蛋白（RFP）的量子产率26。水杨酸甲酯因其折射率适中、具有中等极性、低蒸气压以及与多种染料、染色剂和荧光蛋白的良好兼容性而被选为终末溶剂。然而，使用折射率略低的终末溶剂，或水杨酸甲酯与折射率较低溶剂（如丁醇）的混合物，可能会获得更优的效果。

出乎意料的是，穿透生物膜进行观察不仅能够揭示其分层的内部结构，还有助于看清某些延伸结构的起源，例如在特定基质上生长的长而未缠绕的顶端菌丝和侵入性基底菌丝。C. albicans 的机会性毒力依赖于其遗传可塑性（即向菌丝生长模式的转换、细胞-基质及细胞间黏附性的上调、为细胞出芽和伸长生成渗透保护剂，以及利用替代性营养物质）。菌丝延伸使单个 C. albicans 细胞得以突破吞噬性免疫细胞，同时也对组织侵袭至关重要。生物膜的黏附性及菌丝的缠绕似乎为菌丝高效侵入基质提供了所需的表面锚定。当该基质为宿主组织时，可能导致毒力增强。

对完整生物膜进行成像，能够支持大量信息丰富的实验，例如利用报告菌株检测基因表达、使用模型组织基质，以及引入自然生物膜中常见的其他生物体。即使仅使用细胞壁染色进行最简单的结构成像，也能在原位揭示可被定量并进行遗传分析的表型特征。

披露

作者无任何竞争利益需要披露。

致谢

本研究部分得到了NIH基金项目R01 AI067703、R21 AI100270和R21 AI135178对A.P. Mitchell的资助。作者感谢Greenfield 'Kip' Sluder提供了本研究中使用的长工作距离油浸物镜，并感谢Daniel Shiwarski使用直接水杨酸甲酯浸没进行共聚焦显微镜成像。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物危害性废物容器
配备杀菌紫外灯的生物安全柜
Calcofluor White M2R（甲醇中浓度为2.5 mg/mL）
刀豆蛋白A-Alexafluor-594或其他偶联物
蒸馏水DW
无菌蒸馏水
无水乙醇EtOH
胎牛血清（FBS），无菌
二级防漏容器中的固定剂废液瓶
水中20%甲醛，安瓿装Electron Microscopy Sciences
甲醛替代品：多聚甲醛粉末、37%福尔马林Electron Microscopy Sciences
通风橱
水中25%戊二醛，安瓿装Electron Microscopy Sciences
培养箱 - 30 °C，配备用于培养管的旋转混合器（60 rpm）
培养箱 - 37 °C，配备用于培养板的轨道摇床
70%异丙醇iPrOH 70%
长波（365 nm）紫外灯，5 WCole-Parmer Scientific用于固化NOA-61胶
医用级硅胶片，厚度0.060"（1.52 mm）Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/非增强型医用级硅胶片
99.9%甲醇MeOH
99%水杨酸甲酯MS
Millipore Swinnex 13 mm白色硅胶环垫片Millipore Corp.SX0001301
Norland紫外固化光学胶 - NOA-61型Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.comNOA-61
台式轨道摇床
磷酸盐缓冲液（PBS），无菌
折射率标准液，n = 1.500 至 1.640（共29种，间隔0.005）Cargille Laboratories, https://cargille.comSeries E美国新泽西州雪松格罗夫，邮编07009
RPMI-1640基础培养基，HEPES缓冲，无菌
闪烁小瓶，20 mL - Wheaton，带尿素盖聚乙烯锥形盖衬垫Fisher Scientific Co.03-341-25H用于样本处理和储存
二级防漏容器中的溶剂废液瓶
含甘露醇的蜘蛛培养基，无菌（1% Difco营养肉汤，0.2% K2HPO4，1% D-甘露醇）
麦胚凝集素-Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594或其他偶联物
酵母浸出蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂平板，无菌（1%酵母提取物，2% Bacto蛋白胨，2%葡萄糖，2% Bacto琼脂）
YPD液体培养基，无菌（1%酵母提取物，2% Bacto蛋白胨，2%葡萄糖）

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