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利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性

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DOI：

10.3791/60743

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2020年3月2日

 ,  ,  , 
1Centre for Superbug Solutions, Institute for Molecular Biosciences, The University of Queensland

本文内容

摘要

荧光标记的抗生素是研究抗菌耐药性多个方面的有力工具。本文介绍了荧光标记抗生素的制备方法及其在研究细菌抗生素耐药性中的应用。这些探针可用于通过分光光度法、流式细胞术和显微镜技术研究细菌耐药机制（例如外排作用）。

摘要

荧光抗生素是具有多种用途的研究工具，由于其相较于其他方法具有显著优势，可被广泛用于抗菌耐药性研究。制备这类探针时，首先合成抗生素的叠氮衍生物，然后通过点击化学中的叠氮-炔烃偶极环加成反应，将其与炔基荧光团偶联。经过纯化后，通过最低抑菌浓度评估来检测荧光抗生素的抗菌活性。为了研究抗生素在细菌中的积累情况，可采用分光光度法或流式细胞术，相比依赖放射性标记抗生素衍生物的方法，分析过程更为简便。此外，共聚焦显微镜可用于观察抗生素在细菌内部的定位，从而获得有关作用机制以及耐药菌株中发生改变的宝贵信息。荧光抗生素探针在抗菌耐药性研究中的应用是一种功能强大且具有广阔发展前景的方法。

引言

抗菌耐药性（AMR）是一场日益严重的危机，对全球人类健康构成重大威胁。已有报道显示，细菌对大多数抗生素产生了耐药性，且出现了一些对所有临床可用药物均耐药的细菌所引发的感染。为了应对AMR的上升趋势，我们需要加深对这一复杂现象及其背后抗生素与细菌之间相互作用机制的理解。其中，抗生素进入细菌的渗透过程，以及药物在菌体内的积累与外排现象，是长期以来认识不足的重要方面。这些知识对于新药设计和耐药机制的理解至关重要，因此在AMR研究中发挥着关键作用。

测量抗生素浓度主要有两种方法：直接检测药物本身，或通过连接一个便于定量的基团进行标记。尽管对抗生素进行标记可提高检测灵敏度，但这可能会影响药物的生物学活性，例如抗菌活性和通透性。未标记方法则不存在此类问题；然而，其检测可能更具挑战性。近年来，技术的进步推动了利用质谱法（MS）直接测定细菌内抗生素浓度的研究迅速发展1,2,3,4,5,6,7。这些研究表明，可在多种细菌中研究抗生素在细胞内的积累情况，其中革兰氏阴性菌的研究最为广泛。分子通透性的定量结果随后被关联至药物活性，并用于指导新药研发2,3,4，但在直接将药物积累量与靶标活性等同看待时需谨慎5。在质谱技术发展之前，唯一能被直接测量浓度的抗生素是那些具有内在荧光特性的药物，例如四环素类和喹诺酮类8,9,10,11。尽管此类方法应用范围明显受限，但研究人员仍对其积累和外排过程进行了考察与定量，展示了基于荧光的定量方法的实用性。

标记抗生素已被用于研究药物分布、作用模式及耐药性长达数十年，其中放射性标记和荧光标记较为常见。放射性标记探针的优势在于其结构几乎与母体化合物相同，因此生物学活性不太可能发生显著改变。由于这些元素在抗生素中普遍存在，同位素如3H、14C和15N已被广泛使用，多种抗生素骨架也已得到研究1,10,12,13。尽管放射性探针的检测较为简便，但存在若干实际操作上的问题（例如安全性、同位素半衰期），限制了该方法的应用。另一种策略是使用荧光标记的抗生素。这类探针可利用比质谱更简单的技术来研究母体药物的分布、作用机制及耐药性，同时避免了辐射相关的后勤问题8。该方法的主要缺点在于抗生素通常为相对较小的分子，引入荧光基团会带来显著的化学结构改变，这种修饰可能影响其理化性质和抗菌活性。因此，必须谨慎评估这些因素，以确保所得结果能够真实反映母体抗生素的特性。

本研究描述了一种合成、评估和使用荧光标记抗生素的方法，如我们此前发表的文献所述14,15,16。通过前期工作，已制备并应用了多种荧光抗生素用于不同目的（参见 Stone 等人8）。为最大限度降低对抗生素生物活性的影响，本研究采用极小的荧光基团：硝基苯并恶二唑（NBD，绿色）和 7-(二甲氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基（DMACA，蓝色）。此外，本文还介绍了利用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）来评估抗菌活性的方法，以便测量结构修饰对抗菌活性的影响。这些荧光标记探针可用于分光光度法检测、流式细胞术和显微镜观察。其广泛的应用潜力正是荧光抗生素的优势所在。细胞内的药物蓄积可被定量、分类和可视化，而这是仅使用质谱（MS）无法实现的。希望通过对荧光抗生素的应用所获得的知识，能够增进我们对耐药机制的理解，并助力应对抗菌药物耐药性（AMR）的挑战。

