方法文章

肿瘤微环境中免疫细胞群体的可视化、定量与定位分析

DOI：

10.3791/60740

⸱

2020年3月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre de Recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), 2Département de Microbiologie, Infectiologie et Immunologie, Faculté de Médecine, Université de Montréal, 3Département de Pathologie et Biologie Cellulaire, Faculté de Médecine, Université de Montréal, 4Institut du Cancer de Montréal, 5Département de Neurosciences, Faculté de Médecine, Université de Montréal, 6Département de Chirurgie, Faculté de Médecine, Université de Montréal, 7Département de Médecine, Faculté de médecine, Université de Montréal

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍一种简单且易于实施的策略，用于对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片中的免疫细胞进行可视化、定量和定位分析。该方法结合了现有的成像技术和数字分析手段，旨在拓展成像检测的多重检测能力和多参数分析水平。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肿瘤微环境（TME）的免疫格局是决定癌症进展及治疗反应的关键因素。特别是TME中免疫细胞的密度和空间定位具有重要的诊断和预后价值。TME的多组学分析极大地加深了我们对调控肿瘤发生与进展的多种细胞和分子网络的理解。然而，这些技术无法提供有关细胞空间分布或细胞间相互作用的信息。目前亟需经济、易获取且操作简便的多重检测技术，以实现组织切片中免疫细胞的空间分辨，从而补充基于单细胞的高通量技术。本文介绍了一种整合连续成像、顺序标记和图像配准的策略，用于生成全组织切片的虚拟多参数图像。随后，通过用户自定义的分析流程对虚拟切片进行自动化分析，从而实现目标细胞群体的识别、定量和空间定位。本研究中采用Tissuealign、Author和HISTOmap分析模块完成图像分析。我们展示了一个成功将该策略应用于临床样本的实例，最大限度地从有限的组织样本中获取信息，并全面、无偏倚地呈现整个组织切片中TME的特征。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

癌症的发生是恶性细胞与肿瘤微环境（TME）之间发生多步骤、相互作用的结果。除了肿瘤细胞外，TME 还包含非恶性细胞、基质细胞、免疫细胞群体以及细胞外基质（ECM）1。肿瘤组织中不同细胞和结构成分的空间分布，以及癌细胞与邻近非癌细胞之间的动态交流，最终调控着肿瘤的进展及对治疗的反应2,3,4。研究表明，癌症中的免疫反应受到时空上的精确调控5,6。浸润至肿瘤病变及其周围组织的不同免疫细胞群体表现出独特的空间分布模式，以及不同的活化和分化状态，这些状态与其功能（例如促肿瘤或抗肿瘤）密切相关。这些不同的免疫细胞群体及其特征会随着时间与肿瘤和基质区域共同演化。

能够进行单细胞多组学分析的技术出现后，我们对调控癌变及肿瘤进展的众多细胞和分子网络的理解呈指数级增长。然而，大多数基于单细胞的高通量分析工具需要对组织进行破坏和单细胞分离，导致细胞空间组织结构及细胞间相互作用的信息丢失7。由于特定免疫细胞在肿瘤微环境（TME）中的位置和排列具有诊断和预后价值，能够实现空间分辨的技术成为基于单细胞免疫分析技术不可或缺的补充。

传统上，免疫组织化学（IHC）和多重免疫荧光（mIF）等成像技术仅限于同时可视化少量生物标志物。这一限制阻碍了对肿瘤浸润性免疫细胞时空动态的研究，而这类细胞通常由多种表型标志物共同定义。近年来，成像和分析工具的进步拓展了多重检测的可能性。基于抗体的新标记技术，如组织细胞计量学（histo-cytometry）和成像质谱流式技术（imaging mass cytometry），已分别实现对多达12种和32种生物标志物的空间分辨8,9。质谱成像技术无需标记，具有在单个组织切片中同时检测数千种生物标志物的潜力10,11。尽管这些技术已在解析肿瘤组织免疫微环境方面展现出巨大潜力，但其依赖高度复杂且昂贵的设备与软件，大多数研究人员难以获得。

此外，通过使用连续成像、多轮连续标记以及光谱成像技术，传统免疫组化（IHC）和多重免疫荧光（mIF）的多重检测能力得到了扩展7,12,13,14,15,16。这些技术可从相同或连续的组织切片中生成多幅图像，并可通过图像分析软件整合为虚拟的多参数切片。因此，能够同时可视化和分析的标志物数量显著增加。

本文提出了一种利用市售试剂、经济型显微镜设备和用户友好型软件进行组织多重检测合理设计的策略（图1）。该方法结合了连续成像、顺序多重标记、全组织成像和组织对齐技术，生成可用于组织切片中免疫细胞自动定量与定位的虚拟多参数切片。利用该策略，我们构建了一个包含11种生物标志物以及两种常用组织学染色——苏木精-伊红染色（H&E）和天狼星红染色（PSR）的虚拟切片。通过组织热图解析，可在不同组织区域中识别、定位并定量多种免疫细胞群体。该策略最大限度地提高了从有限临床样本中获取的信息量，适用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的存档组织样本，包括全组织、穿刺活检组织和组织微阵列。我们建议将该方法作为在肿瘤微环境（TME）中设计用于免疫细胞群体识别、定量和定位的定制化检测方案的实用指南。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

从蒙特利尔大学医院中心（CHUM）肝胰胆肿瘤临床数据库与生物样本库（HBP 生物样本库）获取了三例经手术切除的乙型肝炎病毒（HBV）相关人肝细胞癌的连续FFPE切片。参与该组织库的患者均已签署知情同意书。本研究经机构伦理委员会批准（方案编号 09.237），并按照《赫尔辛基宣言》的规定进行。

1. 苏木精和伊红（H&E）染色方案

注意：苏木精和伊红（H&E）染色由蒙特利尔大学医院研究中心（CRCHUM）分子病理学核心设施使用Shandon多功能程序化全自动切片染色仪，并按照以下程序完成。

  1. 脱蜡：将切片浸入二甲苯替代品中，每次2.5分钟，共3次。
    警告：二甲苯替代品易燃，对皮肤有刺激性，吸入有害。
  2. 复水：将切片浸入100%乙醇中，每次2.5分钟，共3次。用双蒸水（ddH2O）洗涤1分钟以完成复水。
  3. 苏木精孵育1分钟。用ddH2O洗涤3次，每次1分钟。
  4. 伊红孵育5秒。用95%乙醇洗涤30秒。用100%乙醇洗涤2次，每次1分钟。
    警告：乙醇易燃，对眼睛有刺激性。伊红对眼睛有刺激性。
  5. 脱水：将切片浸入二甲苯替代品中，每次1.5分钟，共3次。手动封片。
    注：执行本部分操作预计耗时30分钟。

