乳腺是一种双层结构，由外层的肌上皮细胞和内层的腔面 epithelial 细胞组成。本文介绍了一种利用差速胰蛋白酶消化制备类器官的方案。该高效方法使研究人员能够分别操控这两种细胞类型，以探究它们在乳腺形态与功能中的作用。
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本文内容
摘要
摘要
类器官是一种可自我组织的三维组织结构，能够在培养皿中模拟生理过程。小鼠乳腺由两种功能不同的上皮细胞区室组成：外层具有收缩功能的肌上皮区室和内层具有分泌功能的腔面上皮区室。本文介绍一种方法，可分离构成这两个区室的细胞，并将其重新组合，以研究它们在乳腺形态发生和分化过程中各自的谱系贡献。该方法简便高效，无需使用流式细胞分选等复杂的分离技术。具体而言，我们首先收获组织并进行酶消化，将上皮细胞接种于贴壁培养皿中，然后利用差异胰蛋白酶消化法，以约90%的纯度将肌上皮细胞与腔面上皮细胞分离。随后将细胞接种于细胞外基质中，使其自组织形成具有双层结构的三维（3D）类器官，并在培养10天后可诱导其分化产生乳汁。为研究基因突变的影响，可从小鼠野生型或基因工程小鼠模型中获取细胞，也可在进行三维培养前对细胞进行基因操作。该技术可用于构建嵌合类器官，从而特异性地研究基因在腔面或肌上皮区室中的功能。
引言
乳腺（mammary gland, MG）是一种树状的管状上皮结构，嵌于富含脂肪细胞的间质组织中。双层导管上皮由外层基底部位的收缩性肌上皮细胞（myoepithelial cells, MyoECs）和内层围绕中央管腔的腔面分泌性上皮细胞（luminal epithelial cells, LECs）构成。1哺乳期间，当外层肌上皮细胞（MyoECs）收缩以挤压内层腺泡腔上皮细胞（LECs）中的乳汁时，乳腺在多种生长因子（如EGF和FGF）和激素（如孕酮、胰岛素和催乳素）的调控下发生一系列变化。这些变化促使特化结构——腺泡的分化，从而在哺乳期合成并分泌乳汁。1乳腺上皮可通过实验操作进行干预，方法是将上皮组织碎片、细胞甚至单个基底细胞移植到宿主乳腺脂肪垫中（该脂肪垫已预先清除内源性乳腺实质），并使其生长以重建完整的功能性上皮树状结构2,3,4,5移植是一种强大的技术，但如果突变导致早期胚胎致死（早于E14期），从而无法获取可移植的乳腺原基，则该方法耗时且不可行。此外，研究者常常希望探究来源于谱系受限前体细胞的两个不同区室各自的功能。虽然Cre-lox技术可实现对肌上皮细胞（MyoECs）....
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方案
本文所述所有方法均已获得加州大学圣克鲁兹分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 第1天：乳腺组织消化
- 准备从 10 至 14 周龄的成年雌性小鼠中采集乳腺组织。
- 在开放工作台面、无菌条件下进行组织采集操作。
- 所有手术器械、软木板和大头针均需经高压灭菌，并在手术前用 70% 乙醇浸泡 20 分钟以消毒。
- 使用 0.5 mL 胰岛素注射器经腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为 0.06 mg/g 体重的 2 倍麻醉量）对动物实施麻醉。
- 通过轻捏动物脚趾以检测反射反应，监测麻醉深度，仅在动物完全麻醉后开始后续操作。
- 将动物仰卧位固定于软木板上，四肢用大头针固定，并用乙醇擦拭其腹部和胸部。
- 为从小鼠单侧获取第 2、3、4 和 5 对乳腺（即共 8 个乳腺，图 1A），首先识别后肢之间的中线，使用锋利剪刀在腹部皮肤上做一小切口（1 cm），然后沿中线向上延伸至颈部18。
- 随后向四肢方向做横向小切口，以便使用棉签松解皮肤。将皮肤拉开并绷紧后，固定于软木板一侧（图 1....
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结果
本文所述方案介绍了一种利用嵌合类器官研究乳腺上皮细胞特定谱系贡献的方法。为了获得用于类器官培养的原代小鼠细胞，必须首先将乳腺上皮从富含脂肪细胞的间质组织中分离出来（图1）。此过程在此简要描述，亦见于先前发表的研究18。为获得足够数量的细胞，建议切除第2、3、4和5对乳腺组织（图1A）。分离纯上皮细胞群体的关键步骤之一是从第4对乳腺组织中去除淋巴结，因为这些淋巴结富含免疫细胞，会污染样品（图1A,B）。将乳腺组织剪碎，生成约0.1 mm大小的组织碎片（图1B）。随后通过酶消化法处理组织碎片，该过程在胶原酶存在下进行，以使上皮与间质分离，同时避免使用胰蛋白酶，防止降解维持细胞间连接的蛋白（如钙.......