方案

1. 炔烃荧光染料的合成

  1. NBD-炔烃的合成（7-硝基-N-(丙-2-炔-1-基)苯并[c][1,2,5]噁二唑-4-胺)
    1. 将1,031 mg的4-氯-7-硝基苯并呋喃（5.181 mmol）溶于60 mL四氢呋喃（THF）中。加入1,857 mg的CsCO₃3 （5.696 mmol），然后加入0.39 mL丙炔胺（6.1 mmol）。将反应液于50 °C加热2 h，溶液颜色由棕色变为绿色，随后冷却至室温（RT）。
    2. 使用助滤剂过滤反应液（参见 材料表），用乙酸乙酯（EA）洗涤。减压浓缩滤液，将残余物溶于150 mL乙酸乙酯（EA）中，转移至500 mL分液漏斗。
    3. 用100 mL水和饱和食盐水分别洗涤EA溶液。然后合并水相，并用100 mL EA萃取2次。
    4. 用无水硫酸镁干燥合并的有机相，然后过滤并在减压下浓缩。
    5. 通过硅胶快速柱层析纯化粗产物（石油醚中含20–30%乙酸乙酯），并采用液相色谱-质谱联用（LCMS，[M+H]）检测纯度+ = 219.1）和/或核磁共振（NMR）波谱法，化学位移如下：
      1H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 8.54 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.35 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 5.7 Hz, J = 2.5 Hz, 2H），2.43（t， J = 2.5 Hz，1H； 13C NMR (CD3OD, 150 MHz) δ 144.3, 143.7, 142.2, 135.8, 125.7, 100.0, 76.5, 74.2, 33.4。
      注意：进行硅胶柱层析纯化时，使用所列溶剂中极性较小的溶剂装柱。若粗产物无法溶解，可将其以浓缩溶液形式上样，或吸附于硅胶后上样。将化合物加至硅胶顶部后，先用与润湿硅胶相同的溶剂冲洗1–2个柱体积。随后按所列溶剂比例开始洗脱，每种溶剂至少冲洗1个柱体积，注意避免溶剂体系组成发生大幅跳跃。收集各馏分，通过液相质谱（LCMS）或薄层层析（TLC）检测纯度与化合物身份。合并纯净馏分，并在减压条件下通过旋转蒸发浓缩。
  2. DMACA-炔烃的合成（2-(7-(二甲氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙炔）H-色烯-4-基-N-(丙-2-炔-1-基)乙酰胺)
    1. 将5.02 g 3-(二甲氨基)苯酚（36.6 mmol）溶于30 mL乙醇中，然后加入6.7 mL 1,3-乙酰丙二酸二乙酯（36 mmol）。加入10.5 g ZnCl₂2 （77.2 mmol），然后将红色溶液回流反应42小时。再加入额外的9.20 g ZnCl₂2 （67.6 mmol），然后回流反应8小时。
    2. 将反应液冷却并在减压下浓缩。将所得红色固体分散于200 mL乙酸乙酯中，过滤后转移至500 mL分液漏斗中。
    3. 依次用200 mL水和饱和食盐水洗涤EA，然后用无水硫酸镁干燥。过滤干燥后的有机相，并在减压条件下浓缩。
    4. 纯化所得红色固体（乙基 2-(7-(二甲氨基)-2-氧代-2H-铬-3-基)乙酸酯）H-色烯-4-基)乙酸酯），通过硅胶快速柱层析（PE 中 0–100% EA 梯度洗脱）纯化，并通过 LCMS 检测纯度（[M+H]）+ = 275.1）和/或核磁共振（NMR），化学位移如下：
      1H NMR (CDCl₃)3，600 MHz）δ 7.30（d， J = 8.9 Hz, 1H), 6.52 (dd, J = 8.9 Hz, J = 2.6 Hz, 1H), 6.40 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 5.87 (m, 1H), 2.96 (m, 8H), 2.25 (d, J = 1.2 Hz, 3H)
    5. 溶解488 mg的乙基2-(7-(二甲氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基)乙酸酯（1.18 mmol）溶于10 mL THF中，然后加入157 mg LiOH·H₂O的溶液2将3.74 mmol的O溶于15 mL水中，在室温下搅拌反应3小时，然后转移至分液漏斗中，并用额外的50 mL水稀释。
    6. 用50 mL乙醚（Et₂O）洗涤反应混合物2次2O），然后用25 mL水洗涤合并的有机相两次。黄色沉淀物随有机层保留。使用旋转蒸发仪在减压条件下浓缩有机相。
    7. 用浓盐酸将水相酸化至 pH = 2，于 4 ˚C 下静置过夜。过滤酸化后的水相，将所得黄色固体加入浓缩的有机相中。
      注意：2-(7-(二甲氨基)-2-氧代-2H-chromen-4-基)乙酸可直接使用而无需进一步纯化，但可通过液相色谱-质谱联用（LCMS）进行检测（[M+H]）+ = 247.1）和/或核磁共振（NMR），化学位移如下：
      1H NMR (CDCl₃)3，600 MHz）δ 7.41（d， J = 9.0 Hz, 1H), 6.62 (双二重峰, 1H) J = 9.2 Hz, J = 2.8 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.98 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 3.05 (s, 6H), 2.35 (d, J = 0.9 Hz，2H； 13C核磁共振（CDCl₃）3，150 MHz）δ 162.2、155.7、152.9、152.8、125.3、109.7、109.3、109.1、108.8、98.3、40.2、18.5。
    8. 溶解466 mg的2-(7-(二甲氨基)-2-氧代-2H-铬-3-基)乙酸H-色烯-4-基)乙酸（1.89 mmol）溶于7 mL无水溶剂中 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）并置于氮气氛围下。
    9. 将0.33 mL丙炔胺（5.1 mmol）溶于7 mL干燥DMF中，氮气保护下进行。向染料溶液中加入1.30 mL二异丙基乙胺（DIPEA，7.50 mmol），然后加入535 mg O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HCTU，1.29 mmol）。在室温下搅拌活化染料溶液15分钟，然后逐滴加入胺溶液，继续搅拌过夜。
    10. 第二天，用35 mL水稀释反应液，然后减压浓缩。
    11. 将所得橙色固体在250 mL分液漏斗中用乙酸乙酯和饱和食盐水（各100 mL）进行分配。分离两相（将两层液体分别放入不同的烧瓶中），并用100 mL乙酸乙酯洗涤水相。
    12. 在减压条件下浓缩合并的有机相，然后将所得橙色固体重新溶解于3 mL体积比为1:1的乙腈（ACN）/水溶液中。通过进样至配备C18柱的反相中压液相色谱（MPLC）系统对粗产物进行纯化（流动相A：水；流动相B：乙腈）。
    13. 通过LCMS检测馏分纯度（[M+H]）+ = 284.1，以下给出的为核磁共振化学位移），合并并冻干适当馏分，得到2-(7-(二甲氨基)-2-氧代-2-H-色烯-4-基-N-(丙-2-炔-1-基)乙酰胺，核磁共振化学位移如下：
      1H NMR（600 MHz，DMSO-d）6）δ 8.65（t， J = 5.4 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.72 (dd, J = 9.1, 2.6 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.00 (s, 1H), 3.88–3.87 (m, 2H), 3.62 (s, 2H), 3.13 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 3.01 (s, 6H) 13C NMR（125 MHz，DMSO-d）6) δ 167.7, 160.7, 155.4, 152.9, 151.0, 126.0, 109.4, 109.1, 108.1, 97.5, 80.9, 73.3, 39.7, 38.4, 28.2。

