活体功能性小鼠耳蜗毛细胞中葡聚糖的标记与摄取

摘要

本文介绍了一种利用功能性的机械转导通道，对3 kDa Texas Red标记的葡聚糖在听觉毛细胞中摄取过程进行可视化的方法。此外，还可使用3–10 kDa的葡聚糖来研究耳蜗柯蒂氏器中毛细胞和支持细胞的内吞作用。

摘要

毛细胞机械转导（MET）通道在听觉过程中起着重要作用。然而，MET通道的分子身份和结构信息至今尚不明确。对毛细胞的电生理学研究表明，MET通道具有较大的电导性，并可允许相对较大的荧光阳离子分子通过，包括一些苯乙烯类染料以及德克萨斯红标记的氨基糖苷类抗生素。在本实验方案中，我们描述了一种方法，用于可视化并评估柯蒂氏器离体外植体中毛细胞对荧光葡聚糖的摄取，从而检测功能性MET通道的存在。我们发现，在孵育1–2小时后，3 kDa德克萨斯红标记的葡聚糖能够特异性地标记功能性听觉毛细胞。特别是当存在功能性MET通道时，3 kDa葡聚糖会标记出较短的两排静纤毛，并在细胞体内以弥散模式聚集。此外，在毛细胞及其周围支持细胞的细胞体内还观察到一种额外的囊泡样标记模式。我们的数据表明，3 kDa德克萨斯红葡聚糖可用于可视化和研究细胞摄取染料的两条途径：一是通过功能性MET通道进入毛细胞的特异性途径，以及内吞作用途径，后者也可被更大分子量的葡聚糖利用。

引言

内耳中的毛细胞是感知声音的感觉细胞，能够将机械刺激转化为电信号，最终由大脑进行解读。这些细胞具有由三排肌动蛋白纤维组成的阶梯状束结构，称为静纤毛，从细胞的顶端区域突出^1,2。机械刺激会使静纤毛束朝最长的一排偏转，从而触发机械转导（MET）通道的开放³。MET通道的开放导致阳离子内流，使细胞去极化，进而促使毛细胞基底部突触囊泡的释放。

听觉所必需的机械电转导（MET）通道的生物物理特性已被广泛研究。除其他特性外，这些通道具有阳离子选择性，并具有相对较大的电导（在低Ca²⁺条件下为150–300 pS）^{4,5,6,7,8,9,10}。值得注意的是，诸如FM1-43和Texas Red标记的氨基糖苷类等大分子荧光物质能够穿透并阻断MET通道，从而在毛细胞胞体内积累，可通过荧光显微镜观察到^11,12,13,14。然而，MET通道的分子身份、结构及其通透路径至今仍不明确。越来越多的实验证据表明，跨膜样通道蛋白1（TMC1）是成熟毛细胞中MET通道的一个组分^{15,16,17,18,19}。跨膜样通道蛋白1（TMC1）的突变会改变MET通道的特性^19,20,21,22，并导致耳聋。此外，TMC1定位于MET通道所在位置^18,23，并与负责将机械力传递至MET通道的纤毛尖端连接（tip-link）相互作用^24,25。进一步地，近期的生物信息学分析发现TMC蛋白在进化上与机械敏感性通道TMEM63/OSCA蛋白以及TMEM16蛋白相关，后者是一类钙激活氯离子通道和脂质翻转酶家族^26,27,28。基于这些蛋白之间的关系所建立的TMC1结构模型揭示了蛋白-脂质界面存在一个较大的空腔²⁷。该空腔包含了两个导致常染色体显性遗传性听力损失（DFNA36）的TMC1突变位点^{27,29,30,31,32}，且对该空腔内半胱氨酸突变残基进行选择性修饰会改变MET通道的特性²⁸，提示该空腔可能作为MET通道的通透路径。TMC蛋白中预测存在的这一大尺寸空腔，可以解释大分子物质穿透MET通道的能力。为了验证MET通道含有异常大通透路径的假设，并进一步探索TMC1中观察到的空腔尺寸的极限，我们开发了一种在耳蜗柯蒂氏器离体组织中使用更大分子（3 kDa Texas Red荧光标记的葡聚糖）进行摄取实验的方案。

