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农杆菌利用形态发生基因介导难转化玉米自交系未成熟胚的遗传转化

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DOI：

10.3791/60782

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2020年2月14日

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1Department of Agronomy, Iowa State University, 2Department of Applied Science and Technology, Corteva Agriscience, 3Crop Bioengineering Center, Iowa State University, 4Interdepartmental Plant Biology Major, Iowa State University, 5Interdepartmental Genetics and Genomics Major, Iowa State University

本文内容

摘要

植物形态发生基因可用于改善难转化基因型的遗传转化。本文描述了一种 农杆菌介导的三种重要公共玉米自交系遗传转化（QuickCorn）方案

摘要

此处展示了一项详细的实验方案 农杆菌利用形态发生基因介导的玉米自交系遗传转化 婴儿潮 (Bbm）和 Wuschel2 (Wus2). Bbm 受玉米磷脂转移酶基因（phospholipid transferase gene）调控Pltp）启动子，以及 Wus2 受玉米生长素诱导型启动子调控（Axig1) 启动子。一个 农杆菌 携带这些形态发生基因的菌株位于转移DNA（T-DNA）上，并含有额外拷贝 农杆菌 毒力病毒) 基因用于侵染玉米未成熟胚外植体。体细胞胚胎在受侵染胚的盾片上形成，并可通过除草剂抗性进行筛选，进而萌发成植株。一种热激活的 cre/loxP DNA构建体中内置的重组系统可在转化过程的早期阶段从玉米基因组中移除形态发生基因。采用本方案，W22、B73和Mo17的转化频率分别可达约14%、4%和4%（每100个感染胚胎中独立转基因事件的数量）。

引言

转化是评估外源基因在玉米中表达以及创制转基因玉米品系的基本工具，广泛应用于科研和商业目的。高通量转化技术的可及性有助于满足玉米分子与细胞生物学研究日益增长的需求1。对作物物种进行遗传转化的能力对于公共和私营实验室均至关重要，这不仅有助于深入理解基因调控机制，也有助于在全球范围内改良作物，以支持持续增长的人口需求。

1975年，研究人员发现玉米的未成熟胚胎可用于产生可再生的愈伤组织2自这一发现以来，大多数可扩展的玉米转化方案均需在再生前进行愈伤组织形成和筛选。3在遗传转化过程中， 农杆菌感染或经基因枪轰击的未成熟胚在培养基上进行培养，以诱导胚性愈伤组织的形成。将诱导出的愈伤组织转移至选择性培养基（例如含有除草剂的培养基）上继续培养，使只有转化的愈伤组织片段能够存活。这些具有除草剂抗性的候选转基因愈伤组织被扩繁后再生为完整植株。尽管该方法有效，但过程耗时较长且劳动强度大，完成整个流程可能需要三个月以上的时间4更重要的是，传统的玉米转化方案存在更大的局限性，即仅有有限数量的玉米基因型能够被转化。5,6.

Lowe 等人7,8 先前报道了一种 "QuickCorn" 一种转化方法，不仅显著缩短了转化过程所需时间，而且扩大了可转化的基因型范围。QuickCorn 方法利用玉米的直系同源基因（Zm-Bbm 和 Zm-Wus2的 拟南芥 转录因子 BABY BOOM (BBM)9 和 WUSCHEL (WUS)10当整合到转化载体系统中时，这些基因可协同作用，促进胚胎发生性生长7.

本研究中描述的QuickCorn方案基于Jones等人11报道的方案，而该方案是对Lowe等人7,8所报道方法的进一步改进。在本研究中，使用携带双元载体构建体PHP81430（图1）和辅助质粒PHP7153912的农杆菌（Agrobacterium）菌株LBA4404(Thy-)进行转化。PHP81430的T-DNA包含以下分子元件。（1）转化筛选标记基因Hra的表达盒。Hra（Zm-Hra）基因为经修饰的乙酰乳酸合酶（ALS）基因，来源于玉米，对ALS抑制类除草剂（如磺酰脲类和咪唑啉酮类）具有耐受性13,14。Zm-Hra基因受高粱ALS启动子8和马铃薯蛋白酶抑制剂II（pinII）终止子15调控。T-DNA还包含（2）含有转化可视筛选标记基因ZsGreen的表达盒。ZsGreen是一种来自Zoanthus sp. 珊瑚的绿色荧光蛋白基因16，由高粱泛素启动子/内含子驱动，并由水稻泛素终止子终止。

