使用形态基因的农业细菌 -顽固玉米近亲繁殖系的介导未成熟胚胎转化

转化是评估玉米中外来基因表达和生产转基因玉米系的基本工具，用于研究和商业目的。获得高通量转化可以促进对玉米分子和细胞生物学研究日益增长的需求^1。转基因作物物种的能力对公共和私营实验室都至关重要。这允许对基因调控机制的基本理解，以及在全球范围内提高作物，以支持不断增长的人口。

1975^年，玉米中未成熟的胚胎可用于生产可再生产的可产的可基因的卡鲁斯。自这一启示以来，大多数可扩展的玉米转化协议都要求在再生³之前形成和选择。在基因转化过程中，在培养培养胚胎诱导的培养基体感染或生物细菌轰击的未成熟胚胎。然后，在选择性介质上培养诱导的卡利（例如，含有除草剂），以便只有经过转化的卡片才能存活。这些抗除草剂的假定转基因卡利被膨胀并再生成植物。虽然这种方法是有效的，但过程漫长而耗费大量人力，完成⁴个工序可能需要3个月以上。更重要的是，传统的玉米转化协议具有更大的局限性，即只有有限数量的玉米基因型可以转化^5，6。

Lowe等人^7、8此前曾报道过一种"快速玉米"转化方法，它不仅大大缩短了转化过程的持续时间，而且扩大了可转化基因型的清单。QuickCorn方法利用阿拉伯拉多普西转录因子BABY BOOM（BBM）9和WUSCHEL（WUS）10的玉米正交法（Zm-Bbm和Zm-Wus2）。当纳入转化载体系统时，这些基因协同作用，刺激胚胎生长^7。

这项工作中描述的QuickCorn协议基于Jones等人¹¹中的协议，这是洛伊等人^7、8报告的方法的进一步改进。在本研究中，一个农业细菌菌株LBA4404（Thy-）含有二进制向量结构PHP81430（图1）和附属质粒PHP71539¹²用于转换。PHP81430的T-DNA包含以下分子成分。（1）转化选择性标记基因Hra表达盒。玉米赫拉（Zm-Hra）基因是一种经过修饰的乙酰胺酶合成酶（ALS）基因，能耐受ALS抑制除草剂，如磺胺类和伊米达佐利诺^13、14。Zm-Hra基因由高梁ALS启动子⁸和马铃薯蛋白酶抑制剂II（引脚II）终止剂¹⁵调节。T-DNA还含有（2）一个表达盒，具有转化可筛选的标记基因ZsGreen。这种绿色荧光蛋白基因ZsGreen来自Zoanthus sp.珊瑚礁^珊瑚16是由高梁泛素促进剂/intron和大米泛素终止剂调节的。

此外，T-DNA包含（3）形态基因Bbm表达盒。Bbm是与胚胎发育有关的转录因子^9，17。Bbm由玉米磷脂转移酶蛋白（Pltp）促进剂⁸和水稻T28终止剂¹⁸调节。Zm-Pltp是一种在胚胎上皮、丝毛和叶附属细胞（保护细胞）中具有强烈表达力的基因，在生殖器官中表达低，在根部⁸中没有表达。它还含有（4）形态基因Wus2表达盒。Wus2是另一个转录因子与维持的正锥^形19。Zm-Wus2受玉米辅助诱导剂（Zm-Axig1）20和玉米In2-1终止器²¹的控制。最后， T-DNA 包含 （5）克 -loxP重组系统.克氏重组酶基因²²受玉米热休克蛋白17.7（Hsp17.7）23启动子和马铃薯引脚II终止剂的控制。两个loxP位点（在相同的方向^）24侧翼四个基因表达盒，包括ZsGreen，cre，Bbm和Wus2。

由于植物成熟和随后的后代不需要形态基因的存在，热诱导的cre-loxP重组系统被内置到T-DNA中，以去除玉米基因组中的形态基因，允许正常的甲酸细胞再生和植物发育。热处理后，CRE蛋白的表达除除赫拉选择基因外的所有转基因。成功的转化剂应该是抗除草剂，但ZsGreen-负。为了进一步提高转化频率，农业细菌菌株还含有一个额外的附属质粒（PHP71539），具有额外的农业细菌毒性（vir）基因¹²的副本。

