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方法文章

利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中的乙醇含量

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DOI：

10.3791/60766

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2020年2月11日

1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville

本文内容

摘要

本研究介绍了一种利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中乙醇含量的实验方案，内容涵盖从适当的暴露方法到胚胎处理及乙醇分析的全过程。

摘要

胎儿酒精谱系障碍（FASD）描述了一类由乙醇引起的、表现高度可变的发育缺陷连续谱，包括面部畸形和神经功能损伤。由于其病理机制复杂，FASD每年影响约美国出生儿童中的1/100。鉴于FASD的高度异质性，动物模型在当前对乙醇诱导发育缺陷的机制理解中发挥了关键作用。越来越多的实验室开始采用斑马鱼来研究乙醇引起的发育异常。斑马鱼可产生大量体外受精、遗传背景可控且透明的胚胎，这使得研究人员能够在多种遗传背景下精确控制乙醇暴露的时间和剂量，并通过活体成像技术量化胚胎期乙醇暴露的影响。加之斑马鱼在遗传和发育过程上与人类具有高度保守性，使其成为研究乙醇致畸机制的有力模型。然而，不同斑马鱼研究中乙醇暴露方案存在差异，导致跨研究间的数据解释受到干扰。本文提供了一种利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中乙醇浓度的实验方案。

引言

胎儿酒精谱系障碍（Fetal Alcohol Spectrum Disorders, FASD）描述了一组与胚胎期乙醇暴露相关的神经功能障碍及颅面畸形的广泛表型1多种因素，包括乙醇暴露的时间和剂量以及遗传背景，导致了胎儿酒精谱系障碍（FASD）的差异2,3在人类中，这些变量之间的复杂关系使得研究和理解胎儿酒精谱系障碍（FASD）的病因极具挑战性。动物模型在揭示乙醇致畸作用的机制基础方面已证明至关重要。多种动物模型系统已被用于研究FASD的各个方面，所得结果与人类暴露情况下的发现 remarkably consistent。4啮齿类动物模型系统被用于研究胎儿酒精谱系障碍（FASD）的多个方面，其中小鼠最为常用5,6,7. 本研究的大部分工作集中于早期乙醇暴露导致的发育缺陷8尽管后续暴露于乙醇也被证明会导致发育异常9此外，小鼠的遗传特性极大地增强了我们探究胎儿酒精谱系障碍遗传基础的能力10,11这些在小鼠中开展的研究强烈提示，乙醇与 sonic hedgehog 信号通路、视黄酸信号之间存在基因-乙醇相互作用， 超氧化物歧化酶，一氧化氮合酶I，Aldh2 和 Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21这些研究表明，动物模型对于增进我们对胎儿酒精谱系障碍（FASD）及其潜在机制的理解至关重要。

斑马鱼已成为研究乙醇致畸作用多个方面的强大模型系统22,23。由于其具有体外受精、繁殖力高、遗传操作性强以及活体成像能力等优势，斑马鱼非常适合用于研究乙醇致畸作用的时间、剂量和遗传因素。乙醇可被精确地施用于特定发育阶段的胚胎，随后通过成像技术观察乙醇在发育过程中产生的直接影响。这项研究可直接与人类相关联，因为斑马鱼与人类的发育遗传程序高度保守，因此有助于指导胎儿酒精谱系障碍（FASD）的人类研究24。尽管斑马鱼已被用于研究乙醇致畸作用，但在胚胎乙醇浓度报告方面缺乏统一标准，使得与人类的比较变得困难25。在哺乳动物系统中，血液酒精浓度与组织中的乙醇浓度直接相关26。许多斑马鱼研究在胚胎循环系统完全形成之前即进行处理，由于缺乏母体样本可供检测，因此需要一种评估乙醇浓度的方法来量化胚胎内的乙醇水平。本文中，我们描述了一种利用顶空气相色谱法测定发育中斑马鱼胚胎内乙醇浓度的方法。

