使用头太空气色谱对斑马鱼胚胎中的乙醇水平进行定量

摘要

这项工作描述了一种使用头部空间气相色谱从适当的暴露方法到胚胎加工和乙醇分析来量化斑马鱼胚胎中乙醇水平的协议。

摘要

胎儿酒精谱系障碍 （FASD） 描述了乙醇引起的发育缺陷的高度可变连续体，包括面部畸形和神经损伤。与复杂的病理学，胎儿外病影响大约每100个孩子在美国出生每年。由于FASD的高度可变性，动物模型在我们目前对乙醇引起的发育缺陷的机械理解中已被证明是至关重要的。越来越多的实验室专注于使用斑马鱼来检查乙醇引起的发育缺陷。斑马鱼产生大量外部受精、遗传可移植的半透明胚胎。这使得研究人员能够精确控制多种遗传环境中乙醇暴露的时间和剂量，并通过活成像技术量化胚胎乙醇暴露的影响。这结合人类对遗传学和发育的高度保护，已经证明斑马鱼是研究乙醇致畸性力学基础的有力模型。然而，不同斑马鱼研究之间的乙醇接触方案各不相同，这混淆了这些研究中对斑马鱼数据的解释。下面是使用头空间气相色谱对斑马鱼胚胎中的乙醇浓度进行量化的协议。

引言

胎儿酒精谱系障碍（FASD）描述了与胚胎^{乙醇暴露相关的}多种神经损伤和颅面畸形。多种因素，包括乙醇暴露的时间和剂量以及遗传背景，都促成了FASD^2，3的变化。在人类中，这些变量的复杂关系使得研究和理解FASD的病因变得具有挑战性。动物模型已经证明对于我们理解乙醇致畸性的机械基础至关重要。各种各样的动物模型系统已经被用来研究FASD的多个方面，结果已经非常一致，在人类接触发现^4。啮齿动物模型系统用于检查FASD的许多方面，其中小鼠是最常见的^5，6，7。这项工作的大部分重点是发育缺陷，以早期乙醇暴露^8，虽然后来接触乙醇已被证明会导致发育异常以及^9。此外，小鼠的遗传能力大大有助于我们探索FASD^10、11的遗传基础的能力。这些小鼠研究强烈表明，有基因-乙醇相互作用与声波刺猪通路， 视黄酸信号，超氧化物歧化酶， 一氧化二氮合成酶 I， Aldh2和Fancd2 ^{8，10，11，12，13，14，15，16，17，1819，20，21}.这些研究表明，动物模型对于促进我们对FASD及其基本机制的理解至关重要。

斑马鱼已成为一个强大的模型系统，以检查乙醇畸变的许多方面^22，23。由于其外受精、高肥力、遗传可遗传性和活成像能力，斑马鱼非常适合研究乙醇畸变的时序、剂量和遗传学等因素。乙醇可以施用精确分期胚胎，然后可以成像研究乙醇在发育过程中的直接影响。这项工作可以直接与人类有关，因为斑马鱼和人类之间的遗传开发程序高度保守，因此可以帮助指导FASD人类研究^24。虽然斑马鱼已经被用来检查乙醇畸形的产生，但缺乏共识报告胚胎乙醇浓度，使得与人类相比困难^25。在哺乳动物系统中，血液-酒精水平与组织乙醇水平直接相关^26。许多斑马鱼研究在胚胎的循环系统完全形成之前治疗。由于没有母体样本进行检测，需要一个评估乙醇浓度的过程来量化胚胎内的乙醇水平。在这里，我们描述了一个过程，以量化乙醇浓度在正在发展的斑马鱼胚胎使用头空间气相色谱。

方案

在这个程序中使用的所有斑马鱼胚胎是在既定的IACUC协议²⁷下培育和繁殖的。这些协议得到了德克萨斯大学奥斯汀分校和路易斯维尔大学的批准。

注:本研究²⁸使用斑马鱼线Tg（fli1:EGFP）y1。 本程序中使用的所有水都是无菌反渗透水。所有统计分析均使用图形板棱镜 v8.2.1 执行。

1. 制造胚胎介质

1. 要制造20x的胚胎介质，溶解17.5克的NaCl，0.75克的KCl，2.9克的CaCl 2，0.41克的K₂HPO_4，0.142克的NA₂HPO_4，以及4.9克的MgSO_4+7H2O在1升水中。忽略形成的白色沉淀物;这不会影响媒体。过滤器对库存溶液进行消毒，并储存在4°C。
2. 要创建工作胚胎介质溶液，在 20x 胚胎介质库存的 1 L 中溶解 1.2 g 的 NaHCO₃并加入 19 L 的水。将工作胚胎介质溶液保持在28°C。

