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方法文章

匹罗卡品诱导癫痫小鼠的记忆功能评估

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DOI：

10.3791/60751

⸱

2020年6月4日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Department of Biomedicine & Health Sciences, Catholic Neuroscience Institute, Institute of Aging and Metabolic Diseases, College of Medicine, The Catholic University of Korea

本文内容

摘要

本文介绍了评估匹罗卡品诱导的癫痫小鼠记忆障碍的实验方法。该方案可用于研究与癫痫相关的认知功能下降的病理生理机制，这是癫痫最常见的共病之一。

摘要

认知功能障碍是颞叶癫痫最常见的共病之一。为了在癫痫动物模型中重现与癫痫相关的认知能力下降，我们建立了经匹罗卡品处理的慢性癫痫小鼠模型。本文介绍了一种利用这些癫痫小鼠进行三种不同行为学测试的实验方案：新物体位置识别（NL）、新物体识别（NO）和模式分离（PS）测试，分别用于评估小鼠对空间、物体和情境的学习与记忆能力。我们详细说明了行为学装置的设置方法，并在进行旷场实验（用于测量动物的基础运动活性）之后，提供了NL、NO和PS测试的具体实验操作流程。同时，我们阐述了NL、NO和PS测试在评估癫痫小鼠记忆功能方面相较于其他行为学测试所具备的技术优势。最后，我们讨论了在熟悉阶段癫痫小鼠未能与物体发生至少30秒有效接触的可能原因及相应解决方案，该步骤是成功实施记忆测试的关键环节。因此，本方案系统地提供了利用小鼠评估癫痫相关记忆障碍的详细方法。NL、NO和PS测试是简单高效的检测手段，适用于评估癫痫小鼠多种类型的记忆功能。

引言

癫痫是一种以自发性反复发作为特征的慢性疾病1,2,3。由于反复发作可导致大脑结构和功能异常1,2,3，异常的癫痫活动可能导致认知功能障碍，这是癫痫最常见的共病之一4,5,6。与短暂、瞬时的癫痫发作不同，认知障碍可能在癫痫患者的一生中持续存在，严重影响其生活质量。因此，理解癫痫相关认知功能下降的病理生理机制至关重要。

已有多种癫痫实验动物模型被用于证明与慢性癫痫相关的学习和记忆功能障碍7,8,9,10,11,12。例如，莫里斯水迷宫、情境恐惧条件反射、孔板实验、新物体位置识别（NL）和新物体识别（NO）测试常被用于评估颞叶癫痫（TLE）中的记忆功能障碍。由于海马是TLE出现病理改变的主要脑区之一，因此通常优先选择能够评估依赖海马的记忆功能的行为学测试。然而，鉴于癫痫发作可诱发异常的齿状回神经发生，并促进癫痫相关认知功能下降10，用于检测齿状回新生神经元功能的行为范式（即空间模式分离，PS）8,13也可为癫痫中记忆障碍的细胞机制提供重要信息。

本文中，我们展示了一组用于癫痫小鼠的记忆测试方法，包括NL、NO和PS。这些测试方法简单易行，无需复杂的系统设备。

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方案

所有实验程序均经韩国天主教大学伦理委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第80-23号）进行。