此外，T-DNA 包含（3）形态发生基因 Bbm 的表达盒。Bbm 是一种与胚胎发育相关的转录因子9,17。Bbm 由玉米磷脂转移蛋白（Pltp）启动子8 和水稻 T28 终止子18 调控。Zm-Pltp 是一种在胚盾片上皮、花丝毛状体和叶副卫细胞（保卫细胞两侧）中强烈表达，在生殖器官中表达水平较低，而在根中无表达的基因8。T-DNA 还包含（4）形态发生基因 Wus2 的表达盒。Wus2 是另一种与顶端分生组织维持相关的转录因子19。Zm-Wus2 受玉米生长素诱导型启动子（Zm-Axig1）20 和玉米 In2-1 终止子21 的调控。最后，T-DNA 包含（5）cre-loxP 重组系统。cre 重组酶基因22 受玉米热激蛋白 17.7（Hsp17.7）23 启动子和马铃薯 pinII 终止子的调控。两个相同方向的 loxP 位点24 包围了包括 ZsGreen、cre、Bbm 和 Wus2 在内的四个基因表达盒。

由于形态发生基因的存在不利于植物成熟及后续后代，因此采用热诱导方法 cre-loxP 重组系统被构建到T-DNA中，以从玉米基因组中移除形态发生基因，从而允许正常的愈伤组织再生和植株发育。经热处理后，CRE蛋白的表达会删除除目标基因外的所有转基因序列 Hra 筛选基因。成功的转化子应具有除草剂抗性，但 ZsGreen阴性。为进一步提高转化频率，可 农杆菌 该菌株还携带一个额外的附加性质粒（PHP71539），其含有额外拷贝的 农杆菌 毒力病毒基因12.

QuickCorn 方法不同于传统的玉米转化方案，因为在转化过程中不涉及愈伤组织诱导步骤。在用农杆菌（Agrobacterium）感染后的第一周内，体细胞胚在受感染的未成熟胚的盾片上皮组织上发育。随后将这些胚转移到含有促进胚成熟和芽形成的激素的培养基上。快速将体细胞胚转移至成熟/芽形成培养基，跳过了以往玉米转化中常用的愈伤组织阶段，从而实现 T0 代植株的直接生成8。与先前发表的玉米转化方法6相比，QuickCorn 方法更快、效率更高，且对基因型的依赖性更低。采用该方法，通常仅需 5 至 7 周即可获得生根植株并移栽至土壤，而传统方案则需要三个月或更长时间。本文旨在对该方法进行深入描述和演示，以便在大多数学术机构常见的实验室条件下更易于重复操作。

方案

1. 培养基制备

  1. 有关本方案的精确培养基配方，请参见表1。
  2. 配制1 L培养基时，将一个2 L烧杯置于搅拌器上，并在其中放入搅拌子。
  3. 向烧杯中加入900 mL蒸馏水，并开启搅拌器。搅拌子应以中等速度旋转。
  4. 称取所有粉状成分，并在烧杯中溶解。
  5. 量取所有液态成分（如有），并加入烧杯中。
  6. 用蒸馏水定容至最终体积1 L。
  7. 测定pH值，并根据配方要求进行调节。
  8. 若配制液体培养基，则不添加琼脂。将过滤除菌装置连接至真空泵，并将液体培养基倒入滤器中。开启真空泵，待液体完全滤过。为容器加盖，并贴上标签。
  9. 若配制固体培养基，在调节pH值后，直接将琼脂加入瓶或烧瓶中。
  10. 将1 L液体培养基倒入一个2 L锥形瓶中，或分装至两个可高压灭菌的1 L瓶中（每瓶500 mL）。若使用两个瓶子，需将琼脂均分并直接加入各瓶中。
  11. 用透气盖（如双层铝箔）覆盖锥形瓶，以允许蒸汽逸出。若使用瓶子，则将螺旋盖松松盖上。
  12. 在121 °C下高压灭菌25分钟。
  13. 灭菌完成后，从高压灭菌锅中取出培养基，冷却至55–60 °C（可使用设定为55 °C的水浴以方便操作）。保持培养基液态数小时，直至便于倒平板时使用。
  14. 冷却后，加入所有灭菌后添加物（见表1），并充分混匀。
  15. 所有成分加入后，在超净工作台中将指定体积的培养基倒入所选容器中。
  16. 培养基可手动或使用液体分配装置倒入所需的培养皿中。手动操作时，建议将大量灭菌后的培养基转移至较小的无菌烧杯（500 mL）中，以便操作。
  17. 让培养基冷却并凝固。
  18. 培养基凝固后即可使用，最好在超净工作台中将带盖培养皿堆叠过夜干燥后次日使用。过夜干燥后，将培养皿装入塑料套中，将开口端折叠，并用少量胶带固定，以防止过度干燥。培养基可在阴凉、避光、洁净的环境中（4–16 °C）保存最长1个月。