葡聚糖是一种由多个D-葡萄糖分子通过α-1,6糖苷键连接而成的复杂支链多糖。由于其在水中具有高溶解性、低细胞毒性和生物惰性，因此成为研究多种细胞过程的多功能工具。此外，葡聚糖有多种分子量规格可供选择，并可用多种颜色的荧光染料进行荧光标记。荧光标记的葡聚糖常用于细胞和组织通透性研究^33,34，以研究多种细胞系统中的内吞作用^35,36，以及用于神经示踪^37,38。在听觉研究领域，葡聚糖分子还被用于评估暴露于强噪声后，栗鼠耳蜗柯蒂氏器中细胞间连接的破坏以及听觉感觉上皮完整性的丧失^39,40。

在本研究中，我们利用了部分最小分子量（3 和 10 kDa）的荧光葡聚糖，对小鼠内耳毛细胞进行摄取实验，以探究内耳毛细胞机械电转导（MET）通道渗透路径的尺寸。此外，我们使用配备 Airyscan 检测器的激光扫描共聚焦显微镜（LSM）880，对荧光葡聚糖在听觉毛细胞静纤毛及胞体中的分布进行可视化和定位观察。

方案

动物护理和实验操作均遵循《实验动物护理和使用指南》的规定，该指南已获得美国国家神经疾病和卒中研究所动物护理和使用委员会的批准（动物实验方案编号 #1336，负责人 KJS）。

1. 小鼠

1. 在动物实验室内设置若干对C57BL/6J野生型小鼠进行交配繁殖，以控制仔鼠的出生日期并记录其年龄。

2. 耳蜗解剖

1. 在体视显微镜附近设置一个洁净的操作区域用于解剖（图1A）。使用70%乙醇清洁操作台面及周围环境，并铺上洁净的实验台垫。需准备一个医用病理废弃物（MPW）塑料袋，用于丢弃动物尸体。
2. 准备数个含有Leibovitz's L15培养基的35 mm培养皿。
   注：Leibovitz's L-15细胞培养基含有1–2 mM Ca²⁺，这对于维持纤毛尖端连接的完整性至关重要，同时含有必需氨基酸、维生素和丙酮酸钠，有助于改善细胞健康和存活率。未添加血清，以避免因血清成分不明确及其可能对葡聚糖产生干扰而引起的实验变异性。
3. 通过断头法处死出生后第6天（P6）的小鼠。
   注：6日龄小鼠对吸入性麻醉剂具有一定耐受性。尽管可使用异氟烷或长时间CO₂暴露（长达50分钟）进行安乐死，但仍建议采用二次物理方法以确保动物死亡。
4. 使用手术剪在颅骨表面从前端至后端以及外耳道处做浅层切口，以去除颅骨皮肤。
5. 将皮肤向鼻部方向折叠，暴露颅骨（图2B）。
6. 从颅骨后部向前部做切口，并横跨眼部连线（图2B-C）。
7. 将颅骨分为两半，并使用小刮勺移除脑组织，以暴露颞骨（图2C-D）。
8. 使用小型剪刀围绕颞骨进行剪切，并切除周围组织。
9. 将两个颞骨放入一个35 mm培养皿中，并确保其完全浸没于L15培养基中（图2E）。
   注：以下步骤均在体视显微镜下进行。通常使用黑色背景有助于在精细解剖过程中更清晰地观察组织。
10. 在配备广视野目镜（10倍放大倍率（WF10X））和外部交流（AC）卤素光源的体视显微镜下，使用手术镊子去除耳蜗周围的组织、半规管以及前庭器官（图2F）。
11. 为使葡聚糖和L15培养基进入耳蜗导管，需在解剖后的耳蜗上进行两处穿刺，一处位于圆窗，另一处位于耳蜗顶端区域。
12. 向9孔玻璃凹孔板的每个孔中加入300 µL Leibovitz's L15培养基。
13. 在每个孔中放置至少三个已解剖的耳蜗。