2. 用于FFPE切片的多重免疫荧光染色方案

注意：本方案改编自 Robertson 等人17。

  1. 脱蜡与复水
    注意：在对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片进行免疫组化（IHC）或多重免疫荧光（mIF）染色前，必须去除石蜡。若石蜡未充分去除，会导致染色效果不佳。
    1. 将4 μm厚的FFPE组织切片置于玻璃切片架中。在通风橱内，将切片浸入盛有37°C预热二甲苯的考普林瓶中，孵育10分钟。
      注意：二甲苯易燃，对皮肤有刺激性，吸入有害。
    2. 每2分钟手动振荡切片10秒，更换新鲜二甲苯后重复一次，再孵育5分钟。
    3. 在化学通风橱中，依次将切片浸入以下溶液中各5分钟：1）二甲苯:乙醇（1:1 v/v）；2）100%乙醇；3）70%乙醇；4）50%乙醇；5）30%乙醇；6）磷酸盐缓冲液（PBS）。
      注意：切片应始终保持在PBS中，直至进行抗原修复。脱蜡后的组织切片必须始终处于水合状态，干燥会导致非特异性抗体结合，从而产生高背景染色。
  2. 加热诱导抗原修复
    注意：福尔马林固定可能导致抗原表位被掩盖，从而阻碍抗体结合及后续可视化。使用抗原修复缓冲液和相应处理步骤可部分恢复表位的天然构象，进而恢复抗体识别能力。抗原修复缓冲液的类型及处理时间应根据具体实验条件（如靶标、抗体、组织类型等）进行优化。
    1. 将脱蜡后的切片浸入盛有抗原修复液的考普林瓶中（配方见材料表）。
    2. 将密封的考普林瓶放入电压力锅内的自来水中。水位不应超过瓶子高度的一半，以防止水与抗原修复液混合。
    3. 关闭压力锅盖和压力阀，选择高压模式加热10分钟并启动。完成后拔掉电源，释放压力，打开锅盖，并将考普林瓶留在锅内静置30分钟，使切片自然冷却。
  3. 封闭非特异性结合位点
    1. 将载有切片的支架转移至盛有PBS的考普林瓶中，用PBS冲洗2次，每次5分钟，以去除残留的抗原修复液。
    2. 用PAP笔在组织周围画圈，形成疏水屏障。将切片浸入含0.1 M甘氨酸的PBS溶液的考普林瓶中，在室温（RT）下孵育15分钟。
      注意：甘氨酸可饱和抗原修复过程中产生的醛基，这些基团可能非特异性地结合一抗或二抗。
    3. 用PBS洗涤2次，每次5分钟，以去除甘氨酸溶液。将切片放入湿盒中，加入足量封闭液覆盖所有组织区域，避免溢出疏水圈。在室温下孵育30分钟。
      注意：封闭液配方见材料表。封闭液应含有蛋白质（如BSA）以阻断非特异性结合位点。也可加入Triton X-100或Tween 20等去垢剂，以减少抗体与组织之间的疏水相互作用，提高抗原识别的特异性。加入来源于组织来源物种的10%总血清可封闭Fc受体，从而减少非特异性抗体结合。最后，加入来源于二抗制备物种的10%血清，可最大限度减少二抗直接非特异性结合到组织切片上。
  4. 免疫荧光标记
    1. 用PBS-Tween（0.1% v/v）洗涤2次，每次5分钟，然后将切片放回湿盒中。
    2. 加入用封闭液重悬的一抗混合液，在4 °C下孵育过夜。本研究所使用的一抗和二抗列于材料表中。
      注意：一抗混合液应包含来自不同物种的抗体，或来自同一物种但不同同种型的抗体。有关本研究中使用的一抗-二抗配对列表，请参见表2。所有抗体的详细信息见材料表和表2。
    3. 用PBS-Tween（0.1% v/v）洗涤3次，每次5分钟，然后将切片放回湿盒中。在避光条件下加入二抗混合液，在室温下孵育1小时。
      注意：当一抗来自不同物种时，应选择每种二抗仅特异性结合对应的一抗，而不与其他二抗交叉反应。通常可通过使用同一物种来源的二抗实现，前提是该物种与一抗来源物种不同。若一抗来自同一物种但具有不同同种型，则应使用同种型特异性的二抗。
    4. 用PBS-Tween（0.1% v/v）洗涤3次，每次5分钟。再用 ddH2O冲洗一次。吸去多余液体后，用含DAPI的封片剂封片。封片剂用量取决于组织大小，通常40 μL足以覆盖标准显微镜载玻片的表面。
    5. 盖上盖玻片，轻轻挤压以排出多余封片剂，避免产生气泡。将切片在避光条件下于室温干燥20分钟，随后在4 °C保存，直至成像。
    6. 使用全片扫描仪获取所有通道的图像（见材料表）。
      注意：抗体通过人肝细胞癌组织作为阳性对照进行验证。针对每种一抗，制备三张连续切片，分别进行以下处理：仅加一抗、加同种型对照抗体、仅加封闭液，其余染色步骤保持一致。通过比较图像以确认染色的特异性。当一抗孵育切片中的信号呈现预期分布模式且明显区别于背景时，视为特异性染色。若一抗导致背景信号过高，或在同种型对照及无一抗对照切片中出现组织成分标记，则视为非特异性染色。完成本部分实验预计耗时2天。必需的对照包括：（1）同种型对照，用于评估一抗非特异性结合对背景信号的贡献。该对照切片的处理方式与其他样本相同，但使用与一抗同种型和来源相同、但靶向组织中不存在抗原的抗体；若无合适同种型对照抗体，可用与一抗相同来源物种的总IgG替代；（2）无一抗对照（即阴性对照），用于验证染色特异性，并评估二抗非特异性结合对背景信号的贡献。该对照切片处理方式与其他切片相同，但不添加一抗；（3）阳性对照，用于确认染色体系有效。该对照使用已知表达目标标志物的组织切片进行染色。

3. 苦味酸-天狼星红（PSR）/快绿染色方案

注意：本染色的目的是在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片中可视化纤维状胶原蛋白I型和III型。本方案改编自Segnani等人的研究18。所有步骤均在通风橱中进行。

  1. 对标本切片进行脱蜡和水化处理，步骤类似于FFPE组织切片的多重免疫荧光染色方案（第2.1节）。
    注意：如果待染色切片此前已用于免疫荧光标记且石蜡已被去除，则脱蜡-水化步骤有助于去除封片剂。DAPI在此过程中不会被去除，但不会明显干扰PSR染色结果。
  2. 将切片浸入含有苦味酸-天狼星红/快绿溶液的染色缸中（配方见材料表），室温孵育30分钟（超过30分钟会导致肝细胞核出现非特异性染色）。
  3. 用ddH2O快速洗涤切片（5次浸洗），然后用100%乙醇快速洗涤（5次浸洗）。在二甲苯-100%乙醇（1:1 v/v）中洗涤30秒，再在二甲苯中洗涤30秒。在二甲苯完全蒸发前使用封片剂（见材料表）进行封片（有助于顺利封片）。
    注意：执行本部分操作的预计时间为1小时。