2. 培养供体植株并收获未成熟果穗

  1. 在温室中使用1.5加仑（5.9 L）的容器种植任何公开可获得的玉米自交系（例如B73、Mo17或W22），容器中填充无土基质。采用16小时光照/8小时黑暗的光周期，白天平均温度为25.5 °C，夜间为20 °C。
  2. 根据需要对植株进行浇水，并施用缓释肥料（氮-磷-钾比例为15-9-12），该肥料可混入土壤基质中，也可在播种后施加于土壤表面。
  3. 通常在种子萌发后约70至90天，果穗开始抽出。当雌穗开始抽出时，用穗袋覆盖以防止发生非控制性授粉。
  4. 在花丝抽出后约2至3天，若次日可获得花粉，使用经70%乙醇消毒的剪刀剪除花丝。剪除位置位于苞叶末端下方约2.5 cm处，即花丝抽出的位置。授粉可在次日进行。每次处理不同果穗前，务必重新消毒剪刀。
  5. 一旦雄穗的花药从穗顶抽出，立即用雄穗袋覆盖雄穗，并在袋基部使用防滑纸夹固定于茎秆上。
  6. 次日上午，轻轻将植株弯下，轻敲雄穗袋以促使花粉释放。
  7. 取下雄穗袋后，将袋口折叠封住，防止花粉逸出。通常建议在使用前1天即套袋（以避免死花粉和脱落花药的积聚）。新鲜花粉一般可从雄穗收集3至5天。当雄穗基部内侧小花的花药开始抽出时，该雄穗次日很可能不再产生有活力的花粉。
  8. 使用同一植株的花粉（自交）或同一自交系另一植株的花粉（同胞交配）。
  9. 取下果穗袋或剪开袋端以暴露花丝，随后迅速将雄穗袋中的花粉倾倒至花丝上。
  10. 立即用雄穗袋重新覆盖果穗，并用订书钉将袋基部固定于茎秆上以确保密封。授粉期间，将植株在物理上与其他不同基因型的开花植株隔离，有助于防止异花授粉。雄穗袋应一直保留在果穗上，直至未成熟果穗准备采收。
  11. 授粉后9至12天，检查果穗的胚大小。将授粉袋沿茎秆向上推，暴露果穗。轻轻下拉苞叶，暴露果穗约三分之一至四分之一周长范围，以及果穗长度方向约三分之一区域的籽粒。靠近果穗顶端的籽粒不能代表平均胚大小。
  12. 使用解剖刀，切下大小和颜色与大多数其他籽粒相似的单个籽粒的顶部帽状结构。
  13. 使用带有刻度尺的刮铲，按步骤4.6所述方法取出胚。使用刮铲自带的刻度尺或数字卡尺测量胚的长度。若胚长度在1.5–2.0 mm之间，即可采收果穗。若胚长约1.3 mm，则可能在当天晚些时候达到采收标准，可于约7–8小时后再次检查。

3. 准备用于侵染的Agrobacterium悬浮培养物

注意：该 农杆菌 含有 PHP81430 的菌株 LBA4404(Thy-)图1）和 PHP7153912 以甘油菌种形式保存于 -80 °C。这些材料可通过材料转移协议（Material Transfer Agreement）从科迪华农业科技（Corteva Agriscience）获得。LBA4404(Thy-) 是一种营养缺陷型菌株，其生长培养基中需添加胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine）。该营养缺陷型农杆菌的主要用途是实现生物 containment（生物封闭）。此外，它还能有效减少农杆菌的过度生长。营养缺陷型农杆菌在缺乏外源胸腺嘧啶脱氧核苷的情况下无法生长。然而，培养过程中死亡的植物组织可能（推测）会释放胸腺嘧啶脱氧核苷，从而支持其生长。因此，仍需在培养基中添加抗生素，以彻底抑制营养缺陷型农杆菌的生长。但由于该菌株在缺乏胸腺嘧啶脱氧核苷时生长能力受损，其生长更易于控制。

