本文介绍了评估匹罗卡品诱导的癫痫小鼠记忆障碍的实验方法。该方案可用于研究与癫痫相关的认知功能下降的病理生理机制，这是癫痫最常见的共病之一。
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本文内容
摘要
摘要
认知功能障碍是颞叶癫痫最常见的共病之一。为了在癫痫动物模型中重现与癫痫相关的认知能力下降，我们建立了经匹罗卡品处理的慢性癫痫小鼠模型。本文介绍了一种利用这些癫痫小鼠进行三种不同行为学测试的实验方案：新物体位置识别（NL）、新物体识别（NO）和模式分离（PS）测试，分别用于评估小鼠对空间、物体和情境的学习与记忆能力。我们详细说明了行为学装置的设置方法，并在进行旷场实验（用于测量动物的基础运动活性）之后，提供了NL、NO和PS测试的具体实验操作流程。同时，我们阐述了NL、NO和PS测试在评估癫痫小鼠记忆功能方面相较于其他行为学测试所具备的技术优势。最后，我们讨论了在熟悉阶段癫痫小鼠未能与物体发生至少30秒有效接触的可能原因及相应解决方案，该步骤是成功实施记忆测试的关键环节。因此，本方案系统地提供了利用小鼠评估癫痫相关记忆障碍的详细方法。NL、NO和PS测试是简单高效的检测手段，适用于评估癫痫小鼠多种类型的记忆功能。
引言
癫痫是一种以自发性反复发作为特征的慢性疾病1,2,3。由于反复发作可导致大脑结构和功能异常1,2,3，异常的癫痫活动可能导致认知功能障碍，这是癫痫最常见的共病之一4,5,6。与短暂、瞬时的癫痫发作不同，认知障碍可能在癫痫患者的一生中持续存在，严重影响其生活质量。因此，理解癫痫相关认知功能下降的病理生理机制至关重要。
已有多种癫痫实验动物模型被用于证明与慢性癫痫相关的学习和记忆功能障碍7,8,9,10,11
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方案
所有实验程序均经韩国天主教大学伦理委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第80-23号）进行。
1. 新物体位置测试（NL）
- 在注射匹罗卡品后4–6周，准备癫痫发作的C57BL/6小鼠或转基因小鼠。
注意：通过腹腔（IP）注射匹罗卡品诱导急性癫痫发作，具体操作步骤详见我们之前的研究报告14。 - 在行为学测试开始前一天，将癫痫小鼠从饲养室转移至行为学实验房间，让小鼠适应环境至少12小时（过夜）。
- 在行为学实验室内，将每只小鼠单独分笼饲养。在笼卡上记录每只动物的信息，并在整个行为学测试期间保持使用相同的笼子。可使用推车同时转移多个笼子。
- 次日清晨开始为期3天的适应性训练（H1–H3）。让动物在其家笼中于低光照条件下适应至少30分钟。
- 准备一个敞箱实验装置，外部尺寸为44 × 44 × 31 cm，内部尺寸为43 × 43 × 30.5 cm。在适应性训练第1天（H1），将照度计置于敞箱中央，调节照度至60 lux。
- 使用70%乙醇喷洒敞箱的底部和侧壁，并用干净的纸巾擦拭以去除可能的嗅觉线索。随后等待至少1分钟，直至残留乙醇完全挥发干燥。
- 通过敞箱实验评估每只小鼠的运动活性。
- 使用动物行为视频追踪软件（见材料....
