OaAEP1介导的聚合蛋白酶法合成及其在单分子力谱学中的固定

摘要

本文介绍了一种利用酶促反应将蛋白质单体连接成具有可控序列的蛋白质聚合物，并将其固定在表面用于单分子力谱研究的实验方案。

摘要

近年来，化学和生物偶联技术发展迅速，使得蛋白质聚合物的构建成为可能。然而，实现可控的蛋白质聚合过程始终是一项挑战。本文中，我们开发了一种酶促方法，可按照合理设计的序列逐步构建聚合蛋白质。该方法利用OaAEP1（Oldenlandia affinis 天冬酰胺酰内肽酶）将蛋白质单体的C末端修饰为NGL，用于蛋白质偶联1）；同时，其N末端包含一个可切割的TEV（烟草蚀纹病毒）切割位点及一个L残基（ENLYFQ/GL），作为临时的N端保护基团。因此，OaAEP1每次仅能添加一个蛋白质单体，随后TEV蛋白酶在Q与G之间切割N末端，暴露出NH₂-Gly-Leu，使该单元具备进行下一轮OaAEP1连接反应的条件。通过基于原子力显微镜的单分子力谱技术（AFM-SMFS）对所构建的多聚蛋白进行逐个蛋白结构域的解折叠检测。因此，本研究为多聚蛋白的工程化设计与固定化提供了一种有效的策略。

引言

与合成聚合物相比，天然多结构域蛋白质具有均一的结构，其亚结构域的数量和类型均得到良好控制¹。这一特性通常可带来更优的生物学功能和稳定性^2,3。目前已发展出多种方法用于构建具有多个结构域的聚合蛋白质，例如基于半胱氨酸的二硫键偶联法和重组DNA技术^4,5,6,7。然而，前一种方法往往导致序列随机且不可控，而后一种方法则会引发其他问题，包括毒性蛋白和大分子量蛋白的过表达困难，以及含有辅因子和其他敏感酶的复杂蛋白的纯化难题。

为应对这一挑战，我们开发了一种酶促方法，利用蛋白连接酶 OaAEP1 与蛋白酶 TEV^8,9 相结合，以逐步方式将蛋白质单体共价连接，从而合成聚合物/多聚蛋白。OaAEP1 是一种严格且高效的内肽酶。若一个蛋白质的 N 末端为甘氨酸-亮氨酸残基（GL），另一个蛋白质的 C 末端为天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸序列（NGL），则 OaAE....

方案

1. 蛋白质生产

1. 基因克隆
   1. 购买编码目标蛋白（POI）的基因：泛素（Ubiquitin）、铁氧还蛋白（Rubredoxin, RD）⁵¹、纤维素结合模块（CBM）、X型dockerin结构域（XDoc）以及来自Ruminococcus flavefacience的cohesion结构域、烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶、弹性蛋白样多肽（ELPs）。
   2. 进行聚合酶链式反应，并使用三酶切系统BamHI-BglII-KpnI将不同蛋白片段的基因进行重组。
   3. 通过直接DNA测序确认所有基因序列的正确性。
2. 蛋白表达与制备
   1. 将pQE80L-POI或pET28a-POI质粒转化至E. coli BL21(DE3)菌株中以进行蛋白表达。
   2. 挑取单菌落接种于15 mL LB培养基（含相应抗生素，例如100 μg/mL氨苄青霉素钠盐或50 μg/mL卡那霉素）中，37 °C、200 rpm振荡培养16–20小时。
   3. 将过夜培养物按1:50比例稀释至800 mL LB培养基中。对于铁氧还蛋白的表达，需将菌液在1,800 × g条件下离心，然....

结果

通过OaAEP1连接在相邻蛋白之间引入的NGL残基不会影响聚合物中蛋白单体的稳定性，因为其解折叠力（u>）和轮廓长度增量（<ΔL_c>）与先前研究结果相当（图1）。红氧还蛋白的纯化结果如图2所示。为证明经TEV蛋白酶切割后的蛋白可兼容后续OaAEP1连接反应，从而高效构建具有可控序列的蛋白聚合物，图3提供了SDS-PAGE图像作为参考。功能化悬臂梁和盖玻片制备的步骤见图4。多蛋白在盖玻片上的逐步酶促生物合成及固定过程如图5所示。采用本方案，可构建具有可控序列的蛋白聚合物，并适用于基于原子力显微镜的单分子力谱（AFM-based SMFS）实验。

讨论

我们描述了一种用于多聚蛋白的酶法生物合成及其固定化的实验方案，并通过基于原子力显微镜的单分子力谱技术验证了多聚蛋白的设计。该方法为按预定序列构建蛋白-聚合物提供了新途径，是对以往多聚蛋白工程与固定化方法的补充^{4,6,52,53,54,55,56,57,58,59,60,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
六水合三氯化铁	Energy Chemical		99%
氯化锌	Alfa Aesar		100.00%
水合氯化钙	Alfa Aesar		99.9965% 结晶态聚集体
L-抗坏血酸	Sigma Life Science		Bio Xtra，≥99.0%，结晶态
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷	Sigma-Aldrich		≥99%
磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯	Thermo Scientific		90%
甘油	Macklin		99%
5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)	Alfa Aesar
基因	Genscript
仪器设备
Nanowizard 4 原子力显微镜	JPK Germany
MLCT 悬臂梁	Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL	GE Healthcare
AKTA FPLC 系统	GE Healthcare
玻璃盖玻片	Sail Brand
Nanodrop 2000	Thermo Scientific
Avanti JXN-30 离心机	Beckman Coulter
凝胶成像系统	Tanon