利用人源类器官心脏切片的双电压与钙光学标测进行临床前心脏电生理学评估

摘要

本方案描述了用于临床前药物测试的人类心脏切片的切片与培养步骤，并详细说明了如何利用光学标测技术同步记录这些切片中的跨膜电压和细胞内钙信号。

摘要

人的心脏组织切片制备技术最近被开发为一种研究人类生理学和药物测试的平台，旨在弥合动物实验与临床试验之间的差距。尽管已有多种动物模型和细胞模型被用于评估药物作用，但这些模型中的药物反应常常与人体内的反应存在差异。人的心脏组织切片在药物测试方面具有优势，因为它们直接来源于具有活性的人类心脏组织。除了保留了多细胞结构、细胞间连接以及细胞外基质环境外，人的心脏组织切片还可用于直接检测大量药物对成人人心脏生理功能的影响。与完整心脏或心肌楔形组织等其他心脏制备方法不同的是，组织切片可进行较长时间的培养。因此，心脏切片可用于研究药物的急性及慢性效应。此外，从单个心脏可获取数百至数千个切片，使其成为一种高通量模型，能够同时在不同浓度下以及与其他药物联用条件下测试多种药物。切片可从心脏的任意区域制备。在本实验方案中，我们描述了通过从左心室游离壁分离组织块，并使用高精度振动切片机将其切成薄片，从而制备左心室切片的方法。这些切片既可用于急性实验以测量心脏基础电生理功能，也可进行培养以开展慢性药物研究。本方案还介绍了对心脏切片进行双通道光学标测，以同步记录跨膜电位和细胞内钙离子动态变化，从而确定所研究药物的作用效果。

引言

动物模型一直是研究人类生理学和病理生理学机制的重要工具，同时也被用作治疗多种疾病疗法的初步测试平台¹。基于这些动物研究，生物医学领域已取得显著进展²。然而，人类与动物（包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、绵羊、猪和狗）在生理学上存在显著的种间差异^3,4。因此，许多在动物实验阶段显示前景的药物、基因和细胞疗法在临床试验中未能达到预期效果⁵。为弥合这一差距，研究人员开发了分离的心肌细胞和人诱导性多能干细胞（iPSCs）作为模型，用于测试人类生理系统对各种药物和疾病反应的能力⁶。干细胞来源的心肌细胞已被广泛应用于器官芯片系统中，作为心脏的替代模型^6,7,8。然而，iPSC来源的心肌细胞（iPSC-CMs）的应用受到其相对不成熟的表型以及心肌细胞亚群代表性不足的限制；成熟的心肌组织是一种复杂的结构，包含多种共存的细胞类型，如成纤维细胞、神经元、巨噬细胞和内皮细胞。相比之下，分离的人心肌细胞具有电生理成熟性，并且可通过调节培养参数获得不同的心肌细胞亚群

方案

所述所有方法均符合所有机构、国家和国际关于人类福祉的指南。研究已获得乔治·华盛顿大学机构审查委员会（IRB）的批准。

注意：供体人心脏由华盛顿地区移植社区提供，为经乔治华盛顿大学机构审查委员会批准的匿名废弃组织。切除的心脏通过灌注冰冻心脏停跳液使心脏停搏（此过程中血液已被清除），并在标准器官移植条件下转运至实验室。

1. 溶液的配制

1. 每个心脏制备 4 L 心肌停搏液（110 mM NaCl、16 mM KCl、16 mM MgCl₂、10 mM NaHCO₃、1.2 mM CaCl₂；pH = 7.4）。将 3 L 储存于 4 °C，剩余 1 L 储存于 -20 °C。
   注意：该溶液可提前数天配制。
2. 新鲜配制各 1 L 的台氏切片液（140 mM NaCl、6 mM KCl、1 mM MgCl₂、1.8 mM CaCl₂、10 mM 葡萄糖、10 mM HEPES、10 mM 2,3-丁二酮单肟 [BDM]；pH = 7.4）和台氏恢复液（140 mM NaCl、4.5 mM KCl、1 mM MgCl₂、1.8 mM CaCl₂、10 mM 葡萄糖、10 mM HEPES、10 mM BDM；pH = 7.4）....