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方案

本实验所使用的所有斑马鱼胚胎均按照既定的IACUC方案进行培育和饲养27。这些方案已获得德克萨斯大学奥斯汀分校和路易斯维尔大学的批准。

注意：本研究使用了斑马鱼品系 Tg(fli1:EGFP)y128。实验中使用的所有水均为无菌反渗透水。所有统计分析均使用 Graphpad Prism v8.2.1 进行。

1. 胚胎培养基的制备

  1. 制备20倍浓缩胚胎培养基：将17.5 g NaCl、0.75 g KCl、2.9 g CaCl2、0.41 g K2HPO4、0.142 g Na2HPO4 以及 4.9 g MgSO4·7H2O 溶解于1 L 水中。形成的白色沉淀可忽略，不影响培养基效果。对浓缩液进行过滤除菌，并于4 °C 保存。
  2. 制备工作浓度胚胎培养基：将1.2 g NaHCO3 溶解于1 L 20倍浓缩胚胎培养基中，再加入19 L 水。将工作浓度胚胎培养基维持在28 °C。

2. 利用水的排量测量胚胎体积

注意：本方案中使用受精后24小时（hpf）的胚胎（图1）。用于体积测量的胚胎不用于乙醇分析。

  1. 将10个胚胎及胚外液置于已标记体积的1.5 mL微量离心管中 250 μL (图2A）。加水至 250 μL 填充管线（参见含染色水的样品） 图2B).
  2. 重复步骤 2.1，为已去除绒毛膜的胚胎设置培养容器。
    1. 为去除卵膜，将带有卵膜的胚胎置于盛有胚胎培养液的100 mm培养皿中，加入终浓度为2 mg/mL的蛋白酶混合液，在室温（RT）下处理10分钟。每隔几分钟轻轻晃动胚胎，以破裂卵膜。
    2. 所有胚胎脱去绒毛膜后，将去膜胚胎从蛋白酶混合液/胚胎培养基中取出，放入盛有新鲜胚胎培养基的新100 mm培养皿中清洗胚胎。重复此清洗步骤1次（共清洗2次）。将胚胎转移至另一个洁净的100 mm培养皿中。
  3. 使用尽可能细小的枪头，小心地用 P200 移液器从胚胎周围去除所有液体，避免损伤胚胎图2C）并使用天平称量水的重量 <0.1 mg 精度。为确定 10 个胚胎样本的体积，需减去从样本中移除的水的质量/体积（1 mL 水 = 1 g 水）。 250 μL. 为确定单个胚胎的体积，将两者之间的差值除以 250 μL 以及通过10去除的水的重量

胚胎体积计算公式：体积 = 250μL - 移除水的重量；公式分析。

胚胎体积计算公式，表示为方程：Volume_sample/10。

3. 用乙醇处理胚胎

  1. 从交配缸中收集胚胎，并置于标准的 100 mm 培养皿中。每个培养皿中放置的胚胎数量不超过 100 个，并在 28.5 °C 下孵育。
    注意：如果需要去除绒毛膜（步骤 2.2），则必须在添加乙醇前完成去除。
  2. 在受精后 6 小时（6 hpf），将最多 100 个胚胎转移至新的标准 100 mm 培养皿中，培养基为胚胎培养液或含 1% 乙醇（v/v）的胚胎培养液。盖上皿盖，但切勿密封培养皿。将胚胎置于设定为 28.5 °C 的低温培养箱中孵育 18 小时，或直至胚胎发育至 24 hpf 的发育阶段。