1. 新物体位置测试（NL）

  1. 在注射匹罗卡品后4–6周，准备癫痫发作的C57BL/6小鼠或转基因小鼠。
    注意：通过腹腔（IP）注射匹罗卡品诱导急性癫痫发作，具体操作步骤详见我们之前的研究报告14。
  2. 在行为学测试开始前一天，将癫痫小鼠从饲养室转移至行为学实验房间，让小鼠适应环境至少12小时（过夜）。
  3. 在行为学实验室内，将每只小鼠单独分笼饲养。在笼卡上记录每只动物的信息，并在整个行为学测试期间保持使用相同的笼子。可使用推车同时转移多个笼子。
  4. 次日清晨开始为期3天的适应性训练（H1–H3）。让动物在其家笼中于低光照条件下适应至少30分钟。
  5. 准备一个敞箱实验装置，外部尺寸为44 × 44 × 31 cm，内部尺寸为43 × 43 × 30.5 cm。在适应性训练第1天（H1），将照度计置于敞箱中央，调节照度至60 lux。
  6. 使用70%乙醇喷洒敞箱的底部和侧壁，并用干净的纸巾擦拭以去除可能的嗅觉线索。随后等待至少1分钟，直至残留乙醇完全挥发干燥。
  7. 通过敞箱实验评估每只小鼠的运动活性。
    1. 使用动物行为视频追踪软件（见材料表）记录并追踪每只实验小鼠的行为。
    2. 打开视频追踪软件后，校准敞箱的尺寸，设置追踪区域。设置3秒的延迟时间和15分钟的采集时间，以避免追踪实验人员的手部动作。输入每只实验小鼠的相关信息（分组、性别、年龄等）。
    3. 随后，将实验小鼠轻柔地放入敞箱中，使其面朝箱壁。为尽量减少操作带来的应激和焦虑，可先将其放置于笼盖上，再将其释放至敞箱中距离熟悉化阶段物体最远的箱壁附近（见步骤1.9.3）。
      注意：一旦小鼠进入敞箱，追踪软件将自动检测并开始记录。为实现最佳探索行为追踪，建议将摄像机置于敞箱正上方。
    4. 记录15分钟后，将小鼠通过笼盖转移回其家笼。每次实验之间，使用70%乙醇喷洒敞箱并用干净纸巾擦拭清洁。恢复强光照明，并根据制造商说明，使用视频追踪软件分析小鼠的总移动距离。
      1. 打开视频追踪软件和视频片段，点击分析，根据敞箱尺寸的校准结果计算总移动距离。
  8. 在第2天和第3天，重复步骤1.3至1.7，进行适应性训练（H2、H3）。
  9. 第4天进行熟悉化阶段（F1）。
    1. 在弱光条件下，将每只小鼠放入空敞箱中3分钟。短暂再适应后，将其转移回其家笼。
    2. 在适应期间，使用70%乙醇彻底清洁物体，并用纸巾擦拭。等待至少1分钟，直至残留乙醇完全干燥。
    3. 将两个相同的物体（橡胶玩偶，物体A）放置于敞箱内，距离相邻箱壁5 cm处，并用双面胶固定。将实验小鼠从笼盖放入敞箱，使其面朝远离物体的箱壁。
    4. 允许自由探索20分钟，使用两个秒表手动记录小鼠探索两个物体的时间。当小鼠对两个物体的探索时间均达到最低标准（30秒）时，结束F1阶段并将其转移回其家笼。若小鼠在20分钟内未能对任一物体探索达30秒，则将其移出敞箱，并排除其参与后续实验。
    5. 小鼠移出敞箱后，使用70%乙醇喷洒并彻底清洁敞箱的底部和侧壁，并用纸巾擦拭。
      注意：仅当小鼠用胡须、鼻部或前爪接触物体时，才计入探索时间。若小鼠的鼻部未朝向物体（如坐在物体上、经过物体旁或后躯朝向物体静止），则不计入探索时间。
  10. 第5天进行新位置识别（NL）测试。
    1. 将小鼠从家笼转移至敞箱区域，进行3分钟的再适应，随后将其转移回其家笼。
    2. 在适应期间，使用70%乙醇彻底清洁物体，并用纸巾擦拭。等待至少1分钟，直至残留乙醇完全干燥。
    3. 将其中一个物体（橡胶玩偶，物体A）移动至对角位置，距离相邻箱壁5 cm处，并用双面胶固定。将实验小鼠通过笼盖转移至敞箱区域，使其面朝箱壁。
      注意：为减少动物对特定方向的先天偏好，应对移动物体的位置进行交叉平衡设计。例如，对一半实验动物，移动熟悉化阶段中偏好较高的物体；对另一半，则移动偏好较低的物体。
    4. 允许10分钟自由探索，并使用视频追踪系统记录。使用两个秒表分别记录小鼠探索每个物体的时间，并按以下公式计算辨别指数：
      辨别指数公式，用于评估实验中物体探索时间差异的方程。
      注意：仅当小鼠用胡须、鼻部或前爪接触物体时，才计入探索时间。若小鼠鼻部未朝向物体（如坐在物体上、经过物体旁或后躯朝向物体静止），则不计入探索时间。
    5. 抓住实验小鼠的尾巴，将其放置于笼盖上，转移回其家笼。随后3天（第6–8天）让小鼠自由摄食饮水，充分休息。
    6. 小鼠移出敞箱后，使用70%乙醇喷洒并彻底清洁敞箱的底部和侧壁，并用纸巾擦拭。