2. 荧光抗生素的合成

  1. 按照先前所述方法制备抗生素的叠氮衍生物14,15,16.
    注意：该操作步骤针对每种抗生素具有特异性，需仔细分析母体分子的结构-活性关系（SAR），以确保功能化的抗生素保留与母体分子相当的活性（例如，环丙沙星）。16，利奈唑胺14和甲氧苄啶15）。参见 图1 有关已发表的荧光抗生素实例及通用合成方案。
  2. 点击反应程序 A
    注意：对于大多数抗生素，按照此处详述的铜催化叠氮化物-炔烃（步骤1制备的荧光炔烃）[2+3]休斯根环加成反应（步骤2.1）的程序进行操作。
    1. 将叠氮化物-抗生素置于圆底烧瓶中，并加入 叔丁基-丁醇（tBuOH) 和水（1:1 v/v，每毫摩尔叠氮化物各25 mL）。
    2. 加入第1.1步制备的荧光团-炔（3当量），将反应加热至50 °C。随后加入硫酸铜（水溶液，100 mM，0.6当量），再加入抗坏血酸（水溶液，500 mM，2.4当量）。
    3. 在50 °C下搅拌反应1小时，或直至LCMS分析表明反应完成（起始叠氮化物完全消耗）。
    4. 冷却反应，并根据抗生素骨架的特性选择适当的方法进行纯化，随后按步骤2.3或2.4进行纯化。
      注意：根据骨架分子的极性和稳定性，可采用多种不同的纯化方法。
  3. 点击反应程序 B
    注意：针对基于肽类的抗生素，请遵循本操作步骤，以提供更强的反应条件（未发表工作，Phetsang，2019）。
    1. 将叠氮化物-抗生素肽置于圆底烧瓶中，加入足量 DMF（750 mL/mmol 叠氮）以溶解。
    2. 加入第1步制备的荧光团-炔（5当量），将反应加热至50 °C并保持1小时。
    3. 加入碘化亚铜（20 当量），然后加入 N,N-二异丙基乙胺（120 当量），再加入乙酸（240 当量）。
    4. 在50 °C下搅拌反应1小时，或直至液相质谱（LCMS）分析表明反应完成（即叠氮化物原料完全消耗）。冷却反应液，然后按方法1进行纯化（参见步骤2.3）。
  4. 纯化方法1（用于环丙沙星、甲氧苄啶和利奈唑胺）
    1. 将冷却后的点击反应液直接注入MPLC C18柱中。
    2. 在运行开始时加入一个较长的洗涤阶段（约10分钟，100%溶剂A），然后进行梯度洗脱至100%溶剂B，随后返回溶剂A。
      注意：溶剂A可根据样品的溶解度、稳定性和色谱峰的最佳分离效果，选择水、含0.05–0.1%甲酸（FA）的水溶液或含0.05–0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液。溶剂B应与溶剂A相匹配，可选择乙腈（ACN）、含0.05–0.1% FA的ACN溶液或含0.05–0.1% TFA的ACN溶液。若洗脱困难，可用甲醇替代ACN。
    3. 收集并合并适当的馏分（根据LCMS和颜色指示，出现正确质荷比且为单一峰），然后冻干以得到（半）纯的荧光抗生素。
    4. 如有需要，可进一步纯化产物。使用适用于该骨架结构的色谱柱及方法，通过核磁共振（NMR）和/或液相色谱-质谱联用（LCMS）以及高效液相色谱（HPLC）评估纯度。
  5. 纯化方法2
    注意：如果溶解度允许，可采用水相后处理法进行预纯化（用于大环内酯类化合物，未发表工作，Stone 2019）。
    1. 将冷却后的点击反应液用水和乙醇稀释2O（1:1 体积比，相对于初始反应体积约为10倍稀释），转移至适当大小的分液漏斗中。
    2. 分离各层，并用乙醚将水相洗涤两次2O.
    3. 用等体积的水洗涤合并的有机相两次，然后用 Na 干燥2SO4.
    4. 过滤干燥的有机相，并在减压条件下浓缩。
    5. 按照步骤2.4.4中所述，通过MPLC和/或HPLC对粗产物进行纯化。
      注意：参见 图2 有关不完全、完全及纯化后点击反应的液相色谱-质谱（LCMS）图谱示例，请参见相关图示。抗生素-荧光染料点击反应经纯化后的典型产率范围为30–80%。
      警告：这些合成过程中使用的大多数化学品具有特定的安全危害。必须始终采取预防措施，包括使用个人防护装备。Et2O, tBuOH、FA、乙酸、PE、EA、THF、ACN、DMF、EtOH、DIPEA、丙炔胺和 HCTU 均为易燃物；应避免与热源或火花接触。THF、丙炔胺、DIPEA、 tBuOH、FA、DMF 和 PE 均有毒性，应避免接触。丙炔胺、CsCO₃3，ZnCl2，LiOH·H2O、DIPEA、CuI、FA、乙酸和HCl均具有腐蚀性；避免接触，并注意表面接触风险。ZnCl2，CuSO₄4，CuI 和 PE 具有环境危害性；请注意其处置条件。THF 可形成爆炸性过氧化物；需注意储存条件。有机叠氮化物具有爆炸性；尤其在大规模制备时需格外小心。