4. 胚胎处理前用于顶空气相色谱分析的准备工作流程

  1. 配制5 M NaCl水溶液（每个样品管需要450 μL），用于使所有蛋白质变性并防止乙醇代谢。在胚胎培养基中配制蛋白酶混合液（材料表），浓度为2 mg/mL。
  2. 为每个样品标记一个1.5 mL微量离心管和一个2 mL气相色谱小瓶。另为下述乙醇标准品、空气、水以及5 M NaCl/蛋白酶混合液空白样品分别标记额外的2 mL气相色谱小瓶。
  3. 准备三支p200移液器，其中两支设定为50 μL，第三支设定为200 μL；一支p1000移液器设定为450 μL，以及一支p2移液器设定为2 μL。对于用于将胚胎从培养皿转移至1.5 mL微量离心管的玻璃移液管，需快速将管尖通过火焰灼烧以使边缘光滑，避免吸取胚胎时对其造成损伤。

5. 胚胎顶空气相色谱分析的处理

注意：为了在计算稀释因子时保持一致性，无论胚胎是否仍处于绒毛膜内，均采用相同的处理方式。

  1. 使用两支已设定为 50 μL 的 p200 微量移液器，分别吸取 50 μL 蛋白酶混合液至其中一支，另一支吸取 50 μL 水。
  2. 使用玻璃移液管和微量移液器，迅速将 10 个胚胎（来自步骤 3.2）放入 1.5 mL 微离心管中，并盖紧管盖（如 图 2A 所示）。对所有待测样本、对照组以及乙醇处理的胚胎重复此操作。
  3. 使用设定为 200 μL 的 p200 微量移液器，迅速打开管盖并吸除所有残留的胚胎培养液（如 图 2C 所示）。迅速将装有 50 μL 水的移液器插入管中，快速但轻柔地加入水后再吸出，以免损伤胚胎。随后立即从待用的移液器中加入 50 μL 蛋白酶混合液，并盖紧管盖（图 2D）。
    注意：该操作应逐个样本进行。
  4. 让样本在室温下静置 10 分钟，使蛋白酶混合液降解卵膜。然后迅速加入 450 μL 5 M NaCl，并盖紧管盖（图 2E）。将样本涡旋振荡 10 分钟。为加快进程，可设置混合器同时对多个样本进行涡旋。
    注意：对于发育超过 24 hpf 的胚胎，向管中加入少量（约 100 μL）硅胶珠混合物（两种尺寸：0.5 mm 和 1 mm 珠）。在较老的胚胎中，无论匀浆时间多长，脊索将保持完整。
  5. 匀浆 10 分钟后，迅速取出 2 μL 匀浆胚胎上清液，加入气相色谱小瓶中。立即用聚四氟乙烯盖密封小瓶。

6. 准备培养基和乙醇标准品

  1. 制备培养基标准品时，用 5 M NaCl/蛋白酶混合液将培养基稀释 10 倍。取每种样品各 2 μL 加入气相色谱瓶中，并用聚四氟乙烯盖密封。
  2. 制备乙醇标准品时，将 100% 乙醇用 5 M NaCl/蛋白酶混合液进行系列稀释，得到以下浓度：0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 和 40 mM。取每种标准品各 2 μL 加入气相色谱瓶中，并用聚四氟乙烯盖密封。

7. 准备顶空气相色谱仪

注意：此装置和方案可能需要根据所使用的气相色谱仪进行调整。顶空气相色谱法用于定量乙醇含量，而非用于分离。

  1. 将自动进样器的加热器设置为 58 °C 并打开。让加热器达到 58 °C，并打开通往气相色谱仪的空气和氢气气体线路（用于火焰离子化检测以定量乙醇）。
    注意：应根据制造商的规格设置适当的 psi，以确保色谱仪正常运行。确保氦气管线已打开并设置为适当的 psi。
  2. 对于隔膜，需确保注入的样品数量不是 >100. 对于进样纤维，需确保注入的样品数量不超过 >500.
    注意：如果其中任意一项超过注射次数，则在运行测试样本前需要进行更换。
  3. 打开分析软件，确保工作站已正确设置。根据实验室/部门标准存储所有数据。为待测样品创建新的样品列表。
  4. 启动方法并等待火焰离子化检测器稳定后再运行样品。检测器稳定后，运行软件启动方法以清洗进样纤维。