2. 新物体识别实验（NO）

  1. 第9天，通过重复步骤1.2–1.7进行一次15分钟的适应期训练。
  2. 第10天，进行熟悉阶段（F1）。
    1. 在弱光条件下，将小鼠放入空旷的开放场中3分钟。在使小鼠重新适应开放场环境后，暂时将其放回其原饲养笼中。
    2. 在适应期间，使用70%乙醇彻底清洁物体，并用纸巾擦干，等待至少1分钟，确保残留酒精完全挥发。
    3. 将两个相同的物体（装有40 mL水的50 mL塑料管，物体B）放置在开放场内，距离相邻墙壁5 cm处，并用双面胶固定。将实验小鼠面朝远离物体的墙壁方向放入开放场箱中。
    4. 由于动物在新物体识别（NO）测试中将接触两种不同的物体（装有40 mL水的50 mL塑料管，物体B；玻璃Coplin染色缸，物体C），因此在F1阶段应对物体进行平衡设计。例如，对组内一半动物在F1阶段呈现两个相同的玻璃Coplin染色缸（物体C）。
    5. 允许自由探索20分钟，并使用两个秒表手动记录探索两个物体的时间。当小鼠对每个物体的探索时间均达到最低标准（30秒）时，结束F1阶段，并将动物转移回其原饲养笼。若小鼠在20分钟内未能对任一物体探索达30秒，则将其移出开放场箱，并排除于后续实验阶段之外。
    6. 在动物离开开放场箱后，使用70%乙醇喷雾彻底清洁箱体的地面和墙壁，并用纸巾擦干。
      注意：当小鼠使用胡须、鼻部或前爪接触物体时，才计入探索时间。以下行为不计入探索时间：小鼠坐在物体上、从物体旁经过、或以尾部朝向物体静止休息等鼻部未指向物体的行为。
  3. 次日（第11天），进行新物体识别（NO）测试阶段。
    1. 将小鼠从其原饲养笼转移至开放场中进行3分钟的再适应，随后将其放回原饲养笼。
    2. 在适应期间，使用70%乙醇彻底清洁物体，并用纸巾擦干，等待至少1分钟，确保残留酒精完全挥发。
    3. 将其中一个物体（装有40 mL水的50 mL塑料管，物体B）替换为另一物体（玻璃Coplin染色缸，物体C），新物体放置于距相邻墙壁5 cm处，并用双面胶固定。将实验小鼠置于笼盖上转移至开放场，并使其面朝墙壁放置。在NO测试中，对配对呈现的物体进行平衡设计。例如，对于在熟悉阶段接触两个玻璃Coplin染色缸（物体C）的小鼠，将其其中一个替换为装有40 mL水的50 mL塑料管（物体B）。
      注意：为减少动物对特定方向的先天偏好，也可对被替换物体的位置进行平衡设计。例如，在每批接触两种物体（物体B或物体C）的动物中，对一半实验动物在熟悉阶段更换其偏好的物体，而对另一半动物则更换其在熟悉阶段较少探索的物体。
    4. 允许10分钟自由探索，并使用视频追踪系统进行记录。使用两个秒表分别测量探索每个物体的时间，并计算辨别指数。
      注意：当小鼠使用胡须、鼻部或前爪接触物体时，才计入探索时间。以下行为不计入探索时间：小鼠坐在物体上、从物体旁经过、或以尾部朝向物体静止休息等鼻部未指向物体的行为。
    5. 抓住实验小鼠的尾巴，将其置于笼盖上并转移回其原饲养笼。随后让小鼠自由摄食饮水，静息3天（第12–14天）。
    6. 在动物离开开放场箱后，使用70%乙醇喷雾彻底清洁开放场箱的地面和墙壁，并用纸巾擦干。