4. 从组织切片中洗脱抗体

注意：为了在连续标记实验中重复使用组织切片，必须完全去除一抗和二抗。结合的抗体按先前所述方法去除13。

将水浴锅预热至 56 °C。将切片放入含有脱蜡缓冲液的容器中（配方见材料表），盖上盖子，并用石蜡膜密封，以防止振荡过程中泄漏。

  1. 将玻璃罐放入水浴中，30 分钟孵育并持续振荡。
  2. 在室温下用 ddH2O 洗涤 4 次，每次 15 分钟。用 PBS-Tween（0.1% v/v）冲洗。
  3. 在准备使用第二轮一抗重新孵育切片之前，始终将切片保存在 PBS-Tween 或水中以保持其湿润。
    注意：执行本部分方案的预计时间为 2 小时。
  4. 验证抗体洗脱程序的效率。
    注意：在将该方案用于连续标记实验中的抗体洗脱之前，应先验证一抗和二抗的去除效率。
    1. 按照石蜡包埋组织切片多重免疫荧光染色方案（第 2.1–2.4.6 节）所述，对一个切片使用特定的一抗-二抗组合进行染色并获取图像。
    2. 图像采集完成后，按照第 4.1–4.3 节所述方法，对组织结合的一抗-二抗复合物进行洗脱处理。
    3. 使用与步骤 2.4.3 相同的二抗及相同条件孵育切片。
    4. 按照第 2.4.4–2.4.6 节所述进行洗涤、封片和图像采集。
    5. 并排比较洗脱前后获取的图像，以确定特异性信号是否已消失。
      注意：通过比较抗体去除前后的图像可验证洗脱程序的效率。然而，所有通道的背景信号升高以及 DAPI 扩散是正常现象。这限制了在同一组织切片上可执行的洗脱轮次，最多约为三轮。

5. 图像采集

  1. 使用全切片扫描仪生成图像。
  2. 使用20倍、0.75NA的物镜，分辨率为0.3225 μm/像素。

6. 图像分析

注意：此处所述方法针对当前示例。请参考表1及正文内容，以调整适用于其他特定样品。

  1. 使用图像分析软件中的 Tissualign 模块（本方案中为 VIS，参见材料表）进行组织对齐。
    1. 打开图像分析软件，点击Tissuealign选项卡。
    2. 通过进入文件 | 数据库，选择要对齐的第一幅图像，将其导入载玻片托盘中。返回到Tissuealign选项卡，点击载玻片托盘中的加载按钮以加载图像。图像将显示在载玻片托盘和工作区中。
      注意：仅应将感兴趣的图像堆栈加载到载玻片托盘中。
    3. 按对齐顺序对所有图像重复步骤 6.1.2，逐个加载。当所有感兴趣的图像均加载到载玻片托盘后，点击功能区中工作流程步骤的下一步按钮以链接图像。
    4. 接下来，将第二幅图像拖放到第一幅图像之上。第一幅和第二幅图像现在已链接。以有序方式逐个对其他待对齐图像重复此步骤。第一幅图像的名称将发生变化，表明其已与其他图像链接。同时，已链接的图像将在载玻片托盘右侧的工作区中显示。
    5. 此时，可通过自动对齐、半自动对齐或手动对齐方式对图像进行对齐。始终建议优先尝试自动对齐。如需自动对齐，请点击功能区中工作流程步骤（步骤 3）的下一步按钮。
    6. 通过浏览组织的不同位置，并目视验证不同图像中对应结构在图像的两个维度上是否排列一致，来检查自动对齐结果。
    7. 如果自动对齐结果不理想，可通过使用标记点（每幅图像至少使用三个标记点）指示已链接图像中的同源组织特征来优化对齐效果。在已链接图像的同源位置放置标记点后，用户有两种选择：半自动对齐或手动对齐。如需半自动对齐，请点击功能区中的自动对齐按钮；如需手动对齐，请点击功能区中的应用标记点按钮。
    8. 当对齐结果满意后，点击工作流程步骤中的下一步按钮，并将合成图像保存至数据库。
      注意：在所展示的分析中，对六张切片（涵盖 11 种标记物以及 H&E 和 PSR 图像）进行对齐耗时 15 分钟。
  2. 使用用户自定义协议分析协议包 1（APP 1，表 1）进行组织检测。
    1. 点击功能区中的图像分析选项卡，打开软件的图像分析模块。
    2. 通过进入文件 | 数据库，选择感兴趣的图像，然后返回图像分析选项卡，导入合成（已对齐）图像。
    3. 点击打开 APP图标，打开 APP 选择对话框，并选择要使用的分析协议包（APP）。本例中选择APP 1用于组织检测。
    4. 打开 APP 1 后，前往选定的组织位置并点击预览按钮，确认 APP 1 是否正常工作。若结果满意，则进入下一步。
    5. 点击运行 APP 1，并使用所选 APP 处理图像。
    6. 分析完成后，点击文件/导出导出数据（例如图像、测量值等）。
      注意：APP 1 创建一个划定组织区域的兴趣区域（ROI）（ROI 组织），并计算组织面积。
    7. 通过进入文件 | 保存，保存包含新创建 ROI 的修改后图像。
      注意：在所述图像分析工作站中，使用 APP 1 检测组织并创建 ROI 耗时 5 分钟。所处理组织的面积为 3.2 cm2。
  3. 使用 APP 2（表 1）将组织分割为间质和实质。
    注意：APP 2 作用于预定义的 ROI 组织。APP 2 将组织分割为间质 ROI 和实质 ROI。
    1. 点击功能区中的图像分析选项卡，打开图像分析模块。
    2. 通过进入文件 | 数据库，选择在步骤 6.2.7 中保存的包含 ROI 组织的图像。返回图像分析选项卡，点击载玻片托盘中的加载按钮以加载图像。图像将显示在载玻片托盘和工作区中。
    3. 使用 APP 选择对话框打开 APP 2，方法同 6.2.3。
    4. 在选定视野中预览 APP 2 的处理结果。若结果满意，点击运行按钮对整幅图像执行 APP 2。APP 2 的输出结果为：ROI 组织被分割为间质和实质 ROI，并确定各自的面积。结果导出方式同 6.2.6。修改后图像的保存方式同 6.2.7。
      注意：在所述分析工作站中，使用 APP 2 将组织分割为间质和实质耗时 4 小时。所处理组织的面积为 3.2 cm2。
  4. 使用用户自定义协议 APP 3（表 1）识别并量化 FoxP3hiCD4+ 细胞。
    注意：APP 3 作用于预定义的间质和实质 ROI。
    1. 打开图像分析模块，并按照 6.3.1 和 6.3.2 的方法导入包含间质和实质 ROI 的图像。使用 APP 选择对话框打开 APP 3，方法同 6.2.3。
    2. 在 FoxP3hiCD4+ 细胞富集的选定视野中预览 APP 3 的处理结果。若结果满意，对整幅图像运行 APP 3。APP 3 的输出结果为：所有单个 FoxP3hiCD4+ 目标均被标记，并存储其组织坐标。将确定间质和实质 ROI 中 FoxP3hiCD4+ 目标的密度。结果导出方式同 6.2.6。
    3. 对 FoxP3hiCD4+ 标记目标进行组织热图分析。
      1. 使用 APP 选择对话框打开用户自定义协议 FoxP3hiCD4+ MAP，方法同 6.2.3。
        注意：FoxP3hiCD4+ MAP 利用 FoxP3hiCD4+ 标记目标的坐标生成密度热图。在所述图像分析工作站中，使用 APP 3 识别和计数 FoxP3hiCD4+ 标记目标耗时 25 分钟。所处理组织的面积为 3.2 cm2。
      2. 点击运行按钮执行 FoxP3hiCD4+ MAP。点击文件 | 导出 | 工作区导出组织热图。
        注意：在所述图像分析工作站中，使用 FoxP3hiCD4+ MAP 对 FoxP3hiCD4+ 标记目标进行热图映射耗时 5 分钟。
  5. 分别使用用户自定义协议 APP 4、APP5、APP6、APP7 和 APP 8，按照第 6.4 至 6.4.3.2 节的方法，识别并量化 CD8+、CD68+、MPO+、αSMA 和 CD34+ 目标，在每种情况下加载相应的 APP（表 1）。
    注意：APP 4 至 APP 8 作用于预定义的间质和实质 ROI。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