2. 使用水位测量胚胎体积

注:在本协议中，使用24小时后受精（hpf）胚胎（图1）。体积测量中使用的胚胎不用于乙醇分析。

1. 将10个胚胎和胚胎外液体放入1.5 mL微离心管中，标记体积为250μL（图2A）。将水加入 250 μL 填充线（参见图 2 B中带染色水的样品 ）。
2. 重复步骤2.1，为已切除其切口的胚胎设置容器。
   1. 要取出胆囊，将胚胎放入100毫米培养皿中，在室温（RT）下，在胚胎介质中加入2mg/mL蛋白酶鸡尾酒，10分钟。每隔几分钟，轻轻旋转胚胎，以打破胆汁。
   2. 一旦所有的胚胎都摆脱了胆汁，从蛋白酶鸡尾酒/胚胎培养基中取出被切除的胚胎，然后放入一个新的100毫米培养皿中，用新鲜的胚胎介质清洗胚胎。重复此洗涤步骤 1 更多时间（总共 2 次洗涤）。将胚胎转移到新鲜的100毫米培养皿中。
3. 使用尽可能小的尖端，在不损坏胚胎的情况下，使用p200微管器（图2C）小心地从胚胎周围去除所有液体，并用<0.1mg精度对水进行称重。要确定 10 个胚胎的样本体积，请减去从 250 μL 中去除的水的重量/体积（1 mL 水 = 1 克水。要确定单个胚胎的体积，请将 250 μL 与去除的水的重量之差除以 10。

3. 用乙醇治疗胚胎

1. 从交配罐中收集胚胎，放入标准 100 mm 培养皿中。每粒培养皿不超过100个胚胎，在28.5°C孵育。
   注:如果要去除胆汁（步骤 2.2），则需要在添加乙醇之前将其移除。
2. 在 6 hpf 时，将多达 100 个胚胎添加到新的标准 100 mm 培养皿中，使用胚胎介质或胚胎介质 + 1% 乙醇 （v/v）。盖上盖子，但不要密封培养皿。将胚胎置于28.5°C的低温培养箱中，18小时，或直到胚胎达到24 hpf的发育时间点。

4. 在的头部空间气相色谱处理胚胎之前准备工作流程

1. 在水中制作5M NaCl溶液（每个样品管需要450μL），使所有蛋白质变性，防止乙醇代谢。使蛋白酶鸡尾酒 （材料表） 在胚胎培养物中的浓度为 2 mg/mL.
2. 为每个样品标上1.5 mL微离心管和2 mL气相色谱小瓶。为下面描述的乙醇标准以及空气、水和 5 M NaCl/蛋白酶鸡尾酒空白标记额外的 2 mL 气体色谱瓶。
3. 设置三个 p200 微管器，两组设置为 50 μL，第三组设置为 200 μL;p1000 微管器设置为 450 μL，p2 微管器设置为 2 μL。对于用于将胚胎从培养皿转移到 1.5 mL 微离心管的玻璃移液器，请快速通过火焰将移液器尖端穿过火焰，使边缘平滑，在将胚胎拖入移液器时不会损坏胚胎。

5. 用于头空间气相色谱的处理胚胎

注:在计算稀释因子时，其切口中的胚胎和先前从其切口中取出的胚胎都得到相同的处理。

1. 使用设置为 50 μL 的两个 p200 微管器，将蛋白酶鸡尾酒溶液的 50 μL 绘制成一个，并将 50 μL 的水放入第二个溶液中。
2. 使用玻璃移液器和微移液器，快速将10个胚胎（从步骤3.2）放入1.5 mL微离心管中并关闭盖子（如图2A所示）。对所有要测试的样品、对照和乙醇处理胚胎重复上述步骤。
3. 使用设置为 200 μL 的 p200 微管胶，快速打开盖子并取出所有残留的胚胎介质（如图 2C所示）。快速将含有 50 μL 水的移液器放入管中，快速但轻轻（不损坏胚胎）加入，然后取出水。从等待的移液器中快速添加 50 μL 的蛋白酶鸡尾酒溶液，然后关闭管盖（图 2D）。
   注: 一次执行一个示例，执行此过程。
4. 让样品在RT坐10分钟，让蛋白酶鸡尾酒降解胆汁。然后，快速添加 450 μL 的 5 M NaCl 并关闭管盖（图 2E）。将样品涡旋10分钟。为了加快该过程，设置混合器以同时涡涡多个样品。
   注:向任何胚胎超过 24 hpf 的管中加入少量（±100 μL）的硅珠混合物（2 种尺寸、0.5 mm 和 1 mm 珠）。在较老的胚胎中，无论它们被同质化多长时间，诺托德都将保持完好无损。
5. 均质化 10 分钟后，快速去除 2 μL 均质胚胎上清液，并加入气色谱小瓶。使用聚四氟乙烯盖快速密封小瓶。