3. 葡聚糖标记

1. 用不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的汉克斯平衡盐溶液（HBSS-CFM）重悬葡聚糖，终浓度为 10 mg/mL。该储备液需分装至不透光的黑色管中（避光保存），并于 -30 °C 保存至使用前。
   注意：使用可被赖氨酸固定的葡聚糖对本实验方案的成功至关重要。
2. 将每种葡聚糖以终浓度 2 mg/mL 溶于 500 mL 的 Leibovitz L15 培养基中，配制工作液。
3. 移除耳蜗中的原有培养基，加入含有目标葡聚糖的 Leibovitz L15 培养基，葡聚糖终浓度为 2 mg/mL。
   注意：尽管在静息状态下已有部分机械电转导（MET）通道处于开放状态^41,42，但仍需对耳蜗组织进行轻微振荡培养，以提高 MET 通道的开放概率。
4. 在室温下使用三维摇床以 25° 倾斜角、25 rpm 的速度轻柔振荡孵育 2 小时。
   注意：应尽可能避免荧光标记的葡聚糖暴露于光照下。为在 2 小时孵育期间保护葡聚糖，可将 9 孔玻璃培养板置于用铝箔包裹的细胞培养 P150 培养皿中。

4. 成像样品制备

1. 用葡聚糖孵育后，用培养基洗涤组织两次，每次2分钟，再用HBSS洗涤一次。
2. 在Hanks平衡盐溶液（HBSS）中加入4%多聚甲醛，在室温下孵育组织30分钟。
   注意：甲醛暴露可能刺激眼睛、鼻子和上呼吸道。对某些个体而言，反复皮肤接触甲醛可引起致敏反应，导致过敏性皮炎。甲醛是已知的人类致癌物，并可能具有生殖毒性。
3. 用HBSS快速而轻柔地洗涤固定后的组织两次，以去除多聚甲醛。
   注意：在此耳蜗发育阶段，无需对颞骨进行脱钙处理。
4. 使用尖头镊子去除螺旋韧带和盖膜，以分离柯蒂器官（图2G）。
5. 清除所有细小组织碎片，并用HBSS洗涤组织。
6. 将组织在含荧光标记鬼笔环肽（测试TR或FITC标记葡聚糖摄取时分别使用红色或绿色荧光标记）的PBS中加入0.5% Triton X-100，按1:200稀释，孵育30分钟，以标记F-肌动蛋白并可视化基于肌动蛋白的静纤毛。
7. 用HBSS缓冲液洗涤组织2–3次，每次2分钟，以去除多余的Triton和鬼笔环肽，再用PBS洗涤一次以去除盐分。
8. 将柯蒂器官组织置于载玻片上，并加入封片剂覆盖。
   注意：封片时，确保组织中包含毛细胞静纤毛的一侧朝向盖玻片。
9. 在添加封片剂过程中去除可能产生的气泡，并在放置盖玻片时防止新气泡产生。
   注意：使用移液器吸除添加封片剂时产生的气泡。为防止盖玻片下 trapped 空气气泡，应将盖玻片的一边靠近样品，然后使用镊子或移液器吸头小心缓慢地将盖玻片放下覆盖在组织上。
10. 用玻璃盖玻片覆盖封片剂中的组织（图2H）。
    注意：数值孔径高于0.4的物镜设计用于#1.5盖玻片（厚度0.17 mm）。使用错误的盖玻片可能严重影响图像的强度和质量。
11. 将封片后的组织在室温下孵育过夜，使封片剂干燥，并将载玻片储存于4 °C直至成像。