3. 抗菌活性评价

注意：所有涉及细菌的操作均应在无菌条件下进行，以避免实验或实验室受到污染。所有培养基在使用前应进行高压灭菌，塑料器皿和移液器等设备必须保持无菌状态。建议在生物安全柜（2级）中进行操作。

  1. 将适用于抗生素骨架的菌株划线接种于溶菌肉汤琼脂（LB，按制造商说明配制）上的甘油保存管中，并在37 °C过夜培养。
    注意：用于测试抗菌活性的细菌选择必须基于所使用的抗生素骨架。应从已知对该抗生素敏感的菌种中选取5–10种具有代表性的细菌，并结合实验室的实际操作能力进行考量。如条件允许，还应测试耐药菌株。以下提供的方案适用于大多数细菌，但需确认是否需要特殊培养条件（例如CO₂培养）。2，特殊培养基），并根据需要进行调整。在这些条件下成功检测的细菌包括 金黄色葡萄球菌、链球菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌 和 粪肠球菌
  2. 从平板上挑取单个菌落，于5 mL阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤（CAMHB，按制造商说明配制）中，在37 °C下过夜培养。
  3. 将过夜培养物在CAMHB中稀释约40倍，并培养至对数中期，600 nm处的光密度（OD600）= 0.4–0.8，体积 5 mL。
  4. 将每种荧光抗生素的储备液用无菌水配制成 1.28 mg/mL 的浓度，并用移液器吸取 10 μL 抗生素加入 96 孔板的第一列中。
  5. 向第一列加入 90 μL CAMHB，其余各孔加入 50 μL。随后在整块板上进行连续2倍稀释。
  6. 充分混匀后，将对数中期培养物稀释至约106 菌落形成单位（CFU）/mL，并向所有孔中加入 50 μL，使终浓度约为 ~5 x 105 CFU/mL

    培养物体积 （mL）=（培养基体积，单位为 mL）/（OD）600 ×1,000

    例如，对于一个OD600 = 0.5 的培养物体积为 12 mL 时，向 12 mL 培养基中加入 (12/(0.5 × 1,000) = 0.024 mL 的培养物
  7. 用培养皿盖盖好，于37 ˚C静置培养18–24小时。
  8. 目视检查平板，最小抑菌浓度（MIC）为无可见生长的最低浓度孔。
    注意：参见 表1 有关活性与非活性荧光抗生素的一些示例。