6. 制定介质和乙醇标准

1. 要准备介质标准，使用 5 M NaCl/蛋白酶鸡尾酒溶液将介质稀释 10 倍。将每个样品的2 μL添加到气体色谱小瓶中，并密封使用聚四氟乙烯盖。
2. 要制定乙醇标准，在 5 M NaCl/蛋白酶鸡尾酒溶液中连续稀释 100% 乙醇，以达到以下浓度:0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 和 40 mM。将每个标准2 μL添加到气体色谱小瓶中，并密封至聚四氟乙烯盖。

7. 准备头部空间气体色谱仪

注: 此设置和协议可能需要根据所使用的气体色谱仪进行更改。头部空间气相色谱用于量化乙醇水平，而不是分离。

1. 将自动进样器的加热器设置为 58°C 并打开。让加热器达到 58°C，并打开供气色谱的空气和氢气管路（用于定量乙醇的火焰电电化）。
   注: psi 应设置为根据制造商的规格正确操作色谱仪。确保氦线已打开并设置为适当的 psi。
2. 对于隔膜，请确保注入的样本数量不是 >100。对于喷射纤维，请确保注入的样品数量不是 >500。
   注: 如果其中任一超过注射量，则需要在运行测试样本之前对其进行更改。
3. 打开分析软件并确保工作站设置正确。根据实验室/部门标准存储所有数据。为要运行的示例创建新的示例列表。
4. 启动启动方法，等待火焰电位化检测器稳定，然后再运行样品。稳定后，运行软件启动方法清洁光纤。

8. 使用头部空间气相色谱进行样品测量

1. 启动方法完成后，在示例列表中每个示例创建 1 个新行。从分析软件的方法菜单中，加载436 电流 spme 乙醇 2013 3min 吸收 2_5min rg 运行。示例列表中每个示例的 METH。
   1. 填写样品清单，从空气、水、5M NaCl/蛋白酶鸡尾酒空白开始。然后按顺序输入标准，从 0.3125 到 40 mM。遵循标准与第二轮的空气，水和5M NaCl/蛋白酶鸡尾酒空白。
   2. 输入所有要测试的同质胚胎上清液样品，从低到高预测乙醇浓度。最后进入第三轮也是最后一轮的空气，水和5M NaCl/蛋白酶鸡尾酒空白。
2. 按输入样品的顺序将气体色谱小瓶添加到自动进样器中。让样品加热10-15分钟。在软件中启动示例运行。
3. 运行完所有示例和最终空白后，通过在示例列表中添加最终示例并运行备用，激活软件中的关闭方法。我TH.备份在示例运行期间获取的所有数据。按以下顺序关闭设备:自动采样器加热器、氢气罐，只有在色谱仪温度达到 30°C 后，空气罐。将氦气罐保持打开以保持蜡柱。

9. 样品乙醇峰集成和样品浓度分析

注: 9.3 的所有值都是在 Excel 文件中计算的，所有方程都预先填充了。

1. 关闭方法完成后，单击"打开色谱图"。打开包含结果的文件夹。样品会自动集成到此程序中。
2. 在结果中，确保已集成正确的峰值（乙醇峰值介于 2 和 2.5 之间）。确认所有样品后，打印或导出结果。
3. 在图表上绘制乙醇标准的峰值高度。计算乙醇标准的斜率、Y 截距值和 R²值（R²应为 >0.99）。
   注:这些值将用于从样品峰值高度确定乙醇浓度。
4. 对于每个样品，从乙醇标准的Y截取中减去样品的峰值高度。将此值除以乙醇标准的斜率，以获得 GC 小瓶中每个样品的乙醇值。

5. 要计算胚胎中的乙醇浓度，首先计算每个样品的稀释系数。采取本协议步骤 2.3 中计算的体积度量，并将其除以体积度量加上 500 μL。这表示在胚胎处理过程中添加到每个样品中的 5 M NaCl/蛋白酶鸡尾酒溶液（步骤 5.3 和 5.4）。