5. 图像采集与图像处理

注意：共聚焦图像采用配备32通道Airyscan探测器的LSM 880共聚焦显微镜在超分辨率（SR）模式下获取⁴³，物镜为63倍。

1. 在物镜上滴加一小滴浸油。
2. 将载有组织样本的显微镜玻片放置于显微镜载物台上，使盖玻片朝向浸油。
3. 对样本进行聚焦，并使用图像采集软件设置成像参数。
4. 每次独立实验均需使用相同的图像采集设置以及针对 x、y 和 z 分辨率的最优参数。采集 z 轴层扫图像时，需使用压电驱动的聚焦系统，以快速且精确地移动物镜。
   注意：为完整成像毛细胞的顶端区域，应使用最优设置从静纤毛采集至毛细胞体顶端一半位置的 z 轴层扫图像。沿毛细胞采集较大范围的 z 轴层扫图像至关重要，以确保能够成像囊泡样颗粒。
5. 使用图像采集软件，通过 Airyscan 3D 重建算法及默认的自动去卷积滤波设置，对原始共聚焦图像进行处理。
6. 在图像处理软件中打开共聚焦图像，调整亮度和对比度，添加比例尺，并导出图像用于最终成图。

结果

将野生型出生后第6天（P6）小鼠的耳蜗器官外植体与Texas Red荧光标记的3 kDa右旋糖酐（dextran-TR）共孵育2小时后，我们观察到毛细胞具有强烈且特异性的标记信号（图2A-B）。在耳蜗器官的基底、中段和顶端区域，内毛细胞和外毛细胞（IHC和OHC）均可见右旋糖酐标记信号（图2B）。

使用荧光标记的鬼笔环肽对纤维状肌动蛋白（F-actin）进行复染，以观察基于肌动蛋白的毛细胞静纤毛结构。我们还在较短的孵育时间内进行了类似的实验，尽管观察到四葡聚糖-TR在毛细胞胞体中的聚集，但其信号强度较弱且变异较大，不如2小时孵育时的信号稳定（图2C）。

接下来，我们对毛细胞的静纤毛和细胞体进行了成像观察，发现只有那些在细胞体内掺入了3 kDa葡聚糖-...

讨论

本方案描述了如何在小鼠耳蜗柯蒂氏器离体组织中使用3 kDa德克萨斯红标记的葡聚糖进行摄取实验。该方法的目的是检测比先前测试分子更大的分子是否也能特异性地标记听觉毛细胞，并通过机械电转导（MET）通道进入细胞。类似的实验方案此前已被用于评估毛细胞对其他荧光染料的通透性，例如FM1-43（0.56 kDa）^12,19,20 和德克萨斯红标记的氨基糖苷类抗生素（1.29–1.43 kDa）^13,52。使用这些荧光分子标记毛细胞所需的时间随其分子大小而变化。FM1-43达到最大标记需数分钟^13,53，德克萨斯红标记的氨基糖苷类抗生素需要30–60分钟¹³，而德克萨斯红标记的3 kD...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#1.5 玻璃盖玻片 18 mm	Warner Instruments	64-0714
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	ThermoFisher	A12379
Alexa Fluor 594 鬼笔环肽	ThermoFisher	A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 油镜校正 M27 物镜	Carl Zeiss	420780-9970-000
盐酸阿米洛利	EMD MILLIPORE	129876
Benchwaver 三维摇床	Benchmarks scientific	B3D5000
C57BL/6J 野生型小鼠	品系 000664	杰克逊实验室
细胞非通透性 BAPTA 四钾盐	ThermoFisher	B1204
葡聚糖，荧光素，10,000 MW，阴离子，赖氨酸可固定	ThermoFisher	D1820
葡聚糖，德克萨斯红，10,000 MW，赖氨酸可固定	ThermoFisher	D1863
葡聚糖，德克萨斯红，3000 MW，赖氨酸可固定	ThermoFisher	D3328
甲醛水溶液 EM 级	Electron microscopy science	15710
HBSS，含钙，含镁，无酚红	ThermoFisher	14025
HBSS，无钙，无镁，无酚红	ThermoFisher	14170
Image J 或 FIJI	NIH	http://fiji.sc/
Immersol 518F 浸油介质	Carl Zeiss	444970-9000-000
Leibovitz's L-15 培养基，含 GlutaMAX 补充剂	ThermoFisher	31415029
新霉素三硫酸盐水合物	Sigma	N6386
PBS (10X)，pH 7.4	ThermoFisher	70011069
鬼笔环肽-CF405M	Biotium	00034
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher	P36970
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisherbrand	22-037-246
吐温 X-100	Sigma	T8787
Zen Black 2.3 SP1 软件	Carl Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html