可视化、定量和绘制肿瘤微环境中目标细胞群体的策略概述
为了在不同组织区室（TCs）中定量目标细胞群体（COIs），并表征其空间分布特征，我们设计了一种整合了经济且易于使用的技术的工作流程，以最大限度地从珍贵的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床样本中获取位置信息（图1）。首先，对连续的完整组织FFPE切片进行染色，以可视化目标细胞群体（例如免疫细胞）和组织区室（例如间质与实质）（图1，步骤1）。染色的连续切片数量应尽可能少，仅需满足研究问题所要求的目标细胞或组织特征的观察即可。连续切片数量越少，各相邻切片之间的组织结构相似性和一致性越高。此外，通过脱色和重复探针技术重新利用荧光染色切片，可进一步扩展多重检测能力19。

染色步骤完成后，使用全片扫描仪对图像进行数字化。从连续切片获取的图像被自动对齐并整合为一张虚拟的多重染色切片（图1，第2步）。接着，根据用户自定义的协议划定组织的兴趣区域（ROI），以识别与组织相关的像素（TAPs）（图1，步骤3）。随后，将ROI内的组织分割为定义为额外ROI的组织组分（TCs）（图1，步骤4）。接下来，通过用户自定义的协议在不同的TC中检测并定量目标成分（COIs）（图1，步骤5）。最后，基于COIs的密度及其在组织中的空间坐标生成组织热图（图1，步骤6）。

组织分析工作流程：成像、配准、检测、分割、定量、热图结果。
图1：在肿瘤微环境（TME）中可视化、定量和定位免疫细胞策略的示意图。（1）对连续的全组织切片进行染色，以标记关注细胞（COIs）和组织组分（TCs）。染色后的全组织切片通过全切片扫描仪进行数字化。（2）来自连续切片的图像通过Tissuealign分析模块自动关联、配准和共定位。通过高精度对齐各单独图像生成一幅合成图像。（3）在合成图像中，采用用户自定义协议自动检测与组织相关的像素（TAPs）。（4）将组织分割为定义为感兴趣区域（ROIs）的组织组分（TCs）（例如间质和实质）。（5）使用用户自定义协议，在不同组织组分（TCs）中自动检测并定量关注细胞（COIs）。（6）生成关注细胞（COIs）的组织热图。请点击此处查看该图的放大版本。

成像关注区域和肿瘤巢
一名乙型肝炎病毒（HBV）相关肝细胞癌患者的切除肿瘤组织，其三张连续的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）全组织切片，按照图2A所示方法进行一轮或多轮染色。切片I采用苏木精-伊红（H&E）染色，以显示组织结构、细胞形态，并确定具有临床意义的参数，如恶性肿瘤类型、肿瘤分级以及免疫细胞浸润的整体评估（图2C）。在相邻的连续切片II中，采用两轮多重免疫荧光（mIF）染色标记肝实质和非实质细胞（图2A）。第一轮染色中，通过CD34标记内皮细胞以显示正常和肿瘤血管；同时使用细胞角蛋白8/18（cytokeratin 8/18）鉴定上皮细胞（肝细胞和胆管细胞），并通过α-平滑肌肌动蛋白阳性（αSMA+）标记鉴定成纤维活性的肝星状细胞（图2C）。完成图像采集后，组织切片经脱色处理，并使用针对巨噬细胞（CD68）和肌成纤维细胞（desmin）的抗体进行再次探针标记。为了更深入表征肿瘤免疫浸润情况，相邻的连续切片III采用两轮mIF染色，检测细胞标志物CD3、CD4、CD8、叉头框P3（FoxP3）以及髓过氧化物酶（MPO）。在所有情况下，均使用DAPI作为细胞核复染剂。最后，切片III经苦味酸天狼星红（PSR）染色，并用快绿复染，以显示纤维状胶原，并将组织划分为间质和实质区域（图2C）。

使用配备20倍物镜的全片扫描仪对染色切片进行数字化，以生成虚拟切片。从三张连续切片中获取了六幅图像（图2B），随后根据图1中的示意图，使用VIS软件对虚拟切片进行分析。

图像分析
图像分析包括五个步骤：1）组织对齐；2）组织检测；3）组织分割；4）感兴趣区域（COIs）的自动定量；以及 5）组织热图绘制。所有图像分析方案均使用图像分析软件的 Author 模块开发，并在文中简称为 APP。

组织对齐
将来自三个连续切片的六张虚拟切片图像（涵盖11种标记物以及H&E和PSR染色）载入图像分析软件的Tissualign模块中。随后，这些图像以自动化方式被连接、对齐并进行共定位，生成一张包含11重标记以及H&E和PSR的虚拟复合图像，该图像整合了各单张图像的所有图层信息（图2A–C）。对于来自相邻连续切片的图像，对齐结果准确，显示相应的组织结构在对齐后以同源方式定位和排列（图2C 和 图S1A）。此外，源自同一张切片的图像在单个细胞水平上也实现了精确对齐（图S1B）。自动对齐所需时间取决于待对齐图像的数量、尺寸、复杂程度及相似性。上述六张虚拟切片在本研究使用的VIS工作站上的对齐耗时为15分钟。