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结果
用于评估认知功能的一般实验时间表和实验设置如图1所示。在匹罗卡品诱导急性癫痫发作6周后，小鼠依次进行NL、NO和PS测试，各测试之间间隔3天的休息期（图1A）。在NL测试中，熟悉阶段（F1）期间将两个相同物体放置于开阔场地内，次日将其中一个物体移至新位置。在NO测试中，测试阶段期间将一个物体替换为新物体。在PS测试中，两次熟悉阶段（F1、F2）引入不同地板网格图案与物体的组合。随后在测试当天，将每个熟悉阶段中的一个物体放置于窄网格地板图案上，使得在窄网格地板背景下有一个物体为新物体（图1B）。开阔场地箱可置于桌面，正下方安装电荷耦合器件摄像机，并用黑色帘布包围，以避免不必要的视觉线索干扰（图2A）。样本物体应选用易于清洁、尺寸与小鼠相近或略大的材料（图2B）。物体组合需预先筛选，以确认同时呈现的两个物体之间无显著偏好差异（
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讨论
本研究描述了评估慢性癫痫小鼠认知功能的实验方法。目前有多种行为学测试范式用于评估小鼠的学习和记忆功能18。其中，莫里斯水迷宫、放射臂迷宫、Y迷宫、情境恐惧条件反射以及基于物体的测试是最常用的行为学检测方法，且能提供可靠的结果。在这些方法中，新位置识别（NL）、新物体识别（NO）和物体位置场景依赖性（PS）测试是评估癫痫小鼠学习与记忆功能的高效且简便的方法8,10。由于癫痫小鼠在行为学实验过程中可能发生意外的自发性癫痫发作，因此最好采用基于动物探索新奇事物自然倾向的行为学测试，而不附加其他正性或负性强化刺激，例如恐惧条件反射、轻度饥饿或为保持漂浮而被迫游泳等厌恶动机任务，这些可能诱发反复发作的癫痫19,20。此外，与其他行为学测试相比，基于新奇性的测试对动物造成的应激较小，因为不需要进行长时间的训练。进一步地，通过简单改变物体位置、引入新物体或结合额外刺激，即.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢李在民博士提供的技术支持。本工作由韩国国家研究基金会（NRF）资助，资助资金来自韩国政府（NRF-2019R1A2C1003958，NRF-2019K2A9A2A08000167）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 ml 注射器 | Sung-shim | 与 26 或 30 号针头配合使用 | |
| 70% 乙醇 | Duksan | UN1170 | 用于喷洒清洁盒子和物体 |
| 黑色帘布 | 用于避免不必要的视觉线索 | ||
| 焦油紫（Cresyl violet） | Sigma | C5042 | 用于焦油紫染色 |
| 冷冻切片机（cryotome） | Leica | E21040041 | 用于组织切片 |
| 双面胶带 | 用于牢固固定物体 | ||
| DPX 封片介质 | Sigma | 06522 | |
| 梯度乙醇系列 | Duksan | UN1170 | 配制 100%、95%、90%、80%、70% 的乙醇溶液 |
| 带细网格图案的地面板 | Leehyo-bio | 行为学实验设备，板尺寸：42.5 × 42.5 × 0.5 cm，网格尺寸：2.75 × 2.75 cm | |
| 带宽网格图案的地面板 | Leehyo-bio | 行为学实验设备，板尺寸：42.5 × 42.5 × 0.5 cm，网格尺寸：5.5 × 5.5 cm | |
| 照度计（illuminometer） | TES Electrical Electronic Corp. | 1334A | 用于测量房间光照（60 Lux） |
| 重症监护单元（Intensive care unit） | Thermocare | #W-1 | |
| 盐酸氯胺酮（ketamine hydrochloride） | Yuhan | 7003 | 用于小鼠经心灌注时的麻醉 |
| LED 灯 | Lungo | P13A-0422-WW-04 | 行为测试室的照明光源 |
| 物体 | 橡胶玩偶、50 ml 塑料管、玻璃 Coplin 染色缸、塑料 T 形培养瓶、玻璃瓶 | ||
| 旷场实验箱（open field box） | Leehyo-bio | 行为学实验设备，尺寸：44 × 44 × 31 cm | |
| 纸巾 | Yuhan-Kimberly | 47201 | 用于擦干旷场箱和物体 |
| 多聚甲醛（paraformaldehyde） | Merck Millipore | 104005 | 配制 4% 溶液 |
| 盐酸匹鲁卡品（pilocarpine hydrochloride） | Sigma | P6503 | |
| 直尺 | 用于在旷场箱中定位物体 | ||
| 硝酸甲基东莨菪碱（scopolamine methyl nitrate） | Sigma | S2250 | 配制 10 倍储备液 |
| Smart system 3.0 | Panlab | 视频追踪系统 | |
| 秒表 | Junso | JS-307 | 用于测量小鼠探索活动时间 |
| 蔗糖（sucrose） | Sigma | S9378 | 用于组织切片的冷冻保护 |
| 硫酸特布他林盐（terbutaline hemisulfate salt） | Sigma | T2528 | 配制 10 倍储备液 |
| 视频摄像机（CCD 摄像机） | Vision | VCE56HQ-12 | 将摄像机置于旷场箱正上方 |
| 赛拉嗪（xylazine，Rompun） | Bayer korea | KR10381 | 用于小鼠经心灌注时的麻醉 |
| 二甲苯（xylene） | Duksan | UN1307 | 用于焦油紫染色 |
参考文献
- Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
- Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7 (4), 348-354 (2007).
- Rakhade, S. N., Jensen, F. E. ....
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