QuickCorn 方法不同于传统的玉米转化协议，因为它在转化过程中不涉及 callus 感应步骤。在感染农业细菌后的第一周，体细胞胚胎在受感染的未成熟胚胎的上皮上形成。然后，胚胎被移植到一个培养基，激素，鼓励胚胎成熟和芽形成。迅速将体细胞胚胎转移到成熟/芽形成介质上，跳过了以前用于玉米转化的传统卡鲁斯阶段，允许直接生成T0植物^8。与之前公布的玉米转化方法⁶相比，QuickCorn方法更快、更高效、基因型依赖性更低。使用这种方法，根植植物通常只需5-7周即可转移到土壤中，而不是传统协议要求的3个月或更长时间。本文的目的是提供该方法的深入描述和演示，以便在大多数学术机构通常的实验室环境中更容易复制。

1. 成长媒体准备

1. 有关此协议的确切生长介质配方，请参阅表 1。
2. 为了准备 1 L 介质，将 2 L 烧杯放在搅拌板上，并在搅拌栏内放置一个搅拌棒。
3. 用 900 mL 的蒸馏水加注烧杯，然后打开搅拌板。搅拌棒应以中等速度旋转。
4. 称量所有粉末状成分，并溶解在烧杯中。
5. 测量出所有液体成分（如果有）并添加到烧杯中。
6. 使用蒸馏水将最终体积调至 1 L。
7. 测量 pH 值并调整配方规格。
8. 如果配制液体生长介质，则不添加琼脂。将过滤器消毒器连接到真空泵，并通过过滤器倒出液体生长介质。打开泵并等待所有液体通过。在容器上放置一个盖并贴上标签。
9. 如果配制固体生长介质，在调整pH后，将琼脂直接加入瓶中或烧瓶中。
10. 将 1 L 液体生长介质倒入 2 L Erlenmeyer 烧瓶中，或将其分成两个 1 L 可高压灭瓶（每个瓶 500 mL）。如果使用两个瓶子，将琼脂分开并直接添加到瓶子中。
11. 盖上可透气的盖子，如两层铝箔，让蒸汽逸出。如果使用瓶子，将螺钉盖在顶部松散地盖上。
12. 在121°C下高压灭菌25分钟。
13. 高压灭菌后，从高压灭菌器中取出生长介质，冷却至55-60°C（设置为55°C的水浴可以使其更容易）。使生长介质保持液体状态几个小时，直到倒入板方便。
14. 冷却后，加入所有灭菌后添加剂（见表1），然后彻底混合。
15. 添加所有成分后，将指定的体积倒入层流罩中所选择的容器中。
16. 生长介质可手动或使用液体点胶装置倒入所需的培养皿中。手动浇注时，建议将大量灭菌介质转移到较小的无菌烧杯（500 mL）中，以便于操作。
17. 允许生长中度冷却和凝固。
18. 生长介质在变成固体后可以使用，最好在第二天在无菌流动罩中稍稍干燥一夜，作为盖板的堆栈使用。过夜干燥后，将板转移到塑料套筒中，折叠在松软的末端，用一小块胶带保持原位。这样可以防止过度干燥。介质可储存在凉爽、黑暗和清洁的环境中（4-16 °C），长达 1 个月。