  1. 感染前四天，开始一项 "母亲" 从甘油菌种中挑取细菌，在含有50 mg/L胸腺嘧啶、50 mg/L庆大霉素和50 mg/L壮观霉素的YP平板上划线接种表1）。将混合物孵育 "母亲" 在20 °C培养箱中培养3天。
  2. 感染实验前一天，准备一个 "工作" 通过从平板中选取一至五个菌落 "母亲" 平板划线分离细菌 "母亲" 平板转移至新的YP平板（含胸腺嘧啶、庆大霉素和链霉素）； 表1).
  3. 划线接种每日培养物 "工作" 在连续的四个象限中划线，将接种环在刚划过的区域来回移动一次进入下一个象限，重复此操作以形成依次稀释的象限。培养平板 "工作" 在27 °C培养箱中过夜培养平板。
  4. 完成胚胎解剖（步骤4.8）后，使用接种环或类似工具收集 农杆菌 来自某一区域的 "工作" 平板上可见细菌以细长的菌落条纹形式生长。
    注意：避免选择细菌生长密集的区域。 农杆菌 在密集区域，细菌生长可能已经开始下降，而在可见菌落的区域，细菌则处于适合感染的生长阶段。
  5. 将收集的细菌悬浮于含有10 mL 700A液体培养基的50 mL离心管中（表1）。涡旋振荡以充分悬浮细菌培养物。
  6. 在550 nm波长下测定光密度。调整体积使OD值介于0.35–0.45之间，以0.4为最佳值。
    注意：如果OD值高于0.45，则加入更多700A液体培养基；如果OD值低于0.35，则在悬浮培养物中接种更多的农杆菌菌落。

4. 胚胎解剖、感染与共培养

  1. 选择适合转化实验的玉米穗；应挑选结籽良好、胚大小在1.5–2.0 mm范围内的籽粒。通常在授粉后9–12天进行采收。采收后的玉米穗可直接使用，或在4 °C下保存1–4天，但保存时间超过1天后，组织反应质量可能会随保存时间延长而逐渐下降。
  2. 去除玉米穗的苞叶和穗丝。将工具（如镊子、螺丝刀等）插入玉米穗的基部或顶部。
  3. 将耳部组织放入一个较大的容器中（例如，2 L烧杯，杯柄朝上），加入消毒液。消毒液由1.8 L的20%商用漂白剂（含1.65%次氯酸钠）和数滴表面活性剂Tween 20组成。
  4. 在超净工作台内对耳朵进行灭菌。20分钟后，倒掉次氯酸钠溶液，用大量无菌蒸馏水冲洗耳朵3次（每次5分钟）。移除水分，让耳朵干燥数分钟。
    注意：耳组织必须完全浸没在漂白液中 20 分钟。期间需不时轻轻搅动漂白液中的耳组织，以去除气泡。
  5. 准备一个装有700A液体培养基的2 mL微量离心管，用于收集未成熟胚。
  6. 取下玉米穗，使用无菌解剖刀切除籽粒冠部顶端1-2 mm，以暴露胚乳。用微型刮铲取出未成熟合子胚（IZE）。IZE位于籽粒内部，靠近果穗尖端一侧，并临近与穗轴的连接处。使用刮铲从远离胚的果皮沟槽处插入胚乳，然后轻轻向上扭转，以松动胚乳，从而便于取出胚图2).
  7. 使用刮勺将胚胎转移至含有700A液体培养基的离心管中。重复此操作，直至收集约100个胚胎。在进行下一步之前，可填充多个离心管（每管约100个胚胎）。此时， 农杆菌 应制备悬浮液（见步骤 3.5）。
  8. 用1 mL移液器从胚胎管中移除700A液体培养基。加入新鲜的700A培养基洗涤胚胎，然后同样移除该培养基。
  9. 加入1 mL的 农杆菌 悬液并在低速下涡旋振荡（3/10档）30秒，或上下翻转试管12–15次以混匀。将该试管水平静置于实验台面上5分钟。
  10. 5分钟后，将整管胚胎转移至 农杆菌 将悬浮液接种至含有562V共培养基的培养板中（表1）。这可以通过将培养皿放在实验台上，迅速将试管中的内容物倒入培养皿中来实现。轻轻摇晃培养皿以分散胚胎并去除 农杆菌 使用1 mL移液器重悬。
  11. 确保将胚胎的盾片（圆形）一侧朝上放置。如有需要，可使用放大镜或解剖显微镜。将培养皿放入塑料盒（19 cm x 28 cm x 5.1 cm）中，在黑暗条件下于21 °C培养过夜，16–18 h。无需使用石蜡膜或透气胶带对单个培养皿进行包裹。
  12. 在共培养过夜后，将感染的胚胎（盾片朝上）转移至静置培养基605T（表1每皿放置约30枚胚胎。将培养皿置于26–28 °C避光条件下孵育。
  13. 孵育4–10天（推荐7天）。此时可在合子胚盾片表面观察到体细胞胚的发育。图3).