3. 图案分离测试（PS）

  1. 第15天，进行PS测试的第一次熟悉阶段（F1）。
    1. 将小鼠从其饲养笼转移到开阔区域进行再适应，持续3分钟，然后将其放回饲养笼。
    2. 在适应期间，使用70%乙醇彻底清洁物体和带网格的底板，并用纸巾擦拭干净。等待至少1分钟，确保残留酒精完全挥发。
    3. 将带有宽网格（5.5 × 5.5 cm）的底板（42.5 × 42.5 × 0.5 cm）放入开阔场箱中，并在距离相邻箱壁5 cm处放置两个相同的物体（装有50 mL水的塑料T形烧瓶，物体D）。用双面胶固定物体。将实验小鼠面向远离物体的箱壁方向放入开阔场箱中。
    4. 由于在PS测试中动物将接触两种不同的物体（装有50 mL水的塑料T形烧瓶，物体D；玻璃瓶，物体E），因此在F1和F2阶段应对物体进行平衡设计。例如，在该组一半动物中，宽网格底板上使用两个相同的玻璃瓶（物体E）。
    5. 允许自由探索20分钟，使用两个秒表手动记录小鼠探索两个物体的时间。当小鼠对两个物体的总探索时间达到最低标准（30秒）时，结束F1阶段，并将动物转移回饲养笼。若小鼠在20分钟内未能达到30秒的探索时间，则将其移出开阔场箱，并排除在后续实验之外。
      注意：当小鼠用胡须、鼻部或前爪接触物体时开始计时。若动物鼻部未朝向物体的行为（如坐在物体上、从物体旁经过、或后躯朝向物体静止）不应计入探索时间。
    6. 完成第一次熟悉阶段（F1）后，使用70%乙醇喷雾彻底清洁物体和底板，并将其从开阔场箱中移除。
  2. 次日（第16天），进行PS测试的第二次熟悉阶段（F2）。
    1. 将小鼠从其饲养笼转移到开阔区域进行再适应，持续3分钟，然后将其放回饲养笼。
    2. 在适应期间，使用70%乙醇彻底清洁物体和带网格的底板，并用纸巾擦拭干净。等待至少1分钟，确保残留酒精完全挥发。
    3. 将带有窄网格（2.75 × 2.75 cm）的底板（42.5 × 42.5 × 0.5 cm）放入开阔场箱中，并在距离相邻箱壁5 cm处放置两个相同的物体（玻璃瓶，物体E）。用双面胶固定物体。将实验小鼠面向远离物体的箱壁方向放入开阔场箱中。
    4. 为实现平衡设计，在窄网格底板上对另一半动物使用两个相同的塑料T形烧瓶（装有50 mL水，物体D）。
    5. 允许自由探索20分钟，使用两个秒表手动记录小鼠探索两个物体的时间。当小鼠对两个物体的总探索时间达到最低标准（30秒）时，结束F2阶段，并将动物转移回饲养笼。若小鼠在20分钟内未能达到30秒的探索时间，则将其移出开阔场箱，并排除在后续实验之外。
      注意：当小鼠用胡须、鼻部或前爪接触物体时开始计时。若动物鼻部未朝向物体的行为（如坐在物体上、从物体旁经过、或后躯朝向物体静止）不应计入探索时间。
    6. 完成第二次熟悉阶段（F2）后，使用70%乙醇喷雾彻底清洁物体和底板，并将其从开阔场箱中移除。
  3. 次日（第17天），进行PS测试阶段。
    1. 将小鼠从其饲养笼转移到开阔区域进行再适应，持续3分钟，然后将其放回饲养笼。
    2. 在适应期间，使用70%乙醇彻底清洁物体和带网格的底板，并用纸巾擦拭干净。等待至少1分钟，确保残留酒精完全挥发。
    3. 将带有窄网格（2.75 × 2.75 cm）的底板放入开阔场箱中，并在距离相邻箱壁5 cm处放置两个不同的物体（装有50 mL水的塑料T形烧瓶，物体D；玻璃瓶，物体E）。用双面胶固定物体。将实验小鼠置于笼盖上，转移至开阔场区域，并使其面向箱壁。
    4. 在PS测试中对配对呈现的物体进行平衡设计。例如，将每个物体（物体D、物体E）分别置于窄网格底板上，使物体E在此情境中成为新物体。也可通过调整物体D或E在窄网格底板上的位置（即新物体的位置）以减少对特定方向的先天偏好。例如，对一半实验动物替换其在第二次熟悉阶段中偏好的物体，而对另一半动物则替换其在第二次熟悉阶段中较少偏好的物体。
    5. 允许10分钟自由探索，使用视频追踪系统进行记录。使用两个秒表测量小鼠探索每个物体的时间，并计算辨别指数。
      注意：当小鼠用胡须、鼻部或前爪接触物体时开始计时。若动物鼻部未朝向物体的行为（如坐在物体上、从物体旁经过、或后躯朝向物体静止）不应计入探索时间。
    6. 抓住实验小鼠的尾巴，将其放回笼盖上，转移回饲养笼。