4. 通过分光光度法和流式细胞术分析探针的积累

注意：这些离心时间已针对大肠杆菌（E. coli）进行优化，其他物种可能需要进行轻微调整。探针累积的代表性数据来自NBD标记的环丙沙星探针。

  1. 将菌株的甘油菌种划线接种于LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。
  2. 从平板上挑取单个菌落，于LB培养基中37 °C过夜培养。
  3. 将过夜培养物在培养基中稀释约50倍，培养至对数中期（OD600 = 0.4–0.8).
  4. 将培养物在 1,470 x g 孵育25分钟，然后吸出培养基。
  5. 将细菌重悬于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，然后以 1,470 x g 15分钟。
  6. 弃去上清液，将洗涤后的沉淀物重悬于PBS中，调整至终末OD600 = 2.
  7. 必要时，向1 mL细菌中加入10.1 μL羰基氰化物-3-氯苯腙（CCCP，10 mM溶于PBS），使终浓度为100 μM，37 ˚C孵育10分钟。
    注意：CCCP 是一种外排泵抑制剂。加入 CCCP 可用于检测外排作用的影响。
  8. 将培养物在18,000 x g条件下离心 g 在20 °C下静置4分钟，然后倾去培养基。
  9. 向沉淀中加入1 mL荧光标记的抗生素溶液（PBS中浓度为10–100 μM），37 °C孵育30分钟。
  10. 将培养物在18,000 x g条件下离心 g 4 °C 下离心 7 分钟，倾去上清液。
  11. 将细菌重悬于1 mL冷PBS中，并重复步骤4.9。
  12. 重复步骤 4.10，共 4 次。
  13. 如需要，可通过加入 180 μL 裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，2 mM 柠檬酸钠EDTA）和 70 μL 溶菌酶（72 mg/mL，溶于 H2O
  14. 37°C孵育30分钟，然后进行3次冻融循环（-78°C 5分钟，随后34°C 15分钟）。
  15. 将样品超声处理20分钟，然后在65 °C下加热30分钟。
  16. 离心裂解后的样品（18,000 x g，8 分钟），然后通过 10 kDa 滤膜过滤。
  17. 用100 μL水洗涤滤膜4次。
  18. 将裂解液转移至平底黑色96孔板中，在酶标仪上使用适合该荧光染料的激发和发射波长测定荧光强度（例如，DMACA：λex = 400 nm，λem = 490 nm；NBD：λex = 475 nm，λem = 545 nm
    注意：参见 图3 以荧光NBD标记的环丙沙星抗生素对细菌进行分光光度分析的示例。
  19. 用于流式细胞术分析时，可采用相同的培养和染色条件（步骤 4.1–4.17），仅在最终制备步骤上有所调整。
    1. 用 PBS 定容至 1 mL。
    2. 在流式细胞仪上以约 60 μL/min 的流速检测样品，数据采集时采用对数放大（F1 激发 = 488 nm；发射 = 525/20 nm）。
    3. 总共记录10,000个事件，然后使用适当的软件分析数据。
    4. 将染色后的细菌的F1荧光强度对事件计数作图，通过直方图峰位估算中位荧光强度。
      注意：参见 图4 以NBD标记的环丙沙星抗生素对细菌进行流式细胞术分析的示例。

5. 显微分析前的准备

  1. 将亚培养物培养至 OD600 = 0.4（方法同 MIC 测定），然后分装为每份 1 mL，于 18,000 × g 离心 3–5 分钟。
  2. 倾去并弃除上清液，将菌体沉淀重悬于 500 μL HBSS 中。
  3. 于 18,000 × g 离心 3 分钟，然后倾去并弃除上清液。
  4. 在 HBSS 中配制抗生素探针溶液，浓度为 1–100 μM。
  5. 将洗涤后的细菌重悬于 500 μL 探针溶液中，于 37 °C 孵育 30 分钟。
  6. 重复步骤 5.3。对于多重标记实验，将沉淀重悬于 500 μL 正交荧光颜色的核酸染料中。绿色选用 Syto9（HBSS 中 5 μM）；蓝色选用 Hoechst 33342（HBSS 中 20 μg/mL）。室温孵育 15–30 分钟。
  7. 重复步骤 5.3，然后将沉淀重悬于 500 μL FM4-64FX（HBSS 中 5 μg/mL），室温孵育 5 分钟。
  8. 重复步骤 5.3，然后将沉淀重悬于 500 μL HBSS 中，并再次重复步骤 5.3。
  9. 重复步骤 5.8，最后将洗涤并染色的细菌重悬于 15 μL 封片剂中（见材料表）。
  10. 将封片剂滴加至显微镜载玻片上，加盖高性能盖玻片，并用透明指甲油密封边缘。
    注：NBD 标记的环丙沙星和甲氧苄啶抗生素的共聚焦显微镜图像示例见图 5，DMACA 标记的噁唑烷酮类（利奈唑胺）抗生素图像见图 6。

结果

图1 展示了荧光抗生素制备过程中的关键点击化学反应（A），以及基于环丙沙星（cipro）、甲氧苄啶（TMP）和利奈唑胺的已发表荧光抗生素结构示例（B）。这些探针均通过相应抗生素经由叠氮化物中间体合成，随后与分别带有炔基官能团的NBD和DMACA荧光团偶联。

图2展示了环丙沙星-N3与NBD-炔烃发生点击反应的液相色谱-质谱（LCMS）图谱示例，其中叠氮化物在3.2分钟时洗脱，产物在3.8分钟时洗脱。通过比较图谱1和2可以看出，点击反应的进程可通过叠氮峰（通过紫外或质谱检测器）的消失来监测。图谱3展示了纯化的效果，质谱和紫外图谱中的错误峰已消失。产物峰及任何杂质峰的积分可用来定量分析反应的纯度和反应进程。