5. 筛选、热处理与再生

  1. 静置期结束后，对胚胎进行热激处理。将装有胚胎培养皿的盒子置于45 °C、相对湿度为70%的培养箱中，持续2小时。随后，将盒子从45 °C培养箱中取出，转移至26–28 °C的黑暗培养箱中继续培养1–2小时。
    注意：若无法在培养箱中达到70%的湿度，可在培养皿盒底部铺上双层经高压灭菌的纸巾，并用高压灭菌水浸湿，以维持盒内湿度。将培养皿放回纸巾上方，盖紧盒盖后置于45 °C环境中。可使用小型数字温湿度计监测盒内温度和湿度。
  2. 将热处理后的IZEs从静置培养基转移至含0.05 mg/L咪唑啉酮（imazapyr）作为筛选剂的丛生芽诱导培养基（13329A）中（表1）。转移时，若存在胚芽鞘，需使用精细尖头镊子或手术剪小心去除。
  3. 每皿放置10–15个胚胎，避免过度拥挤。将胚胎在26 °C黑暗培养箱中继续培养2周。
  4. 将胚胎转移至生根培养基（13158；表1）中培养1–2周。每皿放置约8个组织块，置于光照培养室或光照培养箱（光照周期16小时/黑暗8小时，光强20–150 µmol/m2/s）中，温度维持在27 °C。
  5. 随着小植株的发育，将已长出茎叶和健壮根系的较强植株转移至新的生根培养基平板上，每皿放置一株。此操作有助于促进植株进一步健壮生长。将培养皿继续置于光照培养室或光照培养箱中培养7–14天。
    注意：小心去除与植株相连的愈伤组织，确保植株与培养基充分接触。
  6. 当植株生长更加旺盛时，将其从生根培养基中取出，用自来水冲洗根部以去除琼脂。
  7. 将单株植株移栽至含有预湿润无土基质的3 in2（约19 cm2）育苗盆中。将育苗盆放入带有排水孔的托盘（27 cm × 54 cm）内，并用塑料保湿罩覆盖。此驯化过程可在人工气候室或温室中进行，生长条件同上文第2节（步骤2.1）所述。

6. 移栽至温室及T1代种子的收获

  1. 每天检查植株两次，根据需要进行浇水，确保植株既不缺水也不过度浇水。保持基质略微干燥有助于促进根系生长。
    注意：移栽后4–7天可移除保湿罩。植株应继续在小盆中培养，直至明显从移栽至土壤的胁迫中恢复，通常需要约9–14天。
  2. 将整个无土插块及幼苗移栽至1.5加仑（5.9 L）的花盆中。在温室中继续培养，并在土壤表面感觉干燥时进行浇水。
  3. 向花盆中添加氮-磷-钾比例为15-9-12的控释肥料，可将其混入基质中，或施用于基质表面。
  4. 当果穗开始从植株中抽出时，使用果穗袋覆盖果穗。应选用半透明的袋子，以便在不取下袋子的情况下观察吐丝情况。果穗袋可用于实现受控授粉。务必始终对转基因雄穗使用果穗袋。
  5. 在花丝抽出后（1–2天），将已抽出的花丝修剪至统一长度，约为苞叶顶部以下2.5 cm处。使用经70%乙醇消毒的干净剪刀进行操作。通过修剪花丝，次日可形成整齐的花丝簇，便于授粉。
  6. 对于大多数玉米基因型，最佳授粉时间是在雄穗或花丝抽出后的2–3天。
  7. 采集来自同一植株的花粉（若进行自交授粉），或来自相同自交系野生型植株的花粉（若进行杂交或同型杂交）。
  8. 将花粉收集到雄穗袋中，并将其涂抹到T0植株的花丝簇上。若花粉来自野生型（非转基因）植株，则将其放入普通棕色雄穗袋中；若花粉来自转基因植株，则将其放入绿色条纹袋中，以标明其为转基因花粉。
  9. 授粉的具体操作请参照步骤2.5–2.10。
  10. 授粉约两周后，取下果穗上的雄穗袋，开始让果穗自然干燥。为促进干燥过程，可在授粉后21–25天停止浇水。也可将苞叶向后拉开，使种子暴露在外，此操作亦有助于防止霉变。
  11. 授粉约45天后，收获种子并储存在4–12 °C的低温环境中。