8. 使用顶空气相色谱法进行样品检测

  1. 启动方法完成后，在样本列表中为每个样本创建 1 个新行。从分析软件的方法菜单中，为样本列表上的每个样本加载 436 Current spme ethanol 2013 3min absorb 2_5min rg run.METH。
    1. 填写样本列表，首先输入空气、水、5 M NaCl/蛋白酶混合液空白样本，然后按顺序输入标准品，浓度从 0.3125 mM 到 40 mM。标准品之后，再次输入第二轮空气、水和 5 M NaCl/蛋白酶混合液空白样本。
    2. 输入所有待测的匀浆胚胎上清液样本，按预测乙醇浓度从低到高排列。最后输入第三轮也是最终一轮的空气、水和 5 M NaCl/蛋白酶混合液空白样本。
  2. 按照样本列表中输入的顺序，将气相色谱小瓶加入自动进样器。让样本预热 10–15 分钟。在软件中启动样本运行。
  3. 所有样本及最终空白样本运行结束后，在样本列表中添加最后一个样本并运行 standby.METH，通过软件激活关机方法。备份样本运行期间获取的所有数据。按以下顺序关闭设备：自动进样器加热器、氢气瓶，只有当色谱仪温度降至 30 °C 后，再关闭空气瓶。氦气瓶保持开启，以保护石蜡柱。

9. 样品乙醇峰积分与样品浓度分析

注意：从 9.3 开始的所有数值均在 Excel 文件中计算得出，所有方程已预先填入。

  1. 关闭方法完成后，单击 打开 色谱图。打开包含结果的文件夹。该程序会自动对样品进行积分。
  2. 在结果中，确保已对正确的峰进行了积分（乙醇峰位于 2 至 2.5 之间）。确认所有样品后，打印或导出结果。
  3. 绘制乙醇标准品的峰高图。计算斜率、Y轴截距和R2 乙醇标准品的数值（R2 应为 >0.99).
    注意：这些数值将用于根据样品峰高确定乙醇浓度。
  4. 对于每个样品，从乙醇标准品的Y轴截距中减去该样品的峰高，将所得数值除以乙醇标准品的斜率，从而得到每个GC小瓶中样品的乙醇含量值。

乙醇浓度计算公式方程、乙醇含量示例计算、分析化学。

  1. 为计算胚胎中的乙醇浓度，首先计算每个样本的稀释倍数。取本方案第2.3步中计算出的体积测量值，除以该体积测量值加上500 μL。此值代表在胚胎处理过程中（步骤5.3和5.4）加入每个样本的5 M NaCl/蛋白酶混合液的体积。

样品稀释倍数计算公式；胚胎体积计算；教学用方程式示意图。

  1. 根据此样品稀释倍数，乘以每个样品的乙醇测定值，结果将以 mM 浓度表示。对于培养基参考样品，将培养基乙醇值乘以 10 的稀释倍数进行计算。

胚胎乙醇浓度计算公式（胚胎乙醇浓度 = 样品乙醇值 × 样品稀释倍数）

中位浓度计算公式：中位浓度 = 乙醇中位值 × 10；公式图表。

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结果

由于早期胚胎斑马鱼缺乏完全形成的循环系统，因此无法测定其血液乙醇水平。为了确定斑马鱼胚胎中的乙醇浓度，需直接从匀浆化的胚胎组织中测量乙醇含量。为了准确测定胚胎内的乙醇浓度，必须考虑胚胎体积。胚胎（连同卵黄）位于绒毛膜（卵壳）内，并被胚外液所包围（图1）。对胚胎体积的测量必须在暴露处理时进行，因为随着发育时间的推移和胚胎体积的增大，其体积会发生变化。此外，还需考虑胚胎的处理方式以及胚胎体积，因为这两个因素均会引入稀释效应，进而用于计算胚胎内的乙醇水平。

由于胚胎并非完美的球体，尤其是在10 hpf之后，因此采用排水法测定胚胎体积。本研究使用了24 hpf的胚胎，分别测量了带有卵膜的胚胎以及从卵膜中取出的胚胎的体积。带有胚外液的胚胎体积为1.97（± 0.4 SD）μL，而仅胚胎本身的体积为1.1（± 0.22 SD）μL（表1）。这两者之间的差值即为包围在卵膜内胚胎周围的胚外液的体积（图1）。这一差值对于确定样品中仅胚胎部分的乙醇浓...