2. 种植供体植物和收获未成熟的耳朵

1. 在含有无土基板的 1.5 加仑（5.9 升）罐中，在温室中种植任何可公开种植的玉米近亲繁殖（即 B73、Mo17 或 W22）。使用 16/8（日/夜）照片，白天的平均温度为 25.5 °C，夜间为 20°C。
2. 植物根据需要浇水，用受控释放肥料（N-P-K，15-9-12）施肥，这种肥料既可以加入土壤混合物，也可以在种植后添加到土壤中。
3. 种子发芽后，耳朵通常需要大约70-90天才能出现。当耳芽出现时，用枪袋盖住它们，以防止失控的授粉发生。
4. 丝绸出现后约2-3天，如果第二天有花粉可用，用剪刀切割丝绸，用70%乙醇消毒。将丝绸和壳皮切到壳叶末端以下约 2.5 厘米，在那里丝绸出现。授粉可以在第二天进行。务必在每个耳朵之间使剪刀恢复。
5. 一旦从流苏中浮现出，用流苏袋和非滑形回形针盖住流苏，在茎周围的袋子底部。
6. 第二天早上，轻轻地弯曲植物，并点击袋子，鼓励花粉被释放。
7. 取出流苏袋，将袋子顶部折叠起来，以防止花粉逸出。通常最好在使用前1天将流苏装袋（以避免死花粉堆积和脱落的花粉）。新鲜花粉可以从流苏收集约3-5天。当花冠从流苏底部的内花中出现时，这种流苏在第二天可能不会产生可行的花粉。
8. 使用来自同一植物的花粉（自种）或来自同一近亲繁殖（吸血）的另一种植物的花粉。
9. 取出耳袋或切下袋子的末端以暴露丝绸，然后迅速将流苏袋中的花粉倒入丝绸上。
10. 立即用流苏袋盖住耳朵，并钉住茎周围的袋子底座，将其固定。在授粉过程中，将植物与不同基因型的开花植物进行物理分离可能会有所帮助，以帮助防止交叉授粉。将流苏袋留在耳朵上，直到未成熟的耳朵准备好收获。
11. 授粉后9-12天，筛选胚胎大小的耳朵。将授粉袋向上滑动，露出耳朵。轻轻地向下拉壳，将内核暴露在耳朵周长的三分之一到四分之一和耳朵下约三分之一的距离上。尖端附近的内核不能代表平均胚胎大小。
12. 使用手术刀，切掉单个内核的盖子，在大小和颜色上与大多数其他内核相似。
13. 使用铲子（带尺子）取出步骤 4.6 中描述的胚胎。使用铲子或数字卡尺上的内置标尺测量胚胎的长度。如果胚胎在1.5-2.0毫米之间，收获耳朵。如果为 ±1.3 mm，则耳朵可能在当天晚些时候准备收获，并可在 7-8 小时左右再次检查。

3. 为感染准备农业细菌悬浮培养物

注: 含有PHP81430（图1）和PHP71539¹²的农业细菌菌株LBA4404（Thy-）储存在-80°C处。这些材料可通过材料转移协议从科尔特瓦农业科学公司获得。LBA4404（Thy-）是一种辅助营养菌株，需要在生长介质中提供胸腺素。辅助营养农业菌株的主要用途是用于生物控制目的。它有减少农业过度生长的额外好处。辅助营养农业菌株不生长没有补充胸腺素。然而，胸腺素可以（大概）由培养中垂死的植物组织提供。因此，仍然需要在介质中提供抗生素，以完全控制辅助营养农业。然而，在缺乏胸腺素的情况下，由于辅助营养菌株的生长受损，控制起来会更容易。

1. 在感染日期前四天，从甘油库存中启动"母亲"板，在YP板上用50毫克/L胸腺酰胺、50毫克/L根霉素和50毫克/L的光谱霉素（表1）条纹细菌。在20°C的培养箱中孵育"母亲"板3天。
2. 在感染实验的前一天，准备一个"工作"板，从"母亲"板中选择一到五个菌落，并将细菌从"母亲"板条纹到新的YP板（用胸腺素、根霉素和光谱霉素）;表 1）。
3. 在顺序象限中将每日"工作"板分层，将循环 1x 穿过刚条纹的区域，进入连续的象限，重复形成已连续稀释的象限。在27°C的培养箱中孵育"工作"板过夜。
4. 完成胚胎解剖（步骤4.8）后，使用循环或类似工具从"工作"板区域收集农业细菌，其中细菌生长可见为稀薄的菌落条纹。
   注意:避免在板中带有细菌生长茂密草坪的区域。在密集地区，农业细菌的生长可能已经开始下降，而在具有可见菌落的地区，细菌处于适当的感染生长阶段。
5. 将收集的细菌悬浮在含有10 mL 700A液体介质的50 mL管中（表1）。涡旋完全中止细菌培养。
6. 测量波长为 550 nm 的光学密度。调整音量，直到 OD 介于 0.35-0.45 之间，其中 0.4 为最佳值。
   注:如果 OD 高于 0.45，则添加更多 700A 液体介质。如果 OD 低于 0.35，则在悬浮培养中接种更多农业菌落。