图3 展示了在有或无外排情况下，通过荧光光谱法评估细胞内累积的典型结果。在本实验中， E. coli 用TMP-NBD处理，同时加入或不加入可破坏质子驱动力（PMF）的CCCP。经CCCP预处理后，细菌的胞内荧光显著增强，表明外排作用降低了这些细菌中TMP-NBD的积累。该实验随后在缺乏外排功能相关基因的细菌中重复进行 tolC，展示了该检测方法在研究单个外排泵组分作用方面的能力。在此情况下，尽管与野生型细菌相比，细胞内荧光有所增加，但CCCP的积累量仍然上升。这些结果表明 tolC 参与TMP外排，但并非唯一由质子动力驱动的泵。

图4展示了与图2相同的实验结果，但此处通过流式细胞术而非光谱学来测量积累量。观察到相同的数据趋势，表明任一技术均可用于研究外排介导的细胞内积累现象。

图5展示了分别用荧光探针 TMP-NBD（1）和 cipro-NBD（2 + 3）标记的革兰氏阳性菌（S. aureus）和革兰氏阴性菌（E. coli）的代表性共聚焦显微镜图像。在这两种情况下，均添加了红色膜染料 FM4-64FX，以用于比较共定位情况。对于 TMP-NBD，还使用了蓝色核酸染料 Hoechst-33342。通过叠加这些图像，可直观显示抗生素在细菌中的定位。比较图版 2 和 3 可以看出如何考察外排作用的影响：在图版 2 中加入了外排抑制剂 CCCP，导致探针在细胞内积累；而在图版 3 中未添加 CCCP，因此外排作用处于活跃状态，未观察到探针的积累。

图6展示了用DMACA标记的恶唑烷酮探针Lz-NBD标记的革兰氏阳性菌（S. aureus）的代表性共聚焦显微镜图像。添加了红色膜染料FM4-64FX以比较共定位情况，同时使用了绿色核酸染料Hoechst-33342。通过叠加这些图像，可观察到抗生素在细菌内的定位，显示其定位位于内部，且与膜和核酸的位置明显不同。

表1展示了三类荧光抗生素——环丙沙星、甲氧苄啶（TMP）和利奈唑胺（Lz）的最低抑菌浓度（MIC）值，数据包括母体抗生素及其NBD和DMACA衍生物。每类抗生素均选取了代表性菌种，涵盖革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。在环丙沙星系列中，两种荧光探针与母体药物相比均失去了抗菌活性，但仍对所有测试菌种保持一定的活性。类似地，利奈唑胺探针也损失了部分活性，但仍表现出中等至较弱的抗菌作用。TMP探针对野生型细菌几乎完全丧失活性，但对外排泵缺陷型E. coli仍具有活性，表明其抗菌活性的丧失是由于药物在菌体内无法有效积累所致。

叠氮-炔烃点击反应示意图；抗生素合成途径；环丙沙星、利奈唑胺、甲氧苄啶衍生物。
图1：抗生素衍生探针的合成与结构。（A）由叠氮抗生素与炔烃荧光团合成荧光抗生素探针的通用反应路线。（B）基于环丙沙星、甲氧苄啶和利奈唑胺的已发表探针的结构。请点击此处查看该图的放大版本。

色谱分析结果；环丙沙星和环丙沙星-NBD 峰；光谱分析；化合物分离。
图2：通过液相色谱-质谱法测定抗生素衍生探针的纯度 分析型液质联用（LCMS）图谱来自（1）不完全反应、（2）完全反应和（3）HPLC纯化的环丙沙星-N3 +NBD-炔烃点击反应显示反应完成后起始原料的消失，以及纯化过程中出现的杂峰。A = 紫外-可见吸收谱图（250 nm 处吸光度），B = 质谱谱图（正离子与负离子模式）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

荧光强度柱状图，野生型与ΔtolC，无探针，无CCCP，含CCCP，显著性。
图3：使用微孔板读数仪检测抗生素衍生探针的积累。 对野生型（1，ATCC 25922）和ΔtolC（2，ATCC 25922）E. coli 中TMP-NBD（50 μM）细胞内积累的荧光光谱检测结果，分别在（A）添加和（B）未添加CCCP（100 μM）条件下孵育。统计学显著性（**p ≤ 0.01；***p ≤ 0.001）显示了在有无CCCP之间以及野生型与ΔtolCE. coli 之间的差异。数据表示三次实验的平均值±标准差。本图改编自我们之前的发表文献15，展示了利用光谱学方法阐明外排作用对细胞内积累影响的应用。请点击此处查看此图的放大版本。

