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方法文章

在生物材料膜上培养人和羊角膜内皮细胞层

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DOI：

10.3791/60762

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2020年2月6日

 ,  ,  ,  , 
1Queensland Eye Institute, 2King Faisal University, 3School of Biomedical Sciences, Faculty of Health, Queensland University of Technology, 4Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 5Science and Engineering Faculty, Queensland University of Technology, 6Faculty of Medicine, University of Queensland, 7Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, University of Queensland, 8Faculty of Science, University of Western Australia

本文内容

摘要

本方案描述了从人或绵羊组织的外植体中建立和培养角膜内皮细胞培养物所需的关键步骤。同时介绍了一种在膜状生物材料上对角膜内皮细胞进行传代培养的方法。

摘要

角膜内皮细胞培养物在失去细胞间接触后容易发生上皮-间质转化（EMT）。EMT对细胞有害，因其会降低细胞形成成熟且功能性单层的能力。本文介绍一种建立和传代人及绵羊角膜内皮细胞培养物的方法，该方法可最大程度减少细胞间接触的丢失。从供体角膜获取角膜内皮/后弹力膜的组织块，置于组织培养条件下，使细胞能够集体迁移至培养表面。一旦培养物建立，即将组织块转移至新的培养板以启动新培养。使用Dispase II温和地将细胞团块从组织培养板上分离，用于传代。采用本方案建立的角膜内皮细胞培养物适用于转移至生物材料膜上，以制备用于动物实验移植的组织工程化细胞层。文中描述了一种用于在组织培养过程中支撑生物材料膜的定制装置，并展示了一个组织工程移植物的实例：在I型胶原膜的两侧分别构建一层角膜内皮细胞和一层角膜基质细胞。

引言

角膜是位于眼球前部的一种透明组织。它主要由三层结构组成：外层的上皮层、中间的基质层以及内层称为角膜内皮的细胞层。角膜内皮是一层单层细胞，附着于基底膜（即后弹力层）之上，通过调节从下方房水中进入基质层的液体量来维持角膜的透明性。基质层内液体过多会导致角膜水肿、混浊以及视力丧失。因此，内皮层对于维持正常视力至关重要。

角膜内皮可能由于多种原因发生功能障碍，包括衰老、疾病和损伤，目前唯一的治疗方法是移植手术。在该手术中，患者角膜的内皮和后弹力层被移除，并替换为来自供体角膜的内皮和后弹力层移植物。许多内皮移植物还包含一层薄的基质组织，以利于操作以及与受体角膜的附着1。

全球范围内，角膜移植手术对供体角膜组织的需求量超过了眼库所能提供的数量2。因此，人们致力于开发组织工程角膜内皮移植物，以缓解这一短缺状况3。这一策略的理论基础在于：目前，单个供体角膜的内皮仅能用于一位患者；然而，若能先在组织培养中将角膜内皮细胞扩增，并使其生长于生物材料支架上，则可使一份供体组织用于多位患者的治疗。

在组织工程角膜内皮移植成为外科医生可行的选择之前，需要解决的主要挑战包括：（1）建立高质量角膜内皮细胞的扩增技术，以及在体外生成成熟且具有功能的角膜内皮细胞层的技术；（2）建立在生物材料支架上培养细胞的技术，以制造出与目前使用的供体角膜来源移植物相当甚至更优的组织工程移植物。

角膜内皮细胞在体内增殖潜能极低，但可在体外被刺激发生分裂4。然而，这些细胞在体外具有强烈的上皮-间质转化（EMT）倾向，这会降低其形成成熟且功能性内皮层的能力。已知诱导角膜内皮细胞发生EMT的因素包括暴露于某些生长因子以及细胞间接触的丧失5。因此，在传代过程中经酶消化解离的角膜内皮细胞培养物几乎不可避免地会发生与EMT相关的改变。本文介绍一种适用于人或绵羊角膜内皮细胞的细胞培养方法，旨在尽量减少在细胞分离、扩增和传代过程中对细胞间接触的破坏，从而降低EMT的发生风险。此外，我们还展示了如何通过在定制的支架装置中将培养的细胞层生长于生物材料膜的两侧，来制备类似于供体角膜来源的内皮层/后弹力层/基质组织移植物的组织工程移植物。