4. 胚胎解剖、感染和共同培养

1. 选择合适的耳朵进行转化实验;这些应该有一个良好的种子集，有胚胎的大小范围从1.5-2.0毫米。它们通常在授粉后9-12天之间收获。收获的耳朵可以在4°C下新鲜使用或储存1-4天，但反应质量可能会随着第一天以后的长时间储存而逐渐降低。
2. 取下外壳和丝绸。将手柄插入耳底或顶部。手柄可以是一对钳子、螺丝刀等。
3. 将耳朵放入大型容器（例如，2 L 烧杯，手柄朝上，用消毒液填充容器）。消毒液为1.8升20%商业漂白剂（1.65%次氯酸钠）和几滴表面活性剂Tween 20。
4. 在层流台内消毒耳朵。20分钟后，倒空漂白液，用大量无菌蒸馏水冲洗耳朵3倍（每片5分钟）。除去水，让耳朵干燥几分钟。
   注:将耳朵完全浸入漂白液中20分钟非常重要。偶尔在漂白液中小心地移动耳朵，以去除气泡。
5. 准备一个2 mL微离心管，填充700A液体介质。这个管子将用于收集未成熟的胚胎。
6. 取耳朵并使用无菌手术刀，取出内核冠的顶部1-2毫米，以暴露内膜。使用微型铲子去除未成熟的酶体胚胎 （IZE）。IZE 将位于内核内，位于面向耳尖的一侧，并靠近 cob 的附件。使用铲子，将其插入离胚胎最远的围场的内膜，然后轻轻向上扭转，取出胚胎，并允许取出胚胎（图2）。
7. 使用铲子将胚胎移植到含有700A液体介质的管中。继续这样做，直到收集了多达100个胚胎。在继续下一步之前，可以填充多个管（+100个胚胎/管）。此时，应准备农业细菌悬浮液（参见步骤 3.5）。
8. 使用 1 mL 移液器从胚胎管中取出 700A 液体介质。加入新鲜的700A介质来清洗胚胎，然后取出该介质。
9. 在低设置（3/10）上添加1 mL的农业细菌悬浮液和涡旋，用于30s或反转管12x-15x进行混合。让此管水平在长凳上放置 5 分钟。
10. 5分钟后，将整个胚胎管和农细菌悬浮液转移到562V共培培养基板（表1）。这可以通过将板放在长凳上，并快速将管内内容物倒入板中来实现。轻轻旋转板以分配胚胎，并使用 1 mL 移液器去除Agrobac 悬架。
11. 确保胚胎的放置与黄骨（圆形）侧朝上。如果需要，请使用放大镜或解剖范围。将盘子放入塑料盒（19 厘米 x 28 厘米 x 5.1 厘米）中，在黑暗中 21°C 下孵育板 16-18 小时。无需使用石蜡薄膜或通风胶带进行单独的板包装。
12. 经过一夜的共育后，将受感染的胚胎、黄脑侧向上，转移到静息介质605T（表1）。每盘放置约30个胚胎。在黑暗中在26-28°C下孵育板。
13. 孵育4-10天（7天优先）。此时，可以在酶体血皮表面观察到体细胞胚胎的发育（图3）。