显示野生型与 toc 在有/无 CCCP 处理下中位荧光强度的柱状图。
图 4：抗生素来源探针在细胞内积累的流式细胞术检测。 使用 TMP-NBD 检测野生型（1，ATCC 25922）和 ΔtolC（2，ATCC 25922）E. coli 在添加或不添加 CCCP（100 μM）条件下孵育后的细胞内积累情况。结果显示来自 10,000 个细菌事件的中位荧光强度。野生型与 ΔtolCE. coli 之间，以及在有或无 CCCP 存在条件下的统计学显著性差异（***，p ≤ 0.001；****，p ≤ 0.0001）已标出。报告的数据为三次实验的平均值 ± 标准差。本图改编自我们之前的发表文献15，展示了利用流式细胞术阐明外排作用对细胞内积累影响的方法。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜示意图显示使用 Hoechst、TMP-NBD 和 FM4-64 对细菌膜进行定位。
图 5：NBD 探针定位的共聚焦显微镜可视化。 共聚焦显微镜图像显示：1）活体 S. aureus 用 Hoechst-33342（蓝色，核酸）、TMP-NBD（绿色）、FM4-64FX（红色，膜）染色及叠加图像；2）经 CCCP（外排抑制剂）处理的活体 E. coli 用 cipro-NBD（绿色）、FM4-64FX（红色，膜）染色及叠加图像；3）活体 E. coli 用 cipro-NBD（绿色）、FM4-64FX（红色，膜）染色及叠加图像。本图改编自我们之前的发表文献15,16，展示了利用显微镜检测探针定位的方法，包括外排作用的影响。请点击此处查看该图的放大版本。

Lz-DMACA、FM4-64、Sytox Green 及叠加图示的细胞摄取荧光显微镜图像
图6：DMACA探针定位的共聚焦显微镜可视化。 使用恶唑烷酮探针Lz-DMACA（蓝色）、Sytox Green（绿色，核酸）和FM4-64FX（红色，膜）标记的活体S. aureus的共聚焦显微镜图像。请点击此处查看该图的高清版本。

最低抑菌浓度（MIC，µg/mL）
物种菌株环丙沙星（Cipro）Cipro-NBDCipro-DMACA甲氧苄啶（TMP）TMP-NBDTMP-DMACA利奈唑胺（Lz）Lz-NBDLz-DMACA
Staphylococcus aureusATCC 259230.125 - 0.532 - ≥6416116>64
ATCC 43300116>64
Streptococcus pneumoniaeATCC 7006771464
Enterococcus faeciumATCC 356671 - 83232 - ≥64
ATCC 5155921632
Klebsiella pneumoniaeATCC 138830.015 - 0.068 - 168 - 32
Pseudomonas aeruginosaATCC 278530.25 - 132 - ≥6432 - ≥64
Escherichia coliATCC 25922≤0.004820.5>64>64
Mutant ΔtolC0.1250.252

表1. 基于环丙沙星、甲氧苄啶和利奈唑胺的荧光抗生素探针对相应临床相关菌株的抗生素活性，通过肉汤微量稀释法测定其最小抑菌浓度（MIC）。在大多数情况下，这些探针相较于母体药物失去部分活性，但仍保留一定的可测抗生素效力（足以用于后续研究）。

讨论

成功构建荧光抗生素探针必须从周密的规划开始，并充分考虑母体药物的构效关系（SAR）。如果构效关系尚未明确或未被充分研究，则可能需要测试多个修饰位点，以确定一个能够被选择性修饰而不丧失生物活性的位置。一旦确定了合适的修饰位点，通常需要引入连接基团，以便在药物作用的生物活性位点与无活性的荧光团之间提供足够的空间位阻。在将连接基团连接至抗生素时，必须确保所采用的反应生成的是生物稳定性高的官能团，避免引入例如易被体内酯酶水解的酯键。根据抗生素的药效学和药代动力学特性，可选用简单的烷基连接链，或考虑使用亲脂性较低的连接基团，如聚乙二醇（PEG）连接链。在连接基团引入后，应评估其抗菌活性，确保其对相关细菌的最低抑菌浓度（MIC）与母体化合物相近。

在本研究中，我们推荐使用Huigsen叠氮-炔烃[3+2]偶极环加成反应（即点击化学，见图1）将荧光团连接至抗生素，原因如下。点击反应具有高度选择性，因此无需保护抗生素上的活性基团，且反应后生成稳定且生物相容的三唑基团。在我们的实验方案中，将叠氮基团引入抗生素部分，因为相较于引入炔基，这通常更易于在多种结构类型上实现。本文描述了两种炔基修饰荧光团的合成方法，尽管也可根据需要探索其他类型。选择NBD和DMACA是因为它们分子量小，可最大程度降低对细胞穿透和靶标相互作用的干扰。点击反应本身采用铜催化，起始试剂可选用Cu2+（CuSO4，辅以抗坏血酸作为还原剂）或Cu+（CuI）。在纯化后（见图2），应如同测试叠氮化合物一样测定其最低抑菌浓度（MIC）。即使在仔细选择荧光团及连接位点的情况下，仍有可能观察到抗生素活性不佳的结果。然而，这并不意味着无活性的探针毫无用途。如TMP探针所示，抗菌活性较差的化合物仍可能与母体药物结合同一靶标。这有助于研究作用机制，并探究导致耐药性的现象，例如外排作用。