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讨论

作为发育生物学的模式系统，斑马鱼非常适合研究环境因素对发育的影响。它们可产生大量体外受精的胚胎，便于在乙醇研究中精确控制处理时间和剂量。结合活体成像能力以及与人类在遗传和发育上的保守性，斑马鱼成为畸形学研究中一种强大的模式系统。本文介绍了一种利用顶空气相色谱法测定发育中斑马鱼胚胎内乙醇浓度的实验方案。

确定胚胎中的乙醇浓度对于理解乙醇对发育中胚胎的影响至关重要。在啮齿类动物模型中，血液乙醇浓度与组织浓度相关26。然而，在斑马鱼的早期胚胎发育阶段，无法评估其血液中的乙醇水平。顶空气相色谱法已被用于测量多种实验范式中的乙醇浓度，包括斑马鱼模型25,30,31,32,33,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所（NIH/NIDCR）先前资助项目 R01DE020884（J.K.E. 负责）、美国国立卫生研究院/国家酒精滥用与酒精中毒研究所（NIH/NIAAA）先前资助项目 F32AA021320（C.B.L. 负责），以及美国国立卫生研究院/国家酒精滥用研究所（NIH/NIAAA）当前资助项目 R00AA023560（C.B.L. 负责）支持。我们感谢 Rueben Gonzales 提供并协助进行气相色谱分析。我们感谢 Tiahna Ontiveros 和 Gina Nobles 博士在撰写方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
空气由合同提供给大学
分析天平VWR10204-962
自动进样器 CP-8400Varian气相色谱自动进样器
氯化钙VWR97062-590
乙醇Decon Labs2701
带聚四氟乙烯/硅胶隔垫和塑料盖的2 mL气相色谱小瓶Agilent8010-0198清洗后可重复使用小瓶，但盖子/隔垫不可重复使用
气相色谱仪 CP-3800Varian
氦气由合同提供给大学
HP Innowax 毛细管柱Agilent19095N-123I30 m x 0.53 mm x 1.0 μm 膜厚
氢气由合同提供给大学
硫酸镁（七水合物）Fisher ScientificM63-500
1.5 mL 微量离心管Fisher Scientific2682002
10 μL 微量移液器吸头Fisher Scientific13611106
1000 μL 微量移液器吸头Fisher Scientific13611127
200 μL 微量移液器吸头Fisher Scientific13611112
100 mm 培养皿Fisher ScientificFB012924
Pipetman L p1000L 微量移液器GilsonFA10006M
Pipetman L p200L 微量移液器GilsonFA10005M
Pipetman L p2L 微量移液器GilsonFA10001M
聚四氟乙烯/硅胶隔垫和塑料盖Agilent5190-7021气相色谱小瓶的替换盖/隔垫
氯化钾Fisher ScientificP217-500
磷酸钾（二碱式）VWRBDH9266-500G
蛋白酶VWR97062-916
0.5 mm 二氧化硅珠Biospec Products11079105z
1.0 mm 二氧化硅珠Biospec Products11079110z
碳酸氢钠VWRBDH9280-500G
氯化钠Fisher ScientificS271-500
磷酸钠（二碱式）Fisher ScientificS374-500
固相微萃取纤维组件 Carboxen/PolydimethylsiloxaneMillipore Sigma57343-U替换用纤维
Star 色谱工作站Varian色谱软件
Thermogreen 低流失（LB-2）隔垫Millipore Sigma23154替换进样口隔垫

参考文献

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