结果

此处演示的是一项逐步操作的实验方案 农杆菌介导的三种公共玉米自交系（B73、Mo17 和 W22）的遗传转化，这三种自交系在玉米遗传学领域具有重要意义。使用常规玉米转化方案无法实现这三种自交系的转化5. 图1 和 图2 分别显示此处使用的构建体和起始材料。通常在授粉后9-12天收获幼穗。对于本实验方案，长度在1.5-2.0 mm之间的IZEs是最佳的转化外植体。图2).

感染后第8天，在荧光显微镜的GFP通道下观察到表达ZsGreen的体细胞胚胎（图3）。感染后的IZEs在感染后第8天进行热处理（步骤5.1和5.2）。该处理可诱导CRE重组酶的表达，从而切除位于两个loxP位点之间的Bbm、Wus2、cre和ZsGreen表达盒（图1）。热处理后的组织随后培养在含有除草剂咪唑吡啶的芽形成培养基上，以在形态发生基因被移除后筛选转化组织。

感染后约3-4周，观察到含有成熟胚胎或抗咪唑吡啶的芽体的增殖组织（图4）。部分抗咪唑吡啶的组织未显示ZsGreen荧光，提示这些组织中可能发生了由cre介导的基因片段切除（图4）。将组织转移至生根培养基并在光照条件下培养后，芽开始发育（图5）。随后收获了生长健康、长势旺盛且根系发育良好的植株（图5）。部分组织表现出多芽现象（图5E,F,G）。此类“丛生状”再生植株可能源于克隆植株具有相同的转基因整合模式。需通过分子生物学分析对这些植株进行基因型鉴定。

三种公共自交系对该实验所用方案及载体均表现出良好的响应。W22产生的抗咪唑啉酮幼苗频率最高，约为14%（每100个感染的未成熟胚约产生14个转基因幼苗）。B73和Mo17均产生约4%的转基因幼苗。这些频率包含所有转基因幼苗，既包括携带形态发生基因的植株，也包括通过CRE介导切除而移除了形态发生基因的植株。

基因编辑载体图解，PHP81430，突出显示转化组件、T-DNA 和载体骨架。
图 1：双元质粒 PHP81430 的 T-DNA 区域示意图。 RB = 右侧 T-DNA 边界；loxP = CRE 重组酶识别位点；Axig1pro:Wus2 = 玉米生长素诱导型启动子（Zm-Axig1）+ Zm-Wus2 + 玉米 In2-1 终止子；Pltppro:Zm-Bbm = 玉米磷脂转移蛋白（Zm-Pltp）启动子 + Zm-Bbm + 水稻 T28 终止子（Os-T28）；Hsppro:cre = 玉米热激蛋白 17.7 启动子（Zm-Hsp17.7）+ cre 重组酶基因 + 马铃薯蛋白酶抑制剂 II 终止子（pinII）；Ubipro:ZsGreen = 高粱泛素启动子/内含子（Sb-Ubi）+ 绿色荧光蛋白 ZsGreen 基因 + 水稻泛素终止子（Os-Ubi）；Hra 盒 = 高粱乙酰乳酸合酶（Sb-Als）启动子 + 玉米 Hra（Zm-Hra）基因 + pinII 终止子；LB = 左侧 T-DNA 边界；colE1，质粒 ColE1 的复制起点25；SpecR = 来自 Tn21 的链霉素抗性基因 aadA1，用于细菌筛选26；Rep A,B,C = 根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）pRiA4 质粒的复制起点27。 请点击此处查看此图的放大版本。