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方案

在获得捐赠者用于研究的知情同意后，人角膜样本由昆士兰眼库提供，并经昆士兰卫生服务南部大都会医院人类研究伦理委员会伦理批准（HREC/07/QPAH/048）后使用。绵羊角膜样本来自根据组织共享协议在昆士兰大学赫斯顿医学研究设施处实施安乐死的动物。

1. 解剖工具的准备

  1. 通过将两把4号钟表匠镊子浸泡在70%乙醇溶液中5分钟或进行高压灭菌，对其进行灭菌处理。

2. 培养基与组织培养板的准备

  1. 配制100 mL培养基，包含Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1、5%胎牛血清以及100 U/mL青霉素-链霉素。该培养基适用于绵羊角膜内皮细胞培养；然而，对于人角膜内皮细胞培养，需额外添加50 µg/mL牛垂体提取物、0.08%硫酸软骨素、200 µg/mL氯化钙和0.3 mM L-抗坏血酸-2-磷酸。培养基可在4 °C避光条件下保存两周。
  2. 按照生产商说明书，使用贴壁因子对6孔组织培养板的各孔进行包被，然后向每个包被后的孔中加入1 mL培养基。每只角膜对应准备一个孔。

3. 组织块解剖与细胞培养步骤

  1. 将角膜内皮面朝上置于解剖显微镜载物台上的无菌培养皿中。调节照明，使角膜表面充分照亮，并具有足够的对比度以凸显内皮层。调节放大倍数，使角膜边缘及部分中央区域的内皮可见。
  2. 使用灭菌的钟表镊轻轻提起并撕下后弹力层（Descemet's membrane），使其与下方的基质分离（图1）。该膜会以条带状从基质上脱离，并立即卷曲。将此条带放入已包被贴壁因子并含有1 mL培养基的6孔板中的一个孔内。组织培养板的盖子应始终盖上，仅在接种外植体时打开，以降低污染风险。
  3. 首先从内皮的最外周区域取下后弹力层条带，之后再取中央区域的条带。将同一角膜获取的所有条带放入6孔板的同一个孔中。
  4. 将外植体置于设定为5% CO2、37 °C的湿化细胞培养箱中孵育。培养期间静置培养物2天，以使外植体沉降并贴附于培养板表面。通常，最多有三分之一的外植体无法贴壁。
  5. 4天后移除培养基及未贴壁的外植体，并小心加入2 mL新鲜培养基，注意不要扰动已贴壁的外植体。培养基应每周更换两次。

4. 通过连续植块培养法持续生产角膜内皮细胞

注意：10 天后可将外植块转移至新的组织培养板，以建立额外的角膜内皮细胞培养物。

  1. 将外植体培养物置于解剖显微镜的载物台上，调节光源和放大倍数，使外植体清晰可见。
  2. 使用灭菌的钟表匠镊子，轻轻从培养板中夹取每个外植体，并转移至已包被贴附因子并含有1 mL培养基的6孔组织培养板的新孔中。
  3. 让外植体在新培养板表面贴附沉降4天，然后将培养基更换为2 mL新鲜培养基。此后每周更换培养基两次。

5. 在玻璃盖玻片上培养角膜内皮细胞用于免疫荧光分析

注意：用于免疫荧光分析的细胞培养物应接种于玻璃盖玻片上，染色后可将盖玻片封片于载玻片上进行观察。

  1. 将一包直径为13 mm的圆形玻璃盖玻片在高压灭菌器中灭菌，或用70%乙醇浸泡15分钟，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗三次。
  2. 将单个盖玻片放入24孔组织培养板的各孔中，用贴壁因子包被，然后每孔加入0.5 mL培养基。
  3. 使用灭菌的钟表匠镊子将外植体从其组织培养板中取出，转移至含有盖玻片的孔中。让外植体在盖玻片上贴附4天后再更换培养基。
  4. 经过所需的孵育时间后，在培养孔内对盖玻片上的细胞进行固定和染色。将染色后的盖玻片安装到玻璃显微镜载片上，用于荧光显微镜下的分析。

6. 使用Dispase II对角膜内皮细胞进行传代培养

注意：在对6孔板中的组织块培养物进行传代前，可使用本方案选择性地去除较大的成纤维样细胞。若需对所有细胞进行传代，则无需执行步骤6.2至6.4。本方案的目的是在尽可能保持细胞间接触的同时，将细胞转移至新的培养板中。操作过程中应轻柔处理细胞。完全汇合的孔应按1:2的比例传代，而未完全汇合的孔则应按1:1或更低的比例传代。