结果

根据上述详细方案并如图1所示，从供体人心脏的左心室获取了人源类器官心脏切片。采用如图2所示的双相机光学映射系统，在直立成像构型下，于切片制备完成后约1小时对电压和钙信号进行同步光学映射。数据使用RHYTHM1.2（图3）进行分析，该工具为本实验室先前发表的开源光学映射数据分析软件，可在Github上免费获取（https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2）。所测量的电生理参数如图4所示。动作电位和钙瞬变曲线经过信号处理，用于进一步分析的代表性曲线如图4A所示。确定每个像素的激活时间，并根据电压和钙信号计算激活等时图，结果如图4B、C所示。请注意，钙等时线的激活时间滞后于电压，符合预期。如

讨论

本文介绍了从停搏的人类心脏获取可存活心肌片，并利用跨膜电位和细胞内钙离子的双光学标测技术对心肌片进行功能表征的逐步实验方法。由于心肌片保留了细胞外环境及天然的细胞间耦合，因此可作为研究人类心脏的精确模型，用于基础科学发现，以及药物和基因治疗手段的有效性与心脏毒性检测。该技术还可实现对心脏特定区域（如窦房结、房室结和浦肯野纤维）的结构-功能关联分析。本文所述方案列出了适用于短期研究的心肌片制备、成像及分析的基本步骤。已有研究表明，组织片的静态培养在较长时间内会引起心肌组织的改变，因此对于长期研究，建议读者采用更接近生理状态的培养条件，例如电-机械刺激^12,13,14。

为保持组织健康，需注意多个步骤。例如，应尽量缩短心脏获取与组织切片之间的时间间隔。如先前研究所示²¹，长时间的停搏可导致电生理特性的改变。此外，在切片收集、培养及功能研究过程中，应避免过.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL BD 注射器	Thomas Scientific	309597
2,3-丁二酮单肟	Sigma-Aldrich	B0753
6 孔培养板	Corning	3516
生物安全柜	ThermoFisher Scientific	1377
肌球蛋白抑制剂 Blebbistatin	Cayman	13186
气泡捕集器	Radnoti	130149
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016
Corning 细胞筛	Fisher Scientific	07-201-432
Di-4-ANEPPS	Biotium		DMSO 中 1.25 mg/mL 储存液
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Dumont #3c 镊子	Fine Science Tools	11231-20
发射二向色镜	Chroma	T630LPXR-UF1
发射滤光片 (RH237)	Chroma	ET690/50m
发射滤光片 (Rhod2AM)	Chroma	ET590/33m
激发二向色镜	Chroma	T550LPXR-UF1
激发滤光片	Chroma	ET500/40x
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-49A
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
热交换器	Radnoti	158821
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
培养箱	ThermoFisher Scientific	50145502
胰岛素-转铁蛋白-硒 (ITS)	Sigma-Aldrich	I3146
LED 激发光源	Prizmatix	UHP-Mic-LED-520
六水合氯化镁	Sigma-Aldrich	M9272
Medium 199	ThermoFisher Scientific	11150059
Micam Ultima L 型 CMOS 相机	Scimedia	N/A
显微钉针	Fine Science Tools	26002-10
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4333
蠕动泵	Cole Parmer	EW-07522-20
铂金起搏导线	Alfa Aesar	43275
Pluronic F127	ThermoFisher Scientific	P6867	非离子型表面活性聚醇
氯化钾	Sigma-Aldrich	P3911
Powerlab 数据采集与刺激系统	AD Instruments	Powerlab 4/26
RH237	Biotium	61018
Rhod2AM	ThermoFisher Scientific	R1245MP
Rhod-2AM	Invitrogen, Carlsbad, CA
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6014
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9625
干珠灭菌器	Sigma-Aldrich	Z378550
Stone 氧气扩散器	Waterwood	B00O0NUVM0
TissueSeal - Histoacryl 外用皮肤粘合剂	gobiomed	AESCULAP
UltraPure 低熔点琼脂糖	Thermo Fisher Scientific	16520100
超声波超声仪		Branson 1800
振动切片机	Campden Instruments	7000 smz