玉米穗发育阶段；种子显微技术；实验植物学；玉米生长分析。
图 2：起始材料。 授粉后 12 天收获的 B73 品系玉米穗（A）。B73（B）、Mo17（C）和 W22（D）的未成熟胚胎。请点击此处查看该图的放大版本。

植物组织的荧光显微镜图像，显示细胞结构；比例尺表示尺寸大小。
图3：接种后1周在静止培养基上组织的发育情况。 接种后8天的胚胎在荧光显微镜（GFP滤光片）下观察，显示表达GFP的Mo17（A）和W22（B）体细胞胚胎。B73品系的发育组织在明场（C）和GFP滤光片（D）下的图像。请点击此处查看该图的高清版本。

胚性愈伤组织的植物组织培养实验；显微观察与GFP荧光分析。
图4：含筛选的成熟培养基上的组织发育。 W22基因型的成熟培养板（A）。Mo17基因型组织在感染后15天的明场（B）与GFP荧光滤光片下（C）的发育情况。Mo17基因型组织在感染后28天的明场（D）与GFP荧光滤光片下（E）的发育情况。箭头指示正在再生但无GFP表达的组织，表明在热诱导CRE蛋白活性后，loxP位点之间的ZsGreen基因已被切除。 请点击此处查看此图的高清版本。

离体植物培养、繁殖阶段；培养皿示意图；组织培养生长分析。
图 5：在生根培养基上的组织发育。 W22（A）、B73（B）和 Mo17（C,D）的芽。B73 出现多芽事件（草状再生植株）（E），W22 出现多芽事件（F,G）。B73 带根的芽（H），W22 带根的芽（I）。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：玉米转化培养基配方。 请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。

讨论

传统的玉米转化方法遵循分离未成熟合子胚以产生转基因愈伤组织，再将愈伤组织再生为可育植株的模式4,6。尽管该方法有效，但基于愈伤组织的流程耗时较长，组织培养过程通常需要长达3个月才能获得植株。本文所介绍方法的重要意义在于其无需愈伤组织、效率高、速度快，能够在大约一半的时间内实现T0代植株的再生。此外，该方法对基因型的依赖性似乎较低，因此对大多数公开可用的自交系均有效8,11。

尽管所有步骤都应有效执行，但正确配制培养基至关重要。培养基的各组分需在灭菌前和灭菌后正确阶段依次添加，以确保植物材料获得适当浓度的化学物质，从而保护抗生素等敏感化合物不被降解。此外，各阶段均需按照实验方案要求，将植物材料置于正确的培养基上，若未使用合适的培养基，可能导致材料死亡。同时，应避免在培养皿中放置过多的胚或发育中的组织。尽管将组织块数量加倍可能节省试剂、培养皿以及培养箱空间的成本，但过于拥挤的培养皿会严重抑制组织生长。进行侵染操作时，应确保农杆菌（Agrobacterium）悬浮液的光密度处于适当范围；若菌液浓度过低，则可能无法实现有效侵染。

起始材料的质量对于转化实验方案的成功至关重要。用于胚分离的玉米穗必须健康，这意味着产生这些玉米穗的植株也必须健康。此外，玉米穗应具有充足的结实率，并且无虫害和病害。同时，陈旧的 农杆菌 不应使用。 "母亲" 培养皿使用时间不应超过2周，超过此期限后应更换新的培养皿 "母亲" 应划线接种平板以开始新的实验。

尽管该方法已被证明对基因型的依赖性较低，但不能假定所有品系都会获得相同程度的成功。不同品系之间仍可能存在差异，且转化效率也会因所使用的载体构建而有所不同。在操作未成熟胚时，不同玉米穗之间的变异也无法避免，因此理想情况下实验应使用多个玉米穗以消除这一影响。在本研究中，自交系 W22 表现最佳，转化频率超过约 14%，其次是 B73 和 Mo17（均约为 4%）。Lowe 等人8 报道了使用 QuickCorn 方案对 B73 和 Mo17 进行遗传转化，其中 B73 的转化频率范围为 9%–50%，Mo17 为 15%–35%。

本研究中观察到的B73和Mo17转化频率较低，可能归因于耳穗质量的季节性波动。本研究与Lowe等人的研究8之间的另一个差异在于使用了不同的载体构建体。在Lowe的研究中，形态发生基因并未从转化植株中移除，而是在发育后期被沉默。而在本研究中，形态发生基因在感染后8天即被移除。B73和Mo17可能需要更长时间保留