本方案提供了一种稳健且可重复的带血管复合组织异体移植（VCA）模型，旨在同时研究免疫反应与功能恢复。通过在右侧大腿中段进行后肢原位移植，并手工缝合血管吻合口及神经对接，尽管技术操作耗时较长，但能够实现对功能恢复的深入研究。
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本文内容
摘要
摘要
尤其是肢体移植，以及广义上的血管化复合组织异体移植（VCA），具有广阔的治疗前景，但目前在免疫抑制和神经运动功能恢复方面的局限性限制了其发展。尽管已开发出多种动物模型用于研究VCA的独特特征，但本文介绍了一种稳定且可重复的大鼠原位后肢移植模型，旨在同时探讨当前VCA面临的两大挑战：免疫抑制策略与神经运动功能恢复。该模型的核心在于坚持采用经过长期验证的精细显微外科技术，包括手工缝合的血管吻合以及股神经和坐骨神经的手工缝合神经对接。该方法可实现持久的肢体重建，使动物术后存活时间更长，能够接受康复训练、恢复日常活动并进行功能评估。通过短期使用常规免疫抑制剂治疗，异基因移植动物术后存活可达70天，而同基因移植动物作为对照组，术后存活时间可超过200天。术后30天即可观察到神经功能恢复的证据。该模型不仅为深入探究VCA特有的免疫学问题及神经再生机制提供了有力平台，同时也支持针对VCA特异性设计的新治疗策略进行体内验证。
引言
在血管化复合组织异体移植（VCA）或复合组织异体移植（CTA）这一更广泛的范畴内，肢体移植尚未实现其治疗潜力。自1998年和1999年法国里昂及美国肯塔基州路易维尔成功完成首例人类手部移植以来，全球已在经过严格筛选的患者中实施了100多例上肢移植手术1。然而，由于需要强效免疫抑制以及神经运动功能恢复有限，该技术的广泛应用受到阻碍。目前的免疫抑制策略导致急性排斥反应发生率为85%，同时机会性感染的发生率高达77%2。另一方面，手部移植后的功能确实有所恢复；患者上肢功能障碍评分（DASH）平均从71分改善至43分，但此功能水平仍可能被认定为残疾2。鉴于肢体移植并不涉及挽救生命，当前技术必须通过动物模型进一步优化，以推动VCA领域迈向下一阶段。
自1978年首个大鼠肢体移植模型建立以来3，为推动血管化复合组织异体移植（VCA）领域的发展，已开发出多种创新的动物模型4，其中包括采用带套管的血管吻合技术以缩短手术时间5,6，异位骨肌皮移植以减少对受体动物的生理干扰7,
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方案
所有实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行，并已获得西北大学动物护理与使用委员会的批准。具体操作依据方案编号 IS00001663 执行。
注意：使用了两种大鼠品系，分别为Lewis大鼠和August Copenhagen x Irish（ACI）大鼠。动物被分为三组处理组：未进行免疫抑制的同种异体移植组（ACI至Lewis）、采用常规免疫抑制的同种异体移植组（ACI至Lewis）以及同系移植组（Lewis至Lewis或ACI至ACI）。Lewis为近交品系，而ACI大鼠代表远交野生型，因此选择该组合以模拟最严重的排斥反应情况。常规免疫抑制治疗通过皮下给药，方案为：雷帕霉素1 mg/kg，从术后第-1天（POD -1）至术后第28天（POD 28）；或他克莫司（FK506）3 mg/kg，从术后第0天（POD 0）至术后第14天（POD 14），之后每周一次。雄性和雌性大鼠均可作为受体，年龄为8至16周，在手术时体重介于250至400克之间。
1. 供体右后肢的采集
- 通过配备适当废气清除系统的蒸发器，使用5%异氟烷在纯氧中诱导全身麻醉。
- 通过夹捏足趾确认麻醉深度充分，然后使用毛发剪刀修剪右侧后肢及右侧腹股沟手术区域的毛发。
- 通过啮齿类动物鼻罩将异氟烷浓度下调至2–2.5%。
- 将大鼠仰卧位固定于带有加热垫的手术....
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结果
存活与恢复依赖于精细的手术技术。关注血管吻合、神经吻合以及上述的骨骼对接，对于最大限度提高该模型的成功率至关重要。手术设计及典型的吻合结果见图1。
总体死亡率取决于免疫抑制策略，大多数同系移植动物达到了术后100-200天的研究终点，如图2所示。一旦度过术后急性期，接受治疗的异系移植动物可存活长达术后58天。在研究期间，同基因移植大鼠长期存活，而接受异基因移植的大鼠则因使用雷帕霉素和FK506而出现不同程度的死亡率。在各治疗组中，FK506组存活时间最长（第57天），雷帕霉素组次之（第20天），未治疗对照组最短（第10天）。
感觉和运动功能的恢复情况如图3所示。使用Hargreaves装置检测发现，到第30天时，动物移植足部的感觉神经功能已恢复。术后四周，动物表现出显著的功能恢复（Aii）。通过步态分析跑台及集成软件分析平台，观察到移植肢体的运动功能.......