5. 选择、热处理和再生

1. 休息期后，热冲击胚胎。将装有胚胎板的盒子放入45°C的培养箱中，相对湿度为70%，为2小时。然后，从45°C培养箱中取出盒子，在26-28°C暗培养箱中放置1-2小时。
   注:如果无法在培养箱中达到 70% 的湿度，在板盒底部添加双层高压灭其要纸巾，然后用高压灭水浸泡以保持包装箱内的湿度。将盘子返回到纸巾顶部的盒子上，在 45°C 下盖盖。使用小型数字湿度计/温度计监控温度和湿度。
2. 热处理IzEs从静热介质转移到芽形成介质（13329A），含有0.05毫克/升伊马扎皮尔作为选择性剂（表1）。转移时，使用细尖钳或手术剪刀，取出小刀（如果存在）。
3. 每盘放置10-15个胚胎，以避免过度拥挤。将胚胎保存在该培养基中2周，在26°C暗培养箱中。
4. 将胚胎转移到生根介质（13158;表 1）为期1-2周。每盘约8片，在27°C下在光室或灯室（16天/8夜，20-150μmol/m²/s）中孵育。
5. 随着植物的发展，将含有芽和生根的更强壮的植物放在新的生根介质板上，每盘放置一株植物。这将允许更强壮的植物生长。将盘子放在灯室或灯室中再放置7-14天。
   注意:小心地取出与植物相关的任何卡鲁斯件，以确保其与介质保持良好接触。
6. 当植物变得更加有活力时，将植物从生根介质中取出，用自来水冲洗根部以去除琼脂。
7. 将单个植物移植到含有预湿无土基板的 3^英寸（+19 厘米²） 罐中。将锅放在带排水孔的托盘（27 厘米 x 54 厘米）中，用塑料湿度圆顶盖住公寓。这种适应步骤可以在生长室或温室中实现，如上文第2节（步骤2.1）所述生长条件。

6. 移植到温室和生产T1种子

1. 每天检查2次植物。根据需要浇水。确保植物既不干也不过水。保持稍微干燥的基质可促进根部生长。
   注:移植后4-7天可去除湿度圆顶。植物应该生长在这些小盆中，直到它们从移植到土壤的压力中明显恢复。这大约需要9-14天。
2. 将整个无土插头和植物移植到 1.5 加仑（5.9 升）锅中。当土壤感觉干燥时，在温室和水中保持接触。
3. 在锅中加入N-P-K为15-9-12的受控释放肥料，该肥料可以加入基材混合物或涂在表面。
4. 当耳芽开始从植物中出现时，使用芽袋盖住耳芽。请务必使用半透明的袋子，以便在不拆卸袋子的情况下观察新兴的丝绸。射击袋允许进行受控授粉。重要的是要总是袋转基因流苏。
5. 丝绸出现后（1-2天），修剪出的丝绸到一个均匀的长度。这将在壳叶顶部以下约2.5厘米。使用一把用70%乙醇消毒的清洁剪刀。通过修剪丝绸，第二天形成统一的护身带，以便进行授粉。
6. 对于大多数玉米基因型，授粉的最佳时间是流苏或丝出现后的2-3天。
7. 从同一植物（如果是自授）或同一近亲繁殖的野生类型（如果杂交或交叉）收集花粉。
8. 将花粉收集到流苏袋中，并将其涂在 T0 植物的丝质上。如果花粉来自野生型（非转基因）植物，则将花粉放入一个普通的棕色流苏袋中。如果花粉来自转基因植物，将花粉放入绿色条纹袋中，以指示花粉是转基因的。
9. 请按照步骤 2.5-2.10 了解授粉详细信息。
10. 授粉后约2周，从耳朵中取出流苏袋，然后开始干燥。为了帮助干燥，在授粉21-25天后停止给植物浇水。您也可以拉回壳叶来暴露种子。这种做法还有助于防止霉菌。
11. 授粉后约45天，收获种子，储存在4-12°C的冷库。

这里演示的是三个公共玉米近亲繁殖系（B73、Mo17 和 W22）的农业细菌介导基因转化的分步方案，这些基因在玉米遗传学领域具有重要意义。使用传统的玉米转化协议5，无法实现三种近亲繁殖线的转化。图 1和图 2分别显示了此处使用的构造和起始材料。耳朵一般在授粉后9-12天收获。长度在 1.5-2.0 mm 之间的 IZEs 是本协议转换的最佳外植物（图 2）。

感染8天后，ZsGreen表达体细胞胚胎在荧光显微镜的GFP通道下被可视化（图3）。受感染的Izes在感染8天后接受热处理（步骤5.1和5.2）。这种治疗诱导了CRE重组酶的表达，切除了两个loxP位点之间的Bbm、Wus2、cre和ZsGreen表达盒（图1）。热处理组织随后在含有除草剂的芽形成培养基上培养，以在变形基因去除后选择转化组织。