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讨论
本文介绍了一种利用原代乳腺腺泡细胞（MG细胞）生成三维类器官培养物的方法。本方法与其他方案的不同之处在于，我们详细描述了一种分离两种不同MG细胞区室的技术：外层的基底肌上皮细胞（MyoECs）和内层的腔上皮细胞（LECs）。我们的方法采用两步法胰蛋白酶-EDTA（0.05%）处理，称为差异胰蛋白酶消化法19。该程序使研究人员能够在无需使用复杂的流式细胞术的情况下分离MyoECs和LECs，因此可用于研究从多种哺乳动物物种中获取的乳腺组织，尤其适用于那些缺乏FACS所需明确生物标志物的物种。能够分离这两种细胞亚群，使研究人员可以独立地对分离的细胞进行遗传修饰，或将携带遗传突变或标记的动物来源的细胞重新组合，从而在三维培养中生成嵌合类器官。当前方案的一个局限性在于培养条件中未包含间质成分。然而，目前已有新的方法正在开发中，旨在将间质成分与来源于原代细胞或细胞系的类器官共培养，以更真实地模拟体内细胞外基质（ECM）23,24,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Ben Abrams 提供的技术支持，以及加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）干细胞生物学研究所（IBSC）提供的核心设施支持。我们感谢 Susan Strome 和 Bill Saxton 提供 Solamere 转盘共聚焦显微镜的使用权限。本研究部分得到了以下资助：通过詹姆斯·H·吉利阿姆高级研究奖学金项目（S.R.）由霍华德·休斯医学研究所向加州大学圣克鲁兹分校提供的资助；美国国立卫生研究院（NIH GM058903）支持的学生发展最大化计划（H.M.）；美国国家科学基金会研究生研究奖学金（O.C. DGE 1339067）；以及加州大学癌症研究协调委员会（UC-Cancer Research Coordinating Committee）提供的资助（A18-0370）（LH）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 ml 高透明度聚丙烯锥形管（BD Falcon） | 费舍科学 | 352096 | |
| 24 孔超低吸附培养板（Corning） | 费舍科学 | CLS3473-24EA | |
| 35 mm 细胞培养处理易握式培养皿（BD Falcon） | 费舍科学 | 353001 | |
| 50 ml 高透明度聚丙烯锥形管（BD Falcon） | 费舍科学 | 352098 | |
| 60 mm 细胞培养处理易握式培养皿（BD Falcon） | 费舍科学 | 353004 | |
| 70 µm 尼龙细胞滤网（Corning） | 费舍科学 | 08-771-2 | |
| 抗生素-抗真菌剂（100X） | 赛默飞世尔科技 | 15240062 | 青霉素/链霉素也可使用 |
| B27 补充剂（不含维生素 A，50x） | 赛默飞世尔科技 | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP 小鼠 | 杰克逊实验室 | 003291 | |
| BD 胰岛素注射器 0.5 mL | 赛默飞世尔科技 | 14-826-79 | |
| II 型分散酶（Roche） | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| III 型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning 细胞回收溶液 | 费舍科学 | 354253 | 请遵循使用指南 – 从 Corning Matrigel 基质中提取三维结构 |
| Corning Costar 超低吸附 6 孔板 | 费舍科学 | CLS3471 | |
| 地塞米松 | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12，无酚红 | 赛默飞世尔科技 | 11039-021 | |
| DNase（脱氧核糖核酸酶 I） | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| 驴抗山羊 647 | 赛默飞世尔科技 | A21447 | 使用比例 1:500，批号：1608641，储存浓度 2 mg/mL，RRID:AB_2535864 |
| 驴抗小鼠 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | 使用比例 1:1000，批号：140554，储存浓度 1.4 mg/mL |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12（DMEM/F12） | 赛默飞世尔科技 | 11330-057 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS） | 赛默飞世尔科技 | 14190-250 | 不含 Mg²⁺/Ca²⁺ |
| EGF | 费舍科学 | AF-100-15-100ug | |
| 胎牛血清 | VWR | 97068–085 | 100% 美国来源，优级，批号：059B18 |
| Fluoromount-G（Southern Biotech） | 费舍科学 | 0100-01 | 文中称为封片介质 |
| 庆大霉素 | 赛默飞世尔科技 | 15710064 | |
| 甘氨酸 | 费舍科学 | BP381-5 | |
| 山羊抗 WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | 使用比例 1:250，批号：J1011，储存浓度 200 µg/mL，RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | 使用比例 1:2000，储存浓度 20 mM |
| 胰岛素 | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | 费舍科学 | P217-500 | |
| KH₂PO₄ | 费舍科学 | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | 杰克逊实验室 | 5107 | |
| 生长因子减少型 Matrigel（GFR）；无酚红；10 mL | 费舍科学 | CB-40230C | 批号：8204010，储存浓度 8.9 mg/mL |
| MillexGV 滤器单元 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8 孔玻璃载片，无菌 | Millipore Sigma | PEZGS0816 | 此类腔室载片非常适合垫圈移除，但其他品牌也可使用（例如 Lab Tek II）。 |
| 小鼠抗 SMA | Millipore Sigma | A2547 | 使用比例 1:500，批号：128M4881V，储存浓度 5.2 mg/mL，RRID:AB_476701 |
| N-2 补充剂（100x） | 赛默飞世尔科技 | 17502048 | |
| NaCl | 费舍科学 | S671-3 | |
| NaH₂PO₄ | 费舍科学 | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| 绵羊垂体催乳素 | 国家激素与肽项目 | 从 Harbor-UCLA 研究与教育研究所的 Dr. Parlow 处购买 | |
| 多聚甲醛 | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| 戊巴比妥 | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | 杰克逊实验室 | 6148 | |
| Rho 抑制剂 Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| 氢氧化钠 | 费舍科学 | S318-500 | |
| 无菌过滤驴血清 | Equitech-Bio 公司 | SD30-0500 | |
| 无菌过滤驴血清 | Equitech-Bio 公司 | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | 实验室级 |
| 胰蛋白酶 EDTA 0.05% | 赛默飞世尔科技 | 25300-062 |
参考文献
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr
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