连续切片染色比较示意图，显示显微镜分析中未对齐和已对齐的图像。
图2：连续组织切片的染色与图像对齐。（A）对三个连续切片进行染色的总结，用于可视化目标区域（COIs）和肿瘤细胞（TCs）。括号中的数字表示图像编号。对于切片II和III，组织经过剥离后使用第二组抗体混合物重新孵育。（B）六个完整组织图像在对齐前（左）和对齐后（右）的概览。比例尺 = 3,500 µm。（C）对齐后图像的放大视图。比例尺 = 80 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

组织检测
图像完成链接与对齐后，我们着手识别组织相关像素（TAPs）（图3A）。为实现TAPs的自动检测，我们设计了一个分析程序（APP 1，表1），该程序利用了可将TAPs与非组织相关像素区分开的两个特征。首先，DAPI信号（蓝色通道）局限于细胞核，而细胞核仅存在于组织内，这意味着所有DAPI阳性像素均为TAPs的一个子集。其次，TAPs在绿色和黄色通道中的自发荧光信号强度高于非组织相关像素。因此，我们开发了用于组织检测的APP 1（表1），该程序基于这些通道的背景信号，采用简单的阈值化技术来识别TAPs。蓝色、绿色和黄色通道的阈值设定为：TAPs的背景强度值高于阈值，而非组织相关像素的强度值低于阈值。组织检测APP 1被应用于图像IIA，该图像包含蓝色、绿色和黄色通道的图层（图3A）。APP 1的输出结果是在TAPs区域叠加一层亮绿色的掩膜，并划定一个名为“组织”（Tissue）的感兴趣区域（ROI）（输出结果，图3A）。此外，组织面积被确定为一个定量输出变量。由于APP 1未将非组织相关像素纳入“组织”ROI，因此这些像素在后续基于该ROI的分析中被排除（图3A）。APP 1在识别TAPs方面的精确性如图3A所示。

组织分割及TCs感兴趣区域（ROI）的界定
接下来，我们通过将组织区分为间质与实质，来定义ROI组织内部的不同区室。我们使用PSR染色图像（IIIC，图2C），其中间质定义为存在纤维状胶原沉积的区域（红色区域），实质则定义为缺乏纤维状胶原、以快绿复染染料为主导的区域（绿色区域）（图3B）。我们创建了APP 2（表1），用于对TCs的间质和实质进行数字划分。该APP基于预定义的ROI组织（输出结果，图3A），并利用代表性的间质和实质区域，训练图像分析模块中集成的分类器工具。训练后的分类器将像素分别分配至间质或实质标签（分别为鲑鱼色和绿色，图3B）。在完成像素分类后，APP 2执行形态学操作，以界定间质和实质的ROI（图3B和表1）。APP 2在像素分类及生成相应ROI方面的表现如图3B所示。此外，APP 2还可量化间质和实质的面积。最后，尽管分割是基于PSR染色切片完成的，所划定的间质和实质区域可转移至与PSR图像配准的任何其他图像上。

组织检测与分割示意图；ROI分析；胶原沉积；显微镜结果。
图3：自动组织检测/分割及相应ROI的生成。（A）使用图像IIA识别TAPs（左图，比例尺 = 6,000 µm）。通过APP 1（表1）为TAPs分配亮绿色掩模，生成名为“Tissue”的ROI（输出1）。右侧插图显示放大视图，展示APP 1在识别TAPs时的精确性。比例尺 = 350 µm。（B）利用APP 2将ROI Tissue（输出1）进一步分割为间质和实质。左侧图像显示ROI Tissue被分割为ROI间质（鲑鱼色）和ROI实质（绿色）。比例尺 = 4,500 μm。右侧为ROI Tissue插图区域的放大视图、原始PSR染色图像（图像IIIC）以及间质和实质的ROI。比例尺 = 250 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

COI 的自动化定量分析
接下来，我们着手在 ROI（Stroma 和 Parenchyma）中识别、定位并定量分析 COI。为此开发了 APP 3 至 APP 8（表 1），用于定位和计数以下 COI：CD4+FoxP3+、CD8+、CD68+、MPO+、αSMA+ 和 CD34+ 细胞。APP 3 旨在定位和计数 CD4+FoxP3+ 细胞（图像 IIIA，图 2C），作为调节性 T 细胞（Tregs）的替代标志物。该方案通过检测核转录因子 FoxP3（红色信号）与 DNA 标记染料 DAPI（蓝色信号）的共定位来实现识别。由于近期活化的 T 细胞会上调 FoxP3 的表达，为了富集 Tregs，我们设定了阈值，仅预选 FoxP3 高表达的细胞（FoxP3hi）。随后，在所有预选出的 DAPI+FoxP3hi 细胞中，仅将那些被明亮环状 CD4 信号（绿色信号）包围的细胞标记并计数为 FoxP3hiCD4+ 细胞（粉红色标记，图 4A）。APP 3 的定量输出变量为 ROI（Stroma 和 Parenchyma）中 FoxP3hiCD4+ 细胞的密度（图 4A）。

类似地，APP 4 至 6 被设计用于检测 CD8+、CD68+ 和 MPO+ 细胞。这些 APP 在检测和定量目标细胞（COI）方面具有相同的基准设计。具体而言，目标细胞根据特定细胞群体生物标志物的信号强度进行识别，随后执行多个后续形态学处理步骤以划分单个细胞（表 1）。单个细胞或目标细胞被标记、计数，并记录其在组织中的坐标位置。APP 4 至 6 还可确定目标细胞在感兴趣区域（ROI）间质和实质中的密度（图 4B–D）。

DAPI染色的质量不足以将细胞核分割整合到APP 3至6中，因此无法确保所有单独标记的物体均为单个细胞。基于此原因，我们以每平方毫米标记物体的数量来表示细胞密度。2 (图4然而，在集成于APP 3至6中的后处理步骤中，细胞聚集体被成功分离为单个细胞，大量视觉检查表明，大多数标记对象对应于单个细胞。

为了检测αSMA+和CD34+区域，我们分别开发了APP 7和APP 8（表1）。这两个APP均基于阈值识别特异性信号，并计算间质和实质ROI中阳性区域的百分比（图4E–F）。

生成虚拟多重切片最具吸引力的应用之一是共定位表达分析。我们开发了APP 10用于检测αSMA与desmin之间的共定位，这两种标志物由肝内肌成纤维细胞共同表达。APP 10采用特定阈值来识别αSMA阳性、desmin阳性以及αSMA与desmin双阳性的像素区域（表1）。作为定量输出变量，APP 10可测定αSMA阳性区域、desmin阳性区域以及这两种标志物共定位表达的区域面积（图S3）。

