本文展示了一种定量分析幼年斑马鱼肝脏大小的方法，可用于评估基因和药物干预对肝脏生长与发育的影响。
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本文内容
摘要
摘要
在多种肝细胞癌（HCC）转基因斑马鱼模型中，可在早期幼体阶段观察到肝肿大现象。对斑马鱼HCC模型中幼体肝脏大小进行定量，可快速评估药物及其他干预手段对癌基因相关表型的影响。本文介绍如何固定斑马鱼幼体，解剖肝脏周围组织，利用明场显微镜拍摄肝脏图像，测量肝脏面积并分析结果。该方案可实现对肝脏大小的快速、精确量化。由于本方法基于肝脏面积测量，可能低估肝脏体积的差异，因此需要结合其他方法以区分细胞大小变化与细胞数量变化。本文所述的解剖技术是一种有效工具，可用于在多种下游应用（包括免疫荧光染色和原位杂交）中观察肝脏、肠道和胰腺在其自然位置的形态。所述的幼体肝脏大小定量策略适用于肝脏发育与再生研究的多个方面。
引言
肝细胞癌（HCC）是肝脏最常见的原发性恶性肿瘤1，也是癌症相关死亡的第三大原因2。为了更深入地理解肝癌发生机制并发现潜在的HCC治疗手段，我们及其他研究者已开发出转基因斑马鱼模型，其中在肝细胞中特异性表达β-catenin3,4、Kras(V12)5,6、Myc7或Yap18等癌基因，可在成年斑马鱼中诱导肝细胞癌的发生。在这些斑马鱼模型中，受精后6天（dpf）即可观察到肝脏增大，为检测药物或遗传改变对癌基因驱动的肝脏过度生长的影响提供了便捷的实验平台。准确且精确地测量幼鱼肝脏大小，对于评估这些干预措施的效果至关重要。
在固定后的斑马鱼幼鱼中，可通过CY3-SA标记9对肝脏大小和形状进行半定量评估；在活体斑马鱼幼鱼中，则可利用肝细胞特异性荧光报告系统结合荧光解剖显微镜进行评估5,6。后一种方法相....
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方案
动物实验均按照犹他大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序进行。
1. 固定幼虫
- 在受精后3–7天，使用三卡因甲磺酸盐（0.03%）处死幼鱼，并用玻璃移液管和移液泵将最多15条幼鱼收集至2 mL离心管中。
- 在冰上用1 mL冰冷（4 °C）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗幼鱼两次。每次清洗时，用玻璃移液管和移液泵尽可能吸除管中液体，然后向管中加入1 mL冰冷PBS。
- 用玻璃移液管和移液泵尽可能吸除PBS，加入1 mL冰冷（4 °C）的含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液。
注意：PFA具有刺激性，且可能为致癌物。操作PFA时应佩戴手套，浓溶液应在化学通风橱中处理。 - 在4 °C下轻轻振荡孵育至少过夜（可长达数月）。
2. 解剖肝脏周围的组织
- 用1 mL冰冷（4 °C）的PBS冲洗幼鱼3次，每次间隔轻轻摇晃5分钟，以去除PFA。
注意：冲洗后的幼鱼可在4 °C的PBS中保存一至两天。 - 用移液器将数条含PBS的幼鱼转移至9孔圆底玻璃培养皿的一个孔中。
- 去除肝脏周围的皮肤。
- 用精细镊子轻轻夹住幼鱼背部（腹部朝上），镊子置于头部两侧尽可能轻柔的位置；另一只手使用极精细的镊子夹住心脏上方的皮肤。 <....
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结果
表达肝细胞特异性激活型β-catenin的转基因斑马鱼（Tg(fabp10a:pt-β-cat)斑马鱼）3及其非转基因对照同胞在受精后6天（6 dpf）被实施安乐死，使用明场显微镜结合图像处理软件对肝脏面积进行定量分析。与非转基因同胞（0.0004 cm2）相比，转基因斑马鱼的肝脏显著增大（0.0006 cm2，p < 0.0001；图1）。
图1：受精后6天（dpf）斑马鱼的肝.......
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讨论
肝脏大小的定量分析对于研究肝脏发育、再生及肿瘤发生至关重要。本文所述方案是一种相对快速、简便且经济的幼年斑马鱼肝脏大小定量技术。在执行该方案的某些步骤时采取适当的谨慎措施，有助于提高结果的准确性并减少操作中的困扰。
正确固定幼虫对于获得保存良好的生物样本并防止其解体至关重要。在向清洗后的幼虫加入PFA之前，若未完全去除PBS，则可能导致4% PFA溶液被稀释。使用配制得当的PFA溶液，并在加入PFA前用移液器吸除全部或大部分PBS溶液，有助于解决这一问题。
尽管经过大量练习后该解剖技术操作起来快速且简便，但仍需要较高的手动灵巧性。解剖过程中，必须彻底去除肝脏上方的皮肤和卵黄，以完全暴露整个肝脏。若未做到这一点，可能导致肝脏边界在图像中被遮挡（图2A,B）。解剖时操作不熟练或用力过猛，可能导致部分肝脏被夹断（图2C），或肝脏附着结构松脱，造成肝.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢犹他大学的 Maurine Hobbs 及其中央斑马鱼动物资源中心（CZAR），为本研究的部分工作提供了斑马鱼饲养、实验室空间和设备。CZAR 的扩建工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 #1G20OD018369-01 的支持。我们还要感谢 Rodney Stewart、Chloe Lim、Lance Graham、Cody James、Garrett Nickum 以及亨茨曼癌症研究所（HCI）斑马鱼设施团队在斑马鱼护理方面提供的帮助。我们感谢 Kenneth Kompass 在 R 编程方面的协助。本研究部分由亨茨曼癌症基金会资助（该资助与授予亨茨曼癌症研究所的 P30 CA042014 项目共同支持）（KJE）以及美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）R01CA222570 项目（KJE）提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 解剖显微镜用相机 | Leica，例如 | ||
| 解剖显微镜 | Leica，例如 | ||
| 精细镊子（Dumont #5） | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 玻璃移液管 | VWR | 14672-608 | |
| 图像分析软件 | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI 可免费下载：https://imagej.net/Welcome | |
| 甲基纤维素 | Sigma | M0387 | |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | P6148 | |
| 磷酸盐缓冲液 | 多种供应商 | ||
| 移液器泵 | VWR | 53502-233 | |
| 塑料培养皿 | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9孔圆底玻璃培养皿 | VWR | 89090-482 | |
| 用于盲法处理文件的软件 | R project | R 可免费下载：https://www.r-project.org/ | |
| 科学绘图与统计分析软件 | GraphPad Prism | ||
| 电子表格程序 | Microsoft Excel | ||
| 三卡因甲磺酸盐（Tricaine-S） | Western Chemical | 200-226 | |
| 极精细镊子（Dumont #55） | Fine Science Tools | 11255-20 |
参考文献
- Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis....
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