如方案部分所述，可通过简单的分光光度法检测（图3）或流式细胞术（图4）分析荧光标记抗生素对细菌的标记情况。这两种方法均可用于定量细胞内的抗生素积累；通过裂解细胞并检测裂解液中的荧光定位，可进一步评估抗生素在细胞内的积累水平。在本方案中，采用溶菌酶进行细胞裂解，因其是一种快速且通用的技术。其他裂解条件（如使用盐酸甘氨酸过夜处理7）也已被成功应用。利用该技术，可研究外排作用对抗生素细胞内积累的影响，而外排是细菌耐药的重要机制之一。若细菌中确实存在外排作用，则会观察到细胞内积累减少的现象，但该现象可通过添加外排抑制剂（如CCCP）得以逆转。

还可以通过显微镜直观检查探针在不同细菌中的定位情况，从而获取有关作用机制以及潜在耐药性的信息（代表性示例见图5）。为了观察细菌内部的探针定位，需要使用配备高分辨率共聚焦显微镜的设备，其应具备结构光照明显微镜（SIM）、超分辨率SIM（SR-SIM）、Airyscan或受激发射损耗显微镜（STED）等功能。此外，应使用高性能盖玻片，并利用适当的软件（例如FIJI、Zen或Imaris）进行图像采集后的分析。探针的定位通常与特异性染色特定结构的染料进行比较，例如Hoechst-33342（蓝色，核酸）、Syto-9（绿色，核酸）和FM4-64FX（红色，膜结构）。染料的选择应与荧光抗生素相匹配，以确保各荧光通道之间的光谱重叠最小。为了获得最佳成像效果，可能需要进行优化。例如，若载玻片上的细菌过于密集，可仅取部分悬浮沉淀物，并用更多封片介质稀释；相反，若细菌过于稀疏，则可直接增加初始细菌量。在本实验方案中，建议使用适用于活细胞成像的可逆温敏凝胶（如Cygel），因为它能够固定细菌（包括运动性细菌），但其他封片介质或琼脂糖也已被成功应用。

总体而言，尽管在制备具有生物活性的荧光抗生素衍生物时可能面临一些挑战，但其使用简便且用途广泛，这使得这类探针成为抗菌耐药性（AMR）研究中极具吸引力的工具。未来对荧光抗生素的应用有望深入揭示抗生素耐药机制，增进我们对抗生素作用方式的理解，并推动更优药物的研发。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

MRLS 获得了澳大利亚研究生奖学金（APA）和分子生物科学研究所研究 advancement 奖项的支持。Wanida Phetsang 获得了昆士兰大学国际奖学金（UQI）和分子生物科学研究所研究生奖学金（IMBPA）的支持。MAC 是澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）首席研究学者（APP1059354），同时在昆士兰大学担任兼职教授级研究学者，其余时间担任 Inflazome Ltd 公司首席执行官，该公司致力于开发用于解决炎症性疾病临床未满足需求的药物。MATB 部分获得了惠康信托战略资助 WT1104797/Z/14/Z 和 NHMRC 发展资助 APP1113719 的支持。显微成像工作在澳大利亚癌症研究基金会（ACRF）/分子生物科学研究所癌症生物学成像中心完成，该设施的建立得到了 ACRF 的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-(二甲氨基)苯酚Alfa-AesarB23067
4-氯-7-硝基苯并呋喃Sigma-Aldrich163260-5G
Amicon Ultra-0.5 离心滤过装置，含 Ultracel-10 膜MerckUFC501096
Atlantis Prep T3 OBD 柱（100 Å，5 µm，10×250 mm）Waters186008205
Atlantis T3 色谱柱（100 Å，5 µm，2.1 × 50 mm）Waters186003734
Bruker Avance 600 MHz 核磁共振波谱仪Bruker
Buchi Reveleris C18 12 g 小柱BuchiBUC145152103
CCCPSigma-AldrichC2759
Celite 545Sigma-Aldrich22140-5KG-F
CygelABCAMAb109204
Elyra PS.1 SIM/STORM 共聚焦显微镜Zeiss
FM4-64FX，可固定化的 FM™ 4-64 膜染料类似物Life Technologies Australia PtF34653
Gallios 流式细胞仪Beckman Coulter
Gamma 2-16 LSCplus 冷冻干燥机CHRIST
Gilson HPLC 2020Gilson
Hanks' 平衡盐溶液，改良型，含碳酸氢钠，不含酚红、氯化钙和硫酸镁，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养Sigma-AldrichH6648-500ML
Hettich Zentrifugen Rotofix 32Hettich
高性能 #1.5 盖玻片（18 × 18 mm）Schott/Zeiss474030-9000-000
Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物 - 荧光染料Life Technologies Australia PtH21492
LBAMRESCOJ106
Leica STED 3X 超分辨率显微镜，配备白光激光激发系统Leica
溶菌酶（来自鸡蛋清）
冻干粉末		Sigma-AldrichL6876
Mueller Hinton II 肉汤（阳离子调节）Becton Dickinson212322
丙炔胺Sigma-AldrichP50900-5G
Reveleris GRACE 中压液相色谱系统Buchi
Shimadzu LCMS-2020Shimadzu
Sigma 1-15 微型离心机Sigma-Aldrich
用于柱层析的硅胶 60（0.040–0.063 mm，230–400 目 ASTM）Merck1093859025
SYTO 9 绿色荧光核酸染料Life Technologies Australia PtS34854
TECAN Infinite M1000 PROTECAN

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利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性
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