  1. 移除培养基，并用DPBS短暂冲洗。
  2. 加入1 mL Versene，室温孵育30秒。
  3. 移除Versene，加入1 mL TrypLE，在组织培养箱中37 °C孵育3分钟。
  4. 使用相差显微镜观察培养物。轻轻敲击培养容器，使细胞从培养板上脱落。一旦成纤维样大细胞从板上脱落，立即用1 mL移液器吸除这些细胞和TrypLE。用2 mL DPBS冲洗剩余细胞两次，以去除残留的TrypLE。
  5. 向培养物中加入1 mL 1 mg/mL Dispase II，在组织培养箱中孵育1至2小时，或直至所有细胞从培养板上脱落。细胞应逐渐以团块形式从培养板上漂浮脱落。
  6. 用1 mL移液器收集细胞，转移至50 mL离心管中的20 mL DPBS中。室温下以300 × g 离心5分钟。
  7. 吸除上清液，用1 mL移液器将细胞沉淀在1 mL培养基中轻轻吹打重悬。将细胞悬液转移至6孔板的一个或两个孔中，传代比例分别为1:1或1:2。
  8. 每孔补加培养基至2 mL，将培养物放入组织培养箱中。每周更换两次新鲜培养基，每次2 mL。

7. 生物材料膜上角膜内皮细胞层的培养

注意：以下步骤描述了将膜状生物材料安装至定制的安装装置（称为微型Boyden小室）中以进行细胞培养的过程。有关该装置的更多信息及购买详情，请参阅我们近期的出版物6。

  1. 将红色O形圈放入微型Boyden小室上腔的中心位置，组装其上腔部分。
  2. 使用直径为18 mm的环钻在聚四氟乙烯（PTFE）切割板上的生物材料片上切取一个圆片，并将其放置于微型Boyden小室上腔的红色O形圈上。
  3. 将下腔拧紧至上腔上，使生物材料圆片被牢固夹持在中间。
  4. 将组装好的微型Boyden小室浸泡于70%乙醇中1小时，以进行灭菌处理。
  5. 将灭菌后的微型Boyden小室完全浸入无菌HBSS中10分钟，以去除乙醇残留；重复此洗涤步骤两次。最后用无添加物的培养基洗涤10分钟。
  6. 将灭菌后的微型Boyden小室转移至6孔板的孔中，置于培养基内，确保上腔位于上方。调节培养基液面高度，使其接触生物材料膜的下表面，但不流入上腔内。
  7. 按照第6节所述方法制备角膜内皮细胞悬液。细胞悬液应达到足够密度，以确保在微型Boyden小室的膜上接种密度至少为100,000个细胞/cm2。微型Boyden小室内的培养表面积为0.5 cm2，可容纳100 µL体积，因此应制备含有500,000个细胞/mL的细胞悬液。
  8. 用移液器将100 µL细胞悬液（含50,000个细胞）加入微型Boyden小室的膜上。在组织培养孵箱中孵育4小时后，补充培养基至完全浸没小室。按实验所需时间继续培养，每周更换培养基两次。
    注意：一旦角膜内皮细胞贴附于生物材料膜的上表面，即可将微型Boyden小室在培养孔内翻转，使下腔位于上方。随后可向腔内加入更多细胞，以在膜的另一侧启动新的细胞培养。例如，可将角膜基质细胞直接接种至膜的另一侧，从而模拟后部角膜中不同类型角膜细胞的相对位置。

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结果

从人或绵羊角膜中分离和扩增角膜内皮细胞的方法总结于图1和图2中。来源于1至2岁绵羊或年龄小于30岁的人供体角膜的大多数外植体，通常在一周内会附着于包被有附着因子（Attachment Factor）的组织培养板上；然而，也有约三分之一的外植体在此期间未能附着，这种情况并不罕见。这些“漂浮”的外植体可从培养物中移除。来源于年龄大于30岁人供体的外植体附着于培养板的可能性较低，且产生细胞培养物的可能性也较小。由绵羊和人外植体生成的角膜内皮细胞培养的代表性图像见图3和图4。从外植体迁移出的细胞在向培养板表面迁移过程中通常保持彼此间的接触。这种迁移方式被称为集体细胞迁移，是上皮细胞的一个特征7。培养约2周后，在来自绵羊和人角膜的许多外植体附近，均会形成小而紧密排列的细胞区域8。这些细胞区域不表现出上皮-间质转化（E...

