利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中的乙醇含量

摘要

本研究介绍了一种利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中乙醇含量的实验方案，内容涵盖从适当的暴露方法到胚胎处理及乙醇分析的全过程。

摘要

胎儿酒精谱系障碍（FASD）描述了一类由乙醇引起的、表现高度可变的发育缺陷连续谱，包括面部畸形和神经功能损伤。由于其病理机制复杂，FASD每年影响约美国出生儿童中的1/100。鉴于FASD的高度异质性，动物模型在当前对乙醇诱导发育缺陷的机制理解中发挥了关键作用。越来越多的实验室开始采用斑马鱼来研究乙醇引起的发育异常。斑马鱼可产生大量体外受精、遗传背景可控且透明的胚胎，这使得研究人员能够在多种遗传背景下精确控制乙醇暴露的时间和剂量，并通过活体成像技术量化胚胎期乙醇暴露的影响。加之斑马鱼在遗传和发育过程上与人类具有高度保守性，使其成为研究乙醇致畸机制的有力模型。然而，不同斑马鱼研究中乙醇暴露方案存在差异，导致跨研究间的数据解释受到干扰。本文提供了一种利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中乙醇浓度的实验方案。

引言

胎儿酒精谱系障碍（Fetal Alcohol Spectrum Disorders, FASD）描述了一组与胚胎期乙醇暴露相关的神经功能障碍及颅面畸形的广泛表型¹多种因素，包括乙醇暴露的时间和剂量以及遗传背景，导致了胎儿酒精谱系障碍（FASD）的差异^2,3在人类中，这些变量之间的复杂关系使得研究和理解胎儿酒精谱系障碍（FASD）的病因极具挑战性。动物模型在揭示乙醇致畸作用的机制基础方面已证明至关重要。多种动物模型系统已被用于研究FASD的各个方面，所得结果与人类暴露情况下的发现 remarkably consistent。⁴啮齿类动物模型系统被用于研究胎儿酒精谱系障碍（FASD）的多个方面，其中小鼠最为常用^5,6,7. 本研究的大部分工作集中于早期乙醇暴露导致的发育缺陷⁸尽管后续暴露于乙醇也被证明会导致发育异常⁹此外，小鼠的遗传特性极大地增强了我们探究胎儿酒精谱系障碍遗传基础的能力^10....

方案

本实验所使用的所有斑马鱼胚胎均按照既定的IACUC方案进行培育和饲养²⁷。这些方案已获得德克萨斯大学奥斯汀分校和路易斯维尔大学的批准。

注意：本研究使用了斑马鱼品系 Tg(fli1:EGFP)^y128。实验中使用的所有水均为无菌反渗透水。所有统计分析均使用 Graphpad Prism v8.2.1 进行。

1. 胚胎培养基的制备

1. 制备20倍浓缩胚胎培养基：将17.5 g NaCl、0.75 g KCl、2.9 g CaCl₂、0.41 g K₂HPO₄、0.142 g Na₂HPO₄ 以及 4.9 g MgSO₄·7H₂O 溶解于1 L 水中。形成的白色沉淀可忽略，不影响培养基效果。对浓缩液进行过滤除菌，并于4 °C 保存。
2. 制备工作浓度胚胎培养基：将1.2 g NaHCO₃ 溶解于1 L 20倍浓缩胚胎培养基中，再加入19 L 水。将工作浓度胚胎培养基维持在28 °C。

2. 利用水的排量测量胚胎体积<....

结果

由于早期胚胎斑马鱼缺乏完全形成的循环系统，因此无法测定其血液乙醇水平。为了确定斑马鱼胚胎中的乙醇浓度，需直接从匀浆化的胚胎组织中测量乙醇含量。为了准确测定胚胎内的乙醇浓度，必须考虑胚胎体积。胚胎（连同卵黄）位于绒毛膜（卵壳）内，并被胚外液所包围（图1）。对胚胎体积的测量必须在暴露处理时进行，因为随着发育时间的推移和胚胎体积的增大，其体积会发生变化。此外，还需考虑胚胎的处理方式以及胚胎体积，因为这两个因素均会引入稀释效应，进而用于计算胚胎内的乙醇水平。

由于胚胎并非完美的球体，尤其是在10 hpf之后，因此采用排水法测定胚胎体积。本研究使用了24 hpf的胚胎，分别测量了带有卵膜的胚胎以及从卵膜中取出的胚胎的体积。带有胚外液的胚胎体积为1.97（± 0.4 SD）μL，而仅胚胎本身的体积为1.1（± 0.22 SD）μL（表1）。这两者之间的差值即为包围在卵膜内胚胎周围的胚外液的体积（图1）。这一差值对于确定样品中仅胚胎部分的乙醇浓.......

讨论

作为发育生物学的模式系统，斑马鱼非常适合研究环境因素对发育的影响。它们可产生大量体外受精的胚胎，便于在乙醇研究中精确控制处理时间和剂量。结合活体成像能力以及与人类在遗传和发育上的保守性，斑马鱼成为畸形学研究中一种强大的模式系统。本文介绍了一种利用顶空气相色谱法测定发育中斑马鱼胚胎内乙醇浓度的实验方案。

确定胚胎中的乙醇浓度对于理解乙醇对发育中胚胎的影响至关重要。在啮齿类动物模型中，血液乙醇浓度与组织浓度相关²⁶。然而，在斑马鱼的早期胚胎发育阶段，无法评估其血液中的乙醇水平。顶空气相色谱法已被用于测量多种实验范式中的乙醇浓度，包括斑马鱼模型^{25,30,31,32,33,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
空气			由合同提供给大学
分析天平	VWR	10204-962
自动进样器 CP-8400	Varian		气相色谱自动进样器
氯化钙	VWR	97062-590
乙醇	Decon Labs	2701
带聚四氟乙烯/硅胶隔垫和塑料盖的2 mL气相色谱小瓶	Agilent	8010-0198	清洗后可重复使用小瓶，但盖子/隔垫不可重复使用
气相色谱仪 CP-3800	Varian
氦气			由合同提供给大学
HP Innowax 毛细管柱	Agilent	19095N-123I	30 m x 0.53 mm x 1.0 μm 膜厚
氢气			由合同提供给大学
硫酸镁（七水合物）	Fisher Scientific	M63-500
1.5 mL 微量离心管	Fisher Scientific	2682002
10 μL 微量移液器吸头	Fisher Scientific	13611106
1000 μL 微量移液器吸头	Fisher Scientific	13611127
200 μL 微量移液器吸头	Fisher Scientific	13611112
100 mm 培养皿	Fisher Scientific	FB012924
Pipetman L p1000L 微量移液器	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L 微量移液器	Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L 微量移液器	Gilson	FA10001M
聚四氟乙烯/硅胶隔垫和塑料盖	Agilent	5190-7021	气相色谱小瓶的替换盖/隔垫
氯化钾	Fisher Scientific	P217-500
磷酸钾（二碱式）	VWR	BDH9266-500G
蛋白酶	VWR	97062-916
0.5 mm 二氧化硅珠	Biospec Products	11079105z
1.0 mm 二氧化硅珠	Biospec Products	11079110z
碳酸氢钠	VWR	BDH9280-500G
氯化钠	Fisher Scientific	S271-500
磷酸钠（二碱式）	Fisher Scientific	S374-500
固相微萃取纤维组件 Carboxen/Polydimethylsiloxane	Millipore Sigma	57343-U	替换用纤维
Star 色谱工作站	Varian		色谱软件
Thermogreen 低流失（LB-2）隔垫	Millipore Sigma	23154	替换进样口隔垫