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讨论
肢体移植属于血管化复合组织异体移植（VCA）的范畴，具有广泛的应用治疗前景，但目前尚未实现。主要障碍在于VCA特有的尚未解决的免疫学问题以及当前使用的神经运动功能恢复技术。新技术的开发将依赖于灵活、可靠且可重复的动物模型。
在VCA领域已建立了多种动物模型，每种模型均有其特定优势4。非人灵长类动物模型对人类患者具有良好的可转化性，但受限于高昂的成本以及所需免疫抑制剂量达到毒性水平等问题4。犬类模型因其肌肉结构与人类具有特定相似性，且免疫系统更为成熟，被认为具有优势19,20。猪模型作为大型动物模型，其免疫系统研究日益深入，具有显著优势21,22。小鼠模型系统为免疫学研究提供了最先进的技术手段，但尽管套管式血管显微外科吻合技术已取得重要进展
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由弗兰克尔基金会和西北纪念医院麦考密克资助（Operation RESTORE）资助。本出版物所报告的研究由美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所通过奖项支持。 编号 T32GM008152。本研究得到西北大学显微外科核心实验室和行为表型核心实验室的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 麻醉机 | Vet Equip | 911103 | |
| 0.5 cc 注射器 | Exel | 26018 | |
| 18 号针头 | BD | 305196 | |
| 1 cc 注射器 | BD | 309659 | |
| 22 号针头 | BD | 305156 | |
| 24 号套管针 | Sur-Vet | SROX2419V | |
| 25 号针头 | Exel | 26403 | |
| 3 cc 注射器 | BD | 309657 | |
| 5 cc 注射器 | Exel | 26230 | |
| 酒精 | Fisher Scientific | HC-600-1GAL | |
| 麻醉诱导舱 | Vet Equip | 941443 | |
| 麻醉气体清除系统 | Vet Equip | 931401 | |
| 双极电凝器 | Aura | 26-500 | |
| 苦味喷雾剂 | Henry Schein | 5553 | |
| 骨蜡 | CP Medical | CPB31A | |
| 呼吸回路 | Vet Equip | 921413 | |
| 布托啡诺 | Reckitt Benckiser | 12496075705 | |
| Castro-Viejos 持针器 | Roboz | RS-6416 | |
| 无线电动锯 | Dremel | 8050-N/18 | |
| 棉签棒 | Fisher Scientific | 23-400-101 | 用于止血 |
| DigiGait 装置及软件 | Mouse Specifics | MSI-DIG, DIG-SOFT | |
| Dumont 镊子（#4） | Roboz | RS-4972 | |
| Dumont 镊子（#5） | Roboz | RS-5035 | |
| 恩诺沙星 | Norbrook | ANADA 200-495 | |
| FK-506 | Astellas | 301601 | |
| 纱布 | Kendall | 1903 | |
| 纱布 | Covidien | 8044 | |
| 手套 | Microflex | DGP-350-M | |
| 电动毛发剪 | Oster | 078005-010-003 | |
| 手持单极电凝器 | Bovie | AA00 | |
| Hargreaves 装置 | Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy | 37370 | |
| 加热垫 | Walgreens | 126987 | |
| 肝素 | Fresenius Kabi | 42592K | |
| 加热板 | Corning | PC-351 | 用于加温复苏液体 |
| 异氟烷 | Henry Schein | 29405 | |
| 乳酸林格氏液 | Baxter | 2B2074 | |
| 大型培养皿 | Fisher Scientific | FB0875713 | 用于冷盐水中保存供体移植物 |
| 美洛昔康 | Henry Schein | 49755 | |
| 微型 Collin Hartmann 拉钩 | |||
| 微型解剖剪 | Roboz | RS-5841 | |
| 微纤维胶原粉 | BD | 1010590 | 用于止血 |
| 微血管夹 | Roboz | RS-5420 | |
| 生理盐水 | Baxter | 2F7124 | |
| 眼科润滑剂 | Dechra | IS4398 | |
| 雷帕霉素 | MedChem Express | HY-10219 | |
| 小型培养皿 | Fisher Scientific | FB0875713A | 用于加温复苏液体 |
| 无菌手术巾 | ProAdvantage | N207100 | |
| 手术服 | Cardinal Health | 9511 | |
| 外科口罩 | 3M | 1805 | |
| 手术显微镜，光学型号 OPMIMD | Zeiss | 169756 | |
| 手术显微镜，Universal S3 | Zeiss | 243188 | |
| 10-0 尼龙缝线 | Covidien | N2512 | |
| 5-0 Vicryl 缝线 | Ethicon | J213H | |
| 7-0 丝线结扎线 | Teleflex | 103-S | |
| 胶带 | 3M | 1530-1 | |
| 超声波仪器清洗器 | Roboz | RS-9911 | |
| 血管扩张镊 | Roboz | RS-5047 |
参考文献
- Elliott, R. M., Tintle, S. M., Levin, L. S. Upper extremity transplantation: current concepts and challenges in an emerging field. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine. 7 (1), 83-88 (2014).
- Petruzzo, P., et al.
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重印与许可