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讨论

建立和扩增人角膜内皮细胞时面临的一个重要技术挑战是防止细胞在培养过程中发生上皮-间质转化（EMT）。角膜内皮细胞在失去细胞间接触时可能触发EMT，然而目前大多数针对这些细胞的培养方案在分离和传代过程中均涉及使用酶将细胞解离为单细胞10。本文提出一种替代性的角膜内皮细胞培养方案，可在细胞分离和传代阶段最大限度地降低细胞间接触丢失的风险。

我们建立角膜内皮细胞培养的方法，是将供体角膜的内皮/后弹力膜组织块置于组织培养板中，在适宜条件下使细胞从膜上集体迁移并附着到培养板上。为确保成功，组织块必须与组织培养板形成紧密贴附，因此在培养建立后的数天内应避免扰动培养板。另一个影响人角膜内皮细胞培养成功建立的关键因素是供体年龄。通常，来自年龄小于30岁的供体的培养成功率更高。

采用组织块培养法建立角膜内皮细胞培养物的一个缺点是，从建立培养到获得大量细胞之间所需时间相对较长。所谓“剥离-消化”法，是指将内皮从供体角膜上剥离下来，并用酶进行消化以释放细胞用于培养1...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢 Noémie Gallorini 在准备图7过程中提供的帮助。本研究由澳大利亚国家卫生与医学研究理事会向 DH 资助的项目基金（项目编号 1099922）以及昆士兰眼科研究所基金会提供的补充资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
黏附因子GibcoS006100含有明胶的1倍无菌溶液，用于包被组织培养表面。4 °C 保存。
牛垂体提取物Gibco13028014单支小瓶含25 mg。分装后冷冻保存。
氯化钙MerckC5670溶于HBSS中配制成1 mM的储存液。过滤除菌。
离心管，50 mlLabtek650.550.050
硫酸软骨素LKT LaboratoriesC2960为牛源性硫酸软骨素。溶于HBSS中配制成0.08 g/mL的储存液。过滤除菌后分装冷冻。
Dispase IIGibco17105-041溶于DPBS中配制成2 mg/mL的储存液。过滤除菌后分装冷冻。
乙醇LabtekEA043100%未变性乙醇应使用去离子水稀释至70%，用于器械和表面的消毒。
胎牛血清GE Healthcare Australia Pty LtdSH30084.03此为HyClone品牌的胎牛血清。
盖玻片 No. 1，Ø 13 mmProscitechG401-13将灭菌后的盖玻片放入24孔板中用于组织培养。
HBSSGibco14025-092Hank's平衡盐溶液，1倍浓度，含氯化钙和氯化镁。
L-抗坏血酸-2-磷酸MerckA8960溶于HBSS中配制成150 mM的储存液。过滤除菌。
微型Boyden小室CNC Components Pty. Ltd.上环：QUT-0002-0006，底环：QUT-0002-0007两个部件均由聚四氟乙烯（PTFE）制成。
微型Boyden小室用O型圈Ludowici Sealing SolutionsRSB012由硅橡胶制成。
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1Gibco51985-034含谷氨酰胺的低血清培养基。
DPBSGibco14190-144Dulbecco's磷酸盐缓冲液，1倍浓度，不含氯化钙和氯化镁。
青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）Gibco15140-122100倍抗生素溶液，含10,000 单位/mL青霉素和10,000 µg/mL链霉素。
培养皿Sarstedt82.14473.001无菌培养皿，92 × 16 mm，用于组织解剖。
组织培养板，24孔Corning IncorporatedCostar 3524含24个孔的培养板，每个孔的表面积为2 cm2。
组织培养板，6孔Corning IncorporatedCostar 3516含6个孔的培养板，每个孔的表面积为9 cm2。
TrypLE SelectGibco12563-0111倍酶溶液，用于细胞解离。
VerseneGibco15040-0661倍EDTA溶液，用于细胞解离。
钟表匠镊子LabtekBWMF44号钟表匠镊子适用于从角膜上剥离内皮层/后弹力层组织条带。

参考文献

  1. Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases. Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).
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  7. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
  8. Walshe, J., Harkin, D. G. Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells. Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).
  9. Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. Cultivation of corneal endothelial cells from sheep. Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).
  10. Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation. Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).
  11. Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas. PLoS One. 6 (12), 28310(2011).

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