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方法文章

利用明场显微镜定量斑马鱼幼鱼肝脏大小

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DOI：

10.3791/60744

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2020年2月2日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Department of Oncological Sciences, and Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文展示了一种定量分析幼年斑马鱼肝脏大小的方法，可用于评估基因和药物干预对肝脏生长与发育的影响。

摘要

在多种肝细胞癌（HCC）转基因斑马鱼模型中，可在早期幼体阶段观察到肝肿大现象。对斑马鱼HCC模型中幼体肝脏大小进行定量，可快速评估药物及其他干预手段对癌基因相关表型的影响。本文介绍如何固定斑马鱼幼体，解剖肝脏周围组织，利用明场显微镜拍摄肝脏图像，测量肝脏面积并分析结果。该方案可实现对肝脏大小的快速、精确量化。由于本方法基于肝脏面积测量，可能低估肝脏体积的差异，因此需要结合其他方法以区分细胞大小变化与细胞数量变化。本文所述的解剖技术是一种有效工具，可用于在多种下游应用（包括免疫荧光染色和原位杂交）中观察肝脏、肠道和胰腺在其自然位置的形态。所述的幼体肝脏大小定量策略适用于肝脏发育与再生研究的多个方面。

引言

肝细胞癌（HCC）是肝脏最常见的原发性恶性肿瘤1，也是癌症相关死亡的第三大原因2。为了更深入地理解肝癌发生机制并发现潜在的HCC治疗手段，我们及其他研究者已开发出转基因斑马鱼模型，其中在肝细胞中特异性表达β-catenin3,4、Kras(V12)5,6、Myc7或Yap18等癌基因，可在成年斑马鱼中诱导肝细胞癌的发生。在这些斑马鱼模型中，受精后6天（dpf）即可观察到肝脏增大，为检测药物或遗传改变对癌基因驱动的肝脏过度生长的影响提供了便捷的实验平台。准确且精确地测量幼鱼肝脏大小，对于评估这些干预措施的效果至关重要。

在固定后的斑马鱼幼鱼中，可通过CY3-SA标记9对肝脏大小和形状进行半定量评估；在活体斑马鱼幼鱼中，则可利用肝细胞特异性荧光报告系统结合荧光解剖显微镜进行评估5,6。后一种方法相对快速，其精确度不足的问题可通过拍摄图像并使用图像处理软件测量每只肝脏的面积来弥补7,10。然而，在实验中将所有活体幼鱼以一致的方式定位在显微镜下存在技术挑战，这可能导致二维肝脏面积无法准确反映实际肝脏大小。另一种量化肝脏大小的技术是采用光片荧光显微镜定量幼鱼肝脏体积8，当肝脏在不同维度上非均匀扩张时，该方法在检测大小差异方面可能更为准确。荧光激活细胞分选（FACS）可用于计数幼鱼肝脏中荧光标记的肝细胞及其他肝细胞类型的数量8,11。在此方法中，幼鱼肝脏被混合后解离，因此会丢失关于单个肝脏大小和形状的信息。将FACS与其他肝脏大小测定方法结合使用，可区分细胞数量增加（增生）与细胞体积增大（肥大）。上述所有方法均需使用昂贵的荧光技术设备（显微镜或细胞分选仪），且除CY3-SA标记外，均需依赖荧光报告系统对肝细胞进行标记。

本文详细描述了一种利用明场显微镜和图像处理软件对斑马鱼幼体肝脏面积进行定量分析的方法3,12,13,14。该方案能够在不使用荧光显微镜的情况下，对个体斑马鱼肝脏在体内的面积进行精确量化。在分析肝脏大小时，我们对图像身份信息进行盲化处理，以减少研究者的主观偏倚，提高实验的科学严谨性15。