显示组织中CD4、CD8、CD68、MPO细胞密度以及CD34、αSMA面积的免疫荧光分析。
图4：肿瘤微环境（TCs）间质和实质中关注细胞（COIs）的鉴定与定量。 （A–F）分别使用方案3、4、5、6、7和8对感兴趣区域（ROIs）间质和实质中的CD4+FoxP3+、CD8+、CD68+、MPO+、αSMA+和CD34+关注细胞（COIs）进行自动检测与定量（表1）。左侧显示原始图像，中间为处理后的图像，右侧为定量结果。对于图4A–D，比例尺 = 40 µm；对于图4E和F，比例尺 = 350 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

作为量化肿瘤微环境（TC）间质和实质中免疫细胞密度（COI）的替代方法，我们测定了编号为1至4的不同恶性结节中免疫细胞的密度（图5A、H 和 I）。每个结节的感兴趣区域（ROI）如 图5A 所示手动勾画。各个结节表现出独特的组织免疫特征，进一步揭示了肿瘤微环境（TME）的内在异质性。

组织热图
如上所述，APP 3 至 8 存储了每个单独标记对象的组织坐标。该功能可自动生成组织图谱，其中特定细胞群体密度较高的区域以热点（红色）显示，密度相对较低的区域以冷点（深蓝色）显示。中间密度值根据图5所示的颜色标尺赋予相应颜色。组织热图由APP生成，这些APP将图像划分为直径为50 μm的圆形区域，并根据圆形内特定关注细胞（COI）的相对密度赋予颜色。如图5B–G所示，肿瘤微环境（TME）中不同COI的定位模式和强度分布具有显著差异。此外，在单个结节水平上，不同细胞群体在组织区域内的排列方式各具特征（图S2A–C）。为了展示该技术的强大功能并可视化同一结节内不同细胞群体热点的空间组织关系，研究人员手动提取了各细胞类型的热点，并共同映射至结节2的轮廓上（图S2、图D和图E）。

组织学分析、免疫组织化学结果、细胞标志物密度、组织切片示意图。
图 5：肿瘤微环境（TME）中关注区域（COIs）的组织热图。 （A）Picrosirius Red 染色显示结节 1、2、3 和 4 的位置。（B–G）分别为 CD4+FoxP3+、CD8+、CD68+、MPO+、CD34+ 和 αSMA+ 关注区域（COIs）的组织热图。深蓝色表示相对低密度，红色表示相对高密度。中间密度值根据所示颜色标尺赋予相应颜色。（H 和 I）按细胞类型和按结节分别对结节 1、2 以及 3+4 中关注区域（COIs）的定量分析。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜图像配准验证；组织结构与细胞水平；DAPI、CD34、FOXP3 染色；示意图。
补充图 S1：组织切片配准的验证。（A）对切片 II（输入 1）进行 CD34 染色（红色），用于生成绿色的 CD34 掩模（输出 1）。将绿色掩模（输出 1）叠加到配准后的连续切片 I 的 H&E 图像（输入 2）上。融合图像显示血管结构完全对应。比例尺 = 50 μm。（B）图像 IIIA 显示 DAPI、CD4 和 FoxP3 的融合图像（输入 1），用于生成 CD4+FoxP3+ 细胞的标签（输出 1，品红色）。将输出 1 标签转移至配准后的图像 IIIB（输入 2），融合图像中显示 FoxP3/DAPI 及 CD4/CD3 的配对完全对应。比例尺 = 15 μm。请点击此处查看此图的高清版本。

天狼星红染色组织中结节的组织学分析；CD标志物，免疫细胞浸润。
补充图S2：组织热图的放大视图。（A–C）结节1–4中CD4+FoxP3+、CD8+、CD68+和MPO+细胞的组织热图。结节1、2以及3+4的比例尺分别代表1,500 μm、700 μm和500 μm。（D）以黑色实线勾画的结节2轮廓。（E）将结节2中CD4+FoxP3+、CD8+、CD68+和MPO+细胞的热点区域提取后共同映射至（D）中定义的结节2轮廓上。请点击此处查看该图的高清版本。

组织切片中αSMA、Desmin免疫荧光共定位及阳性区域分析图表。
补充图S3：共定位分析。（A）左侧和中间分别为绿色标记的αSMA和红色标记的desmin图像，右侧为αSMA/desmin双阳性区域（黄色）。（B）αSMA+区域、desmin+区域以及αSMA/desmin双阳性区域的定量分析。比例尺 = 150 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

APP目的分类分类后处理步骤输出变量
方法特征
（像素值）
1组织检测阈值法DAPI 通道 (150)o 对三个通道中高于阈值且共定位的信号标记对象o 组织 ROI
FITC/A488 通道 (120)o 将阳性对象闭合 5 个像素o 组织面积
TRITC/A568 通道 (40)o 创建组织 ROI
2组织分割决策森林RGB-R 中值o 填充空洞o 间质 ROI
RGB-G 中值o 创建间质 ROIo 间质面积
RGB-B 中值o 创建实质 ROIo 实质 ROI
IHS-S 中值o 实质面积
H&E 伊红中值
3用于定位并定量 CD4+ FoxP3+ 细胞阈值法DAPI 通道 (>600)o 标记 DAPI 与 Cy5/A647 共定位且被 FITC/A488 信号包围的对象o 间质和实质 ROI 中 CD4+FoxP3+ 细胞的数量和密度
FITC/A488 通道多项式平滑 (>850)o 清除面积小于 7 μm2 的对象o 单个 CD4+FoxP3+ 细胞的坐标
Cy5/A647 通道 (>800)
4用于定位并定量 CD8+ 细胞阈值法DAPI 通道 (<1200)o 清除面积小于 15 μm2 的阳性对象o 间质和实质 ROI 中 CD8+ 细胞的数量和密度
Cy5/A647 通道中值 (>80)o 将阳性对象闭合 2 个像素o 单个细胞的坐标
o 分离对象
5用于定位并定量 CD68+ 细胞阈值法FITC/A488 通道 (>200)o 清除面积小于 20 μm2 的阳性对象o 间质和实质 ROI 中 CD68+ 细胞的数量和密度
o 将阳性对象扩张 3 个像素o 单个 CD68+ 细胞的坐标
o 分离对象
6用于定位并定量 MPO+ 细胞阈值法DAPI 通道 (>400)o 清除面积小于 5 μm2 的对象o 间质和实质 ROI 中 MPO+ 细胞的数量和密度
TRITC/A568 通道 (900–4000)o 将阳性对象扩张 3 个像素o 单个 MPO+ 细胞的坐标
o 分离对象
7用于定位并定量 αSMA+ 区域阈值法TRITC/CF568 通道 (>1050)o 清除面积小于 25 μm2 的阳性对象o 间质和实质 ROI 中 αSMA+ 区域的数量和密度
o 将阳性对象扩张 3 个像素o αSMA+ 像素的坐标
8用于定位并定量 CD34+ 区域阈值法DAPI 通道 (<5000)o 清除面积小于 25 μm2 的阳性对象o 间质和实质 ROI 中 CD34+ 区域的数量和密度
Cy5/A647 通道中值 (>120)o 将阳性对象扩张 3 个像素o CD34+ 像素的坐标
9为特定细胞群体生成组织热图对象热图对象热图o 热图
绘图半径 50 μm---
10定量分析 αSMA 与 Desmin 的共定位阈值法TRITC (CF568) 通道 (>1050)o 标记 TRITC (CF568) 通道中高于阈值的对象o 定量分析 αSMA 与 Desmin 的共表达
Cy5 (A647) 通道 (>1000)o 标记 Cy5 (A647) 通道中高于阈值的对象
o 标记 TRITC (CF568) 与 Cy5 (A647) 通道中均高于阈值且共定位的对象
o 清除面积小于 25 μm2 的阳性对象

