使用光明场显微镜定量拉瓦尔斑马鱼的肝脏大小

摘要

在这里，我们演示了一种量化幼虫斑马鱼肝脏大小的方法，提供了一种评估遗传和药理操作对肝脏生长和发育的影响的方法。

摘要

在肝细胞癌（HCC）的几个转基因斑马鱼模型中，在早期幼虫阶段可以观察到肝球菌。在斑马鱼HCC模型中量化幼虫肝大小提供了一种快速评估药物和其他操作对与基因相关的表型的影响的方法。在这里，我们展示如何修复斑马鱼幼虫，解剖肝脏周围的组织，使用明亮的显微显微镜拍摄肝脏，测量肝脏面积，并分析结果。该协议能够快速、精确地定量肝脏大小。由于这种方法涉及测量肝脏面积，它可能会低估肝脏体积的差异，并且需要补充方法来区分细胞大小的变化和细胞数的变化。本文描述的解剖技术是一个很好的工具，用于可视化肝脏、肠道和胰腺的自然位置，用于各种下游应用，包括免疫荧光染色和原位杂交。所述的量化幼肝大小的策略适用于肝脏发育和再生的许多方面。

引言

肝细胞癌（HCC）是肝脏¹最常见的原发性恶性肿瘤，是导致癌症相关死亡的第三大原因^2。为了更好地了解肝癌的机理和识别潜在的HCC治疗，我们和其他人已经开发出转基因斑马鱼，其中肝细胞特异性表达的肿瘤基因，如β-卡泰宁^3，4，克拉斯（V12）5，6，Myc^7，或Yap1⁸导致成年动物的HCC。在这些斑马鱼中，肝增增早在受精后6天（dpf），为测试药物和基因改变对卵基因驱动肝过度生长的影响提供了一个方便的平台。准确和精确测量幼虫肝大小对于确定这些操作的影响至关重要。

肝脏大小和形状可以半定量评估在固定斑马鱼幼虫由CY3-SA标签⁹或活斑马鱼幼虫使用肝细胞特异性荧光报告机和荧光解剖显微镜^5，6。后一种方法比较快，使用图像处理软件^7、10

方案

动物研究按照犹他大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序进行。

1. 修复幼虫

1. 在受精后3~7天（dpf），用三联甲甲烷酸酯（0.03%）对幼虫实施安乐死使用玻璃移液器和移液器泵在 2 mL 管中收集多达 15 个幼虫。
2. 用1mL的冷（4°C）1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）在冰上洗涤幼虫两次。每次清洗时，用玻璃移液器和移液器泵从管中取出尽可能多的液体，然后将 1 mL 的冷 PBS 添加到管中。
3. 使用玻璃移液器和移液器泵尽可能多地去除 PBS，并在 PBS 中加入 1 mL 的冷 （4°C） 4% 甲醛 （PFA）。
   注意:PFA是一种刺激性和可疑的致癌物质。处理 PFA 时应佩戴手套，集中溶液应在化学烟气罩中处理。
4. 在4°C孵育至少一夜之间（但长达数月），轻轻摇动。

2. 解剖肝脏周围的组织

1. 用1 mL的冷（4°C）PBS冲洗3x，并在冲洗之间摇动5分钟，从PFA中去除幼虫。
   注意:在 4°C 下将冲洗过的幼虫在 PBS 中保存一两天是可以的。
2. 将几根幼虫在PBS中放入一个9井圆底玻璃盘的一口井中。
3. 去除肝脏周围的皮肤。
   1. 使用细钳将幼虫放在其背上（腹部向上），尽可能轻轻地抓住头部的两侧。然后用非常精细的钳子在你的另一只手抓住皮肤刚刚....

结果

转基因斑马鱼表达肝细胞特异性活性β-卡特宁（Tg（fabp10a:pt-α-cat）^{斑马鱼3，}非转基因对照兄弟姐妹在6dpf和肝脏区域使用明场显微镜和图像处理软件进行定量。转基因斑马鱼与非转基因兄弟姐妹相比，肝脏尺寸显著增加（0.0006厘米2），（0.0004厘米2，p<0.0001; 图 1.

图1:6 dpf（受精后天）斑马鱼的肝脏大小分析。（A-B）6dpf非转基因斑马鱼幼虫的代表性亮场图像，显示肝脏覆盖肠道的自然位置和形状。肝脏区域已在 （B

讨论

肝脏大小的定量对于旨在了解肝脏发育、再生和肿瘤发生的研究至关重要。这里描述的方案是一种相对快速、简单和廉价的幼虫斑马鱼肝脏大小定量技术。在执行协议的某些方面时，适当谨慎行事有助于提高结果的准确性并减少挫折感。

正确固定幼虫对于获得保存完好的生物样本和防止其解体至关重要。在将 PFA 添加到冲洗的幼虫之前未完全去除 PBS 时，可能会出现 4% PFA 溶液的稀释。在添加 PFA 之前使用制作良好的 PFA 解决方案并移液全部或大部分 PBS 解决方案有助于解决此问题。

虽然经过大量练习后，快速且易于执行，但解剖技术需要大量的手动灵巧性。解剖时，将皮肤和蛋黄从肝脏上方完全去除，使整个肝脏暴露，这一点至关重要。如果不这样做，可能会导致图像中肝脏边界的视图被遮挡 （图 2A，B）。解剖时不熟练和有力的运动可能导致肝脏部分被挤压（图2C）或肝脏附件松.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于解剖显微镜的相机	徕卡，例如
解剖显微镜	徕卡
Fine （Dumont #5） 镊子	Fine Science Tools	11254-20
玻璃移液管	VWR	14672-608
图像分析软件	Image J/FIJI		ImageJ/FIJI 可以免费下载： https://imagej.net/Welcome
甲基纤维素	Sigma	M0387
多聚甲醛	Sigma Aldrich	P6148
磷酸盐缓冲盐水	各种供应商
移液器泵	VWR	53502-233
塑料培养皿	USA Scientific Inc	2906
Pyrex 9 孔圆底玻璃培养皿	VWR	89090-482
盲法文件软件	R 项目		R 可免费下载： https://www.r-project.org/
Scientific 绘图和统计软件	GraphPad Prism
电子表格程序	Microsoft Excel
甲磺酸三卡因 （Tricaine-S）	Western Chemical	200-226
非常细 （Dumont #55） 镊子	精细科学工具	11255-20