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方案

动物实验均按照犹他大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序进行。

1. 固定幼虫

  1. 在受精后3–7天，使用三卡因甲磺酸盐（0.03%）处死幼鱼，并用玻璃移液管和移液泵将最多15条幼鱼收集至2 mL离心管中。
  2. 在冰上用1 mL冰冷（4 °C）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗幼鱼两次。每次清洗时，用玻璃移液管和移液泵尽可能吸除管中液体，然后向管中加入1 mL冰冷PBS。
  3. 用玻璃移液管和移液泵尽可能吸除PBS，加入1 mL冰冷（4 °C）的含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液。
    注意：PFA具有刺激性，且可能为致癌物。操作PFA时应佩戴手套，浓溶液应在化学通风橱中处理。
  4. 在4 °C下轻轻振荡孵育至少过夜（可长达数月）。

2. 解剖肝脏周围的组织

  1. 用1 mL冰冷（4 °C）的PBS冲洗幼鱼3次，每次间隔轻轻摇晃5分钟，以去除PFA。
    注意：冲洗后的幼鱼可在4 °C的PBS中保存一至两天。
  2. 用移液器将数条含PBS的幼鱼转移至9孔圆底玻璃培养皿的一个孔中。
  3. 去除肝脏周围的皮肤。
    1. 用精细镊子轻轻夹住幼鱼背部（腹部朝上），镊子置于头部两侧尽可能轻柔的位置；另一只手使用极精细的镊子夹住心脏上方的皮肤。
    2. 将皮肤沿对角线方向朝鱼尾及培养皿底部的左侧或右侧拉下。另一侧（右侧或左侧）重复此操作。
    3. 持续夹取皮肤瓣并向下/向后拉扯，直至肝脏上方及周围的所有皮肤和黑色素细胞均被清除。
  4. 如有残留，去除卵黄。
    1. 对于5–6天后受精的幼鱼（5–6 dpf），用精细镊子夹住幼鱼背部固定，再用极精细的镊子轻轻推动卵黄，将其完整剥离。
    2. 对于3–4天后受精的幼鱼（3–4 dpf），将卵黄分块刮除。用精细镊子夹住幼鱼背部固定，使用极精细的镊子从腹侧开始轻轻刮擦卵黄。
  5. 使用玻璃移液管和移液泵将解剖完成的幼鱼转移至新鲜的冷PBS中。

3. 成像

  1. 为固定幼鱼，将几毫升3%甲基纤维素倒入洁净塑料培养皿的皿盖中。
  2. 使用玻璃移液管和移液泵将幼鱼转移至甲基纤维素中，尽量减少随幼鱼带入的PBS液体量。
  3. 在解剖显微镜低倍镜下，用精细镊子调整幼鱼方向，使其右侧朝下、头朝左平躺。
    注意：务必确保幼鱼完全侧卧，否则肝脏测量结果可能不准确。
  4. 对每条幼鱼拍摄图像。
    1. 确认待拍摄幼鱼已完全对齐，两眼上下垂直重叠。如有需要，可用精细镊子轻轻敲击幼鱼头部或尾部以调整方向。若幼鱼尾部弯曲，可用镊子用力夹断尾部，使幼鱼平直躺下。
    2. 切换至高倍镜并聚焦于肝脏，确保肝脏轮廓清晰可见。
    3. 拍摄图像并保存文件。
    4. 重复上述步骤对所有幼鱼进行拍摄，确保每张图像的放大倍数一致。
    5. 使用相同放大倍数拍摄显微测微尺的图像（见图2H）。

4. 图像分析

  1. 使用图像处理软件测量每条鱼肝脏的面积。
    1. 对所有肝脏图片进行盲化处理，以避免潜在的研究者偏倚，提高科学严谨性15。此步骤可由实验室其他成员手动完成，也可使用计算机程序（补充材料）。将文件随机重命名，并创建一个"随机化文件"，其中包含原始文件名与对应盲化后文件名的列表。
    2. 按顺序打开随机化后的文件，从文件1开始。
    3. 选择自由选择工具，勾勒出每个肝脏的轮廓。
    4. 按 Ctrl-M 键测量每个肝脏的面积。
    5. 对于无法准确测量的肝脏，插入一个占位测量值（极小或极大，以便后续容易排除）。
    6. 将测量结果保存到一个文本文件中（"测量文件"）。
  2. 去盲化并分析数据
    1. 在电子表格程序中打开"测量文件"和"随机化文件"。
    2. 在"测量文件"中插入新列，并根据"随机化文件"添加盲化文件对应的原始文件名。将此文件另存为"去盲化测量文件"。
    3. 按原始文件名对数据进行排序。
    4. 务必排除因图像质量不足而无法准确测量的肝脏数据（参见图2A–G）。
    5. 如有需要，将测量值转换为所需的单位（例如 mm2）。
      1. 在图像处理软件中打开比例尺。
      2. 使用直线工具测量比例尺上的1 mm。图像处理软件将以与肝脏相同的单位（像素）进行测量，从而得到转换系数。
      3. 使用该转换系数对"去盲化测量文件"中的测量值进行换算。
    6. 使用电子表格程序或将数据粘贴至科学绘图与统计分析软件中，计算均值、标准差并得出p值。