表1：用于图像分析的APP设计中使用的一般参数。 本表中指定的参数针对本分析所用图像的独特特征（如背景、伪影等）进行了调整，可能不适用于其他图像。由于所述的后处理步骤是为本研究中分析的特定图像定义的，因此有意未作详细说明。用户应根据待分析的图像对APP进行个性化设置。

部分/染色一抗二抗
第二部分/1st 染色小鼠 IgG2a 抗人 α-SMA
小鼠 IgG1 抗人 CD34
兔抗人细胞角蛋白 8/18		山羊抗小鼠 IgG2a CF568
大鼠抗小鼠 IgG1 A647
驴抗兔 A488
第二部分/2nd 染色兔抗人结蛋白
小鼠抗人 CD68		驴抗兔 A647
驴抗小鼠 DyLight 755
第三部分/1st 染色小鼠抗人 CD4
兔抗人 FoxP3
山羊抗人MPO		驴抗小鼠 A488
驴抗兔 A647
驴抗山羊A568
第三部分/2nd 染色兔抗人 CD3 多克隆抗体
小鼠抗人 CD8		驴抗小鼠 DyLight 755
驴抗兔 A647

表2：mIF 使用的一抗-二抗配对。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了描绘癌症及其他免疫相关疾病中的免疫图谱，亟需简单、易获取且易于实施的多重检测技术，以实现组织切片中免疫细胞的空间分辨。本文介绍了一种整合了广泛可用的标记和数字分析技术的策略，以扩展成像检测的多重检测能力和多维评估能力12,13,17,19。通过对三张连续组织切片进行不同标志物的染色，并利用剥离与重新探针技术重复使用切片，我们实现了除H&E和PSR染色外共11个参数的可视化。来自这些切片的六幅图像通过组织对齐模块实现了自动对齐。对于来自同一张切片的图像，其对齐精度达到单细胞水平；对于来自相邻切片的图像，其对齐结果也高度一致。虚拟多重检测技术使我们能够确定在一个切片中可视化的标志物与在相邻连续切片中可视化的其他标志物之间的空间关系。部分染色标记了关注细胞（COIs），而另一些则标记了组织区域（TCs），从而可量化不同组织区域中的关注细胞。利用软件工具对关注细胞进行自动化定量，极大简化并加速了图像处理流程。此外，数字分析应用于整张组织切片而非选定的视野区域，从而实现了肿瘤微环境（TME）的无偏表征。同时，由于关注细胞的组织坐标已被记录，因此可生成组织热图。

本方案中有多个环节可能需要进行问题排查。首先，抗原修复效果不佳会影响多重免疫荧光（mIF）的染色质量，因此应针对所使用的特定检测方法或生物标志物条件，优化抗原修复缓冲液的类型及修复时间。其次，封闭溶液的选择应根据组织类型、抗原特性以及一抗和二抗的物种来源进行调整。在我们的实验中，加入来源于组织来源物种的10%总血清可有效阻断Fc受体，从而减少非特异性抗体结合；而加入二抗来源物种的10%血清则可最大限度地减少二抗与组织切片之间的直接非特异性结合。第三，必须使用适当的阳性和阴性对照来验证一抗和二抗的特异性。第四，某些荧光通道中自发荧光增强，以及在去除一抗过程中DAPI发生扩散，也是常见问题。为应对自发荧光增强的情况，我们选用的抗体组合需确保特异性信号强度至少为背景信号的5倍以上。最后，某些高亲和力抗体无法通过常规剥离程序有效去除。在此情况下，建议将此类抗体用于最后一轮标记。用户可能需要尝试不同的染色顺序，以确定目标抗体的最佳组合方案。在进行第二轮或第三轮标记之前，必须确认抗体剥离的效率。

该策略的主要局限性和挑战在于为感兴趣的标志物找到合适的初级和次级荧光抗体组合。由于商业可获得性的限制，很难找到由不同物种产生或具有不同同种型、可同时使用的初级抗体。大多数全切片扫描仪配备的光源和滤光片仅支持最多五个通道的成像，而针对特定物种并带有合适荧光染料的次级抗体并不总是可获得。我们通过连续染色和顺序标记的方法部分克服了这些限制。可能需要测试多种抗体组合，才能确定针对目标标志物的最佳组合。另一个局限性在于DAPI染色的质量，因为去染和重新探针处理并不总能实现细胞核的有效分割。

组织对齐模块对用户几乎无需培训，且不要求具备编程技能。该软件理论上可对无限数量的图像进行对齐。然而，精确对齐依赖于切片之间的相关性，组织学上越接近且越一致的相邻切片，其对齐精度越高。我们使用 VIS 的 Author 模块来生成 APPs。创建 APPs 需要具备基本的图像分析知识，但这与使用其他任何图像分析软件时的要求相同。与其它图像分析软件相比，VIS 的独特优势包括能够自动对采用不同方法制备的切片图像进行对齐（例如，IF、组织化学、IHC），从而可通过虚拟多重化实现多种目标标记物的共定位研究。此外，APPs 具有灵活且用户友好的设计，支持针对特定用户需求进行定制。自动定量分析与图谱生成，以及可处理整张组织切片的能力，相比通过肉眼观察进行人工计数，可节省时间并减少偏差。

该策略作为癌症和自身免疫背景下组织免疫学研究的一种工具非常有用，但尚未经过临床应用的验证。通过进一步的标准化和验证，未来可将其用于多种应用场景（例如，绘制癌症中的免疫图谱，以预测和监测对免疫治疗药物的反应）。该方法也可适用于不同的炎症性疾病（例如，炎症性肠病），将病理学评估与预后生物标志物相结合。

本方案中的主要关键步骤包括标记的效率/特异性以及所设计的APP针对预期用途或生物标志物的稳健性。因此，在设计新的APP后，尤其需要通过目视检查进行常规验证。在同一组织切片上高效地进行多轮 stripping 和重新探针检测，或使用不同类型的染色方法，是关键环节，且可能因组织或切片而异。在开展大规模批次分析之前，验证这些流程的有效性至关重要。