4. 焦宁蓝染色

  1. 完成所有行为学测试后，通过腹腔注射（IP；1 mL 注射器；26 G 针头）给予动物氯胺酮（50 mg/mL）和赛拉嗪（23.3 mg/mL）的混合溶液（比例为 4:0.5），剂量为 110 mL/kg 体重，以麻醉动物。通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉深度。
  2. 当动物深度麻醉后，进行经心脏灌注 4% 多聚甲醛以固定脑组织15。
  3. 经心脏灌注完成后，使用剪刀将动物断头15，随后用虹膜剪去除颅骨以暴露脑组织。脑组织取出后，先在 4% 多聚甲醛中后固定过夜，再置于含 30% 蔗糖的 0.01 M 磷酸盐缓冲液中进行冷冻保护。
  4. 使用冷冻切片机对速冻脑组织进行冠状面切片（厚度为 30 μm）。
  5. 将脑组织切片贴附于载玻片上，并依次在 100%、95%、90%、80%、70% 乙醇中各洗涤 3 分钟，完成从 100% 乙醇到自来水的逐级水化步骤。
  6. 将组织切片置于 0.1% 焦油紫溶液中孵育 15 分钟。
  7. 通过将组织切片浸入 95% 乙醇/0.1% 冰醋酸溶液中去除多余染料，随后依次使用 100% 乙醇、50% 乙醇/50% 二甲苯和 100% 二甲苯溶液进行脱水。
  8. 使用市售的二甲苯基封片介质对组织切片进行盖片。

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结果

用于评估认知功能的一般实验时间表和实验设置如图1所示。在匹罗卡品诱导急性癫痫发作6周后，小鼠依次进行NL、NO和PS测试，各测试之间间隔3天的休息期（图1A）。在NL测试中，熟悉阶段（F1）期间将两个相同物体放置于开阔场地内，次日将其中一个物体移至新位置。在NO测试中，测试阶段期间将一个物体替换为新物体。在PS测试中，两次熟悉阶段（F1、F2）引入不同地板网格图案与物体的组合。随后在测试当天，将每个熟悉阶段中的一个物体放置于窄网格地板图案上，使得在窄网格地板背景下有一个物体为新物体（图1B）。开阔场地箱可置于桌面，正下方安装电荷耦合器件摄像机，并用黑色帘布包围，以避免不必要的视觉线索干扰（图2A）。样本物体应选用易于清洁、尺寸与小鼠相近或略大的材料（图2B）。物体组合需预先筛选，以确认同时呈现的两个物体之间无显著偏好差异（