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结果

表达肝细胞特异性激活型β-catenin的转基因斑马鱼（Tg(fabp10a:pt-β-cat)斑马鱼）3及其非转基因对照同胞在受精后6天（6 dpf）被实施安乐死，使用明场显微镜结合图像处理软件对肝脏面积进行定量分析。与非转基因同胞（0.0004 cm2）相比，转基因斑马鱼的肝脏显著增大（0.0006 cm2，p < 0.0001；图1）。

非转基因斑马鱼与ABC斑马鱼肝脏大小比较；包含显微镜图像和大小图表。
图1：受精后6天（dpf）斑马鱼的肝...

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讨论

肝脏大小的定量分析对于研究肝脏发育、再生及肿瘤发生至关重要。本文所述方案是一种相对快速、简便且经济的幼年斑马鱼肝脏大小定量技术。在执行该方案的某些步骤时采取适当的谨慎措施，有助于提高结果的准确性并减少操作中的困扰。

正确固定幼虫对于获得保存良好的生物样本并防止其解体至关重要。在向清洗后的幼虫加入PFA之前，若未完全去除PBS，则可能导致4% PFA溶液被稀释。使用配制得当的PFA溶液，并在加入PFA前用移液器吸除全部或大部分PBS溶液，有助于解决这一问题。

尽管经过大量练习后该解剖技术操作起来快速且简便，但仍需要较高的手动灵巧性。解剖过程中，必须彻底去除肝脏上方的皮肤和卵黄，以完全暴露整个肝脏。若未做到这一点，可能导致肝脏边界在图像中被遮挡（图2A,B）。解剖时操作不熟练或用力过猛，可能导致部分肝脏被夹断（图2C），或肝脏附着结构松脱，造成肝...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢犹他大学的 Maurine Hobbs 及其中央斑马鱼动物资源中心（CZAR），为本研究的部分工作提供了斑马鱼饲养、实验室空间和设备。CZAR 的扩建工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 #1G20OD018369-01 的支持。我们还要感谢 Rodney Stewart、Chloe Lim、Lance Graham、Cody James、Garrett Nickum 以及亨茨曼癌症研究所（HCI）斑马鱼设施团队在斑马鱼护理方面提供的帮助。我们感谢 Kenneth Kompass 在 R 编程方面的协助。本研究部分由亨茨曼癌症基金会资助（该资助与授予亨茨曼癌症研究所的 P30 CA042014 项目共同支持）（KJE）以及美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）R01CA222570 项目（KJE）提供经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
解剖显微镜用相机Leica，例如
解剖显微镜Leica，例如
精细镊子（Dumont #5）Fine Science Tools11254-20
玻璃移液管VWR14672-608
图像分析软件Image J/FIJIImageJ/FIJI 可免费下载：https://imagej.net/Welcome
甲基纤维素SigmaM0387
多聚甲醛Sigma AldrichP6148
磷酸盐缓冲液多种供应商
移液器泵VWR53502-233
塑料培养皿USA Scientific Inc2906
Pyrex 9孔圆底玻璃培养皿VWR89090-482
用于盲法处理文件的软件R projectR 可免费下载：https://www.r-project.org/
科学绘图与统计分析软件GraphPad Prism
电子表格程序Microsoft Excel
三卡因甲磺酸盐（Tricaine-S）Western Chemical200-226
极精细镊子（Dumont #55）Fine Science Tools11255-20

参考文献

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