综上所述，我们提供了一种策略，可最大限度地获取来自珍贵临床组织样本的定量和空间信息。实施该方法所需的资源、设备和知识均广泛可及。我们建议将此方法作为规划检测方案的有用指南，以期在肿瘤微环境（TME）中识别、定量并绘制免疫细胞群体的分布图谱。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢研究参与者。感谢HBP生物样本库协调员Louise Rousseau在组织样本及其所有相关临床信息收集方面提供的帮助，以及CRCHUM分子病理学和细胞成像核心设施和Visiopharm的Michael Persch在技术上的出色支持。经费来源：本研究获得了加拿大肝脏基金会、魁北克卫生研究基金会（FRQS）艾滋病与传染病网络（Réseau SIDA-MI）以及加拿大丙型肝炎网络（CanHepC）的资助。CanHepC由加拿大卫生研究院（CIHR）（NHC-142832）与加拿大公共卫生署联合倡议资助。M.F.M.获得了蒙特利尔大学、Gabriel Marquis奖学金以及FRQS的博士后奖学金。T.F.获得了CIHR和CanHepC的博士奖学金。S.T.现任蒙特利尔大学Roger-Des-Groseillers肝胆胰肿瘤外科讲席教授。

作者贡献：M.F.M. 设计并实施实验，以及分析数据。T.F. 设计实验。A.C-B. 提供技术指导。G.S. 完成本研究对象的全部病理学评估，并对研究中所有病理学相关方面提供意见。L.M. 完成H&E染色，优化并执行图像采集。M.N.A. 完成PSR染色，并提供宝贵的技术建议。N.B. 参与图像分析。S.T. 是HBP生物样本库的首席研究员，负责监督生物样本库的整体运行，同时对本项目的各个方面及其临床意义提供了极为宝贵的指导。M.F.M.、T.F. 和 N.H.S. 构思并设计了本研究。N.H.S. 监督研究工作并获得经费支持。M.F.M.、T.F.、A.C-B 和 N.H.S. 撰写论文。所有作者均审阅并批准了最终稿件。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗原修复液：柠檬酸钠缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% v/v Tween 20，pH 6.0）
封闭液：1% BSA，10% 过滤人血清，10% 过滤驴血清，0.1% Tween 20 和 0.3% Triton 溶于 PBS
牛血清白蛋白（BSA）Multicell800-095-EG
Coplin 染色缸（EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM）Newcomersupply5300KIT
盖玻片Fisherbrand12-545E 22*50
直接红 80（Direct Red 80）Sigma Aldrich365548
驴血清（Donkey Serum）Sigma AldrichD9663
100% 乙醇
电压力锅Salton
伊红（Eosin）Leica Biosystems3801600警告：引起眼部刺激
快绿 FCF（Fast Green FCF）Sigma AldrichF7252警告：吸入、摄入或经皮肤吸收有害
石蜡包埋组织切片（4μm）载玻片
PBS 中含 0.1 M 甘氨酸
苏木精染色液，Gil 1. 配方，常规浓度Ricca Chemical Company3535-32
染色缸架（EasyDip Staining Jar Holder）Newcomersupply5300RK
人血清（Human Serum）Gemini22210
湿盒（Humidity chamber）Millipore SigmaZ670138-1EA
免疫组化笔（Pap pen）abcamab2601
PBS
PBS-Tween 20（0.1% v/v）
Permount 封片介质（Permount Mounting Media）Fisher ChemicalSP15-500
1.3% 苦味酸（Picric Acid）Sigma AldrichP6744警告：引起皮肤和眼部刺激
苦味酸-天狼星红/快绿染液：0.1% w/v 快绿 + 0.2% w/v 天狼星红溶于 1.3% 苦味酸溶液
一抗：抗-αSMA 抗体小鼠 IgG2a 1A4Sigma A2547稀释比例 1/100
一抗：抗-CD34 抗体小鼠 IgG1 HPCA1/763Novus Biologicals NBP2-44568稀释比例 1/250
一抗：抗-细胞角蛋白 8/18 抗体兔 EP17/EP30Agilent IR09461-2即用型
一抗：抗-CD68 抗体小鼠 KP1Abcam ab955稀释比例 1/200
一抗：抗-结蛋白（Desmin）抗体兔多克隆Invitrogen PA5-16705稀释比例 1/200
一抗：抗-CD4 抗体小鼠 N1UG0Affymetrix 14-2444稀释比例 1/250
一抗：抗-FoxP3 抗体兔 1054CR & D MAB8214稀释比例 1/100
一抗：抗-MPO 抗体山羊多克隆R & D Systems AF3667稀释比例 1/250
一抗：抗-CD3 抗体兔 SP7Abcam ab16669稀释比例 1/200
一抗：抗-CD8 抗体小鼠 C8/144BInvitrogen 14-0085-80稀释比例 1/200
二抗：驴抗小鼠 A488多克隆Invitrogen A-21202稀释比例 1/500
二抗：驴抗兔 A488多克隆Invitrogen A-21206稀释比例 1/500
二抗：驴抗山羊 A568多克隆Invitrogen A-11057稀释比例 1/500
二抗：驴抗兔 A647多克隆Invitrogen A-31573稀释比例 1/500
二抗：大鼠抗小鼠 IgG1 A647RMG1-1Biolegend 406618稀释比例 1/500
二抗：山羊抗小鼠 IgG2a CF568多克隆Sigma Aldrich SAB4600315稀释比例 1/500
二抗：驴抗小鼠 DyLight 755多克隆Invitrogen SA5-10171稀释比例 1/500
二抗：驴抗兔 DyLight 755多克隆Invitrogen SA5-10043稀释比例 1/500
SDSBioShopSDS001,500警告：口服、皮肤和眼部毒性
Shandon 多程序自动化玻片染色仪LabX11384903
Shandon 二甲苯替代液Thermo Fisher ScientificCA89413-336警告：易燃，引起皮肤和眼部刺激，吸入有害
摇床水浴锅
含 DAPI 的 SlowFade Gold 抗荧光淬灭试剂InvitrogenS36938
二水合柠檬酸钠Millipore Sigma1545801警告：引起眼部刺激
脱抗体缓冲液：将 20 ml 10% w/v SDS 与 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）和 67.5 ml 超纯水混合。在通风橱内加入 800 μL 2-巯基乙醇（终浓度为 114.4 mM）
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50ML
Tris-HClBioShop77-86-1
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
VIS 软件Visiopharm
全片扫描仪 Olympus BX61VSOlympus显微镜：Olympus Slide Scanner BX61VS，5 片扫描仪，电动载物台，自动对焦。相机：光源：Xcite-120。滤光片：BrightLine® Sedat 滤光片组（# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000，Semrock）
二甲苯Sigma Aldrich214736-4L警告：易燃，引起皮肤和眼部刺激，吸入有害
二甲苯：乙醇溶液（1:1 v/v）
2-巯基乙醇SigmaM6250警告：摄入、吸入有害，经皮肤吸收可致死。引起眼部刺激。需在通风橱中使用

参考文献

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