在感染后3-4周左右观察到具有成熟胚胎或芽的增殖组织对伊马扎皮尔有抗药性（图4）。一些抗伊玛扎皮尔的对ZsGreen呈阴性，这表明在这些组织中可能发生胰部导型切除（图4）。在组织被转移到生根的中光孵化后，芽开始发展（图5）。健康和充满活力的生长芽与发达的根收获（图5）。有些组织似乎有多个芽 （图5E，F，G）。这种类型的"草"再生剂可能是由于克隆植物具有相同的转基因整合模式。分子生物学分析是需要基因型这些植物。

使用该协议以及本工作中使用的构造，所有三个公共近亲繁殖线都响应良好。W22产生的最高频率的抗伊马扎皮尔芽，频率约为14%（每100个受感染的未成熟胚胎约14个转基因芽）。B73和Mo17都产生了约4%的转基因芽。这些频率指示所有转基因芽，包括携带形态基因的植物和通过CRE介导切除的形态基因的植物。

图1:二元质粒PHP81430的T-DNA区域的原理图表示。RB = 右 T-DNA 边框;loxP = CRE 重组酶目标位点;Axig1pro:Wus2 = 玉米辅助诱导促进剂 （Zm-Axig1） = Zm-Wus2 = 玉米IN2-1终止器;Pltppro:Zm-Bbm = 玉米磷脂转移酶蛋白 （Zm-Pltp） 促进剂 + Zm-Bbm = 水稻T28终结器（Os-T28）;Hsppro:cre = 玉米热休克蛋白 17.7 启动子 （Zm-Hsp17.7） + cre重组酶基因 + 马铃薯蛋白酶抑制剂 II （pinII） 终止剂;Ubipro:ZsGreen = 高梁泛素促进剂/intron（Sb-Ubi） = 绿色荧光蛋白ZsGreen基因 + 水稻泛素终止剂（Os-Ubi）;Hra盒 = 高梁醋酸酯酶合成酶 （Sb-Als） 促进剂 + 玉米赫拉 （Zm-Hra） 基因 = pinII终止剂;LB = 左 T-DNA 边框;colE1， 质粒 ColE1 的复制来源25;规格R = 抗光谱霉素基因aadA1从 Tn21 用于细菌选择26;代表A，B，C = 复制起源从pRiA4的农业细菌根基基因27。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:起始材料。B73耳朵在授粉后12天收获（A）。B73 （B）、 Mo17 （C） 和 W22 （D） 的未成熟胚胎请点击此处查看此图的较大版本。

图3:感染后1周休息介质的组织发育。在荧光显微镜（GFP过滤器）下显示GFP表达Mo17（A）和W22（B）体细胞胚胎的胚胎（感染后8天）在明场（C） 和 GFP 滤波器 （D） 下发育组织 （B73）请点击此处查看此图的较大版本。

图4:组织发育成熟介质与选择。W22成熟板 （A）在明场（B）和 GFP 过滤器 （C） 下发育组织 （Mo17， 感染后 15 天）在明场（D） 和 GFP 过滤器 （E） 下发育组织 （Mo17， 感染后 28 天）箭头指向缺乏GFP表达的再生组织，表明在热诱导的CRE蛋白活性后，loxP位点之间的ZsGreen基因被切除。请点击此处查看此图的较大版本。

图5:根培养的组织发育。W22 （A）、 B73 （B） 和 Mo17 （C，D） 的芽。B73（E） 和 W22（F，G. ） 的多个芽（草再生剂）的事件。用B73 （H） 和 W22 （I. ） 的根射门。请点击此处查看此图的较大版本。

表1:玉米转化的介质成分。请点击此处查看此表（右键单击下载）。

艾丽西娅·马斯特斯、威廉·戈登-卡姆和托德·琼斯是科尔特瓦农业科学公司的员工，他们提供本文中使用的 B73、Mo17 和 W22 的协议和玉米耳。作者康敏贞、摩根·麦考、雅各布·佐布里斯特和王康没有任何要透露的。