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讨论

本研究描述了评估慢性癫痫小鼠认知功能的实验方法。目前有多种行为学测试范式用于评估小鼠的学习和记忆功能18。其中，莫里斯水迷宫、放射臂迷宫、Y迷宫、情境恐惧条件反射以及基于物体的测试是最常用的行为学检测方法，且能提供可靠的结果。在这些方法中，新位置识别（NL）、新物体识别（NO）和物体位置场景依赖性（PS）测试是评估癫痫小鼠学习与记忆功能的高效且简便的方法8,10。由于癫痫小鼠在行为学实验过程中可能发生意外的自发性癫痫发作，因此最好采用基于动物探索新奇事物自然倾向的行为学测试，而不附加其他正性或负性强化刺激，例如恐惧条件反射、轻度饥饿或为保持漂浮而被迫游泳等厌恶动机任务，这些可能诱发反复发作的癫痫19,20。此外，与其他行为学测试相比，基于新奇性的测试对动物造成的应激较小，因为不需要进行长时间的训练。进一步地，通过简单改变物体位置、引入新物体或结合额外刺激，即...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢李在民博士提供的技术支持。本工作由韩国国家研究基金会（NRF）资助，资助资金来自韩国政府（NRF-2019R1A2C1003958，NRF-2019K2A9A2A08000167）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 ml 注射器Sung-shim与 26 或 30 号针头配合使用
70% 乙醇DuksanUN1170用于喷洒清洁盒子和物体
黑色帘布用于避免不必要的视觉线索
焦油紫（Cresyl violet）SigmaC5042用于焦油紫染色
冷冻切片机（cryotome）LeicaE21040041用于组织切片
双面胶带用于牢固固定物体
DPX 封片介质Sigma06522
梯度乙醇系列DuksanUN1170配制 100%、95%、90%、80%、70% 的乙醇溶液
带细网格图案的地面板Leehyo-bio行为学实验设备，板尺寸：42.5 × 42.5 × 0.5 cm，网格尺寸：2.75 × 2.75 cm
带宽网格图案的地面板Leehyo-bio行为学实验设备，板尺寸：42.5 × 42.5 × 0.5 cm，网格尺寸：5.5 × 5.5 cm
照度计（illuminometer）TES Electrical Electronic Corp.1334A用于测量房间光照（60 Lux）
重症监护单元（Intensive care unit）Thermocare#W-1
盐酸氯胺酮（ketamine hydrochloride）Yuhan7003用于小鼠经心灌注时的麻醉
LED 灯LungoP13A-0422-WW-04行为测试室的照明光源
物体橡胶玩偶、50 ml 塑料管、玻璃 Coplin 染色缸、塑料 T 形培养瓶、玻璃瓶
旷场实验箱（open field box）Leehyo-bio行为学实验设备，尺寸：44 × 44 × 31 cm
纸巾Yuhan-Kimberly47201用于擦干旷场箱和物体
多聚甲醛（paraformaldehyde）Merck Millipore104005配制 4% 溶液
盐酸匹鲁卡品（pilocarpine hydrochloride）SigmaP6503
直尺用于在旷场箱中定位物体
硝酸甲基东莨菪碱（scopolamine methyl nitrate）SigmaS2250配制 10 倍储备液
Smart system 3.0Panlab视频追踪系统
秒表JunsoJS-307用于测量小鼠探索活动时间
蔗糖（sucrose）SigmaS9378用于组织切片的冷冻保护
硫酸特布他林盐（terbutaline hemisulfate salt）SigmaT2528配制 10 倍储备液
视频摄像机（CCD 摄像机）VisionVCE56HQ-12将摄像机置于旷场箱正上方
赛拉嗪（xylazine，Rompun）Bayer koreaKR10381用于小鼠经心灌注时的麻醉
二甲苯（xylene）DuksanUN1307用于焦油紫染色

参考文献

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