6. 使用此样品稀释因子，乘以每个样品的乙醇样品值。结果将以 mM 浓度表示。通过将介质乙醇值乘以稀释系数 10 来计算介质参考样本。

结果

血液乙醇水平不能确定在早期胚胎斑马鱼，因为它们缺乏一个完全形成的循环系统。为了确定斑马鱼胚胎中的乙醇浓度水平，乙醇水平直接从均质胚胎组织测量。为了正确测量胚胎乙醇浓度，必须考虑胚胎体积。胚胎（附着的蛋黄）位于被胚胎外流体包围的胆囊（蛋壳）内（图1）。胚胎的任何体积测量都必须在胚胎暴露时进行，因为胚胎体积会随着胚胎大小的增大而改变。此外，还必须考虑到胚胎的加工方式以及胚胎体积，因为这两个元素都会产生稀释因子，用于计算胚胎乙醇水平。

因为胚胎不是一个完美的球体，特别是在10hpf之后，水位位被用来评估胚胎体积。这项研究使用24 hpf的胚胎。测量了胚胎的体积，以及从其胆囊中取出的胚胎的数量。这些体积为1.97（± 0.4 SD）μL，用于胚胎外流动的胚胎，1.1 （± 0.22 SD） =L（表1）。胚胎外体液和胚胎本身之间的这种区别是胚胎外流体的体积，它环绕着胚胎在胆囊内（图1）。这种差异对于确定样品中胚胎的乙醇浓度至关重要。根据分...

讨论

斑马鱼作为一种开发模型系统，非常适合研究环境因素对发展的影响。他们产生大量的外部受精胚胎，这允许在乙醇研究中精确计时和剂量范式。这与活成像能力以及人类的遗传和发育保护相结合，使斑马鱼成为teratology研究的强大模型系统。本文使用头空间气相色谱法测量斑马鱼胚胎的胚胎乙醇浓度。

确定胚胎乙醇浓度对于了解乙醇对发育中的胚胎的影响至关重要。在啮齿动物模型中，血液乙醇浓度与组织浓度²⁶相关。然而，在斑马鱼的早期胚胎发育中，不可能评估血液乙醇水平。头太空气色谱已被用来测量乙醇水平的各种实验范式，包括斑马鱼25，30，31，32，33，34，35。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
空气			由大学合同提供
分析天平	VWR	10204-962
自动进样器， CP-8400	瓦里安		气相色谱仪 自动进样器
氯化钙	VWR	97062-590
乙醇	Decon Labs	2701
带聚四氟乙烯/硅胶隔垫和塑料盖的气相色谱样品瓶 2 mL	Agilent	8010-0198	清洁后可以重复使用样品瓶，但不能重复使用瓶盖/隔垫
气相色谱仪，CP-3800	瓦里安
氦			按合同提供给大学
HP Innowax 毛细管柱	Agilent	19095N-123I	30 m x 0.53 mm x 1.0 μm 膜厚
Hyrdogen			由大学合同提供
硫酸镁（七水合物）	Fisher Scientific	M63-500
微量离心管 1.5 mL	Fisher Scientific	2682002
移液器吸头 10 μL	Fisher Scientific	13611106
微量移液器吸头 1000 μL	Fisher Scientific	13611127
微量移液器吸头 200 μL	Fisher Scientific	13611112
培养皿 100 mm	Fisher Scientific	FB012924
Pipetman L p1000L 微量移液器	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L 微量移液器	Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L 微量移液器	Gilson	FA10001M
聚四氟乙烯/硅胶隔垫和塑料瓶	Agilent	5190-7021	气相色谱样品瓶替换瓶盖/隔垫
氯化钾	Fisher Scientific	P217-500
磷酸钾（二元）	VWR	BDH9266-500G
链霉蛋白酶	VWR	97062-916
硅胶珠 .5 mm	Biospec Products	11079105z
硅胶珠1.0 mm	Biospec 产品	11079110z
碳酸氢钠	VWR	BDH9280-500G
氯化钠	Fisher Scientific	S271-500
磷酸钠（二元）	Fisher Scientific	S374-500
固相微萃取纤维组件 羧蛋白/聚二甲基硅氧烷	Millipore Sigma	57343-U	替换纤维头
星形色谱工作站	Varian		色谱软件
Thermogreen 低流失 （LB-2） 隔垫	Millipore Sigma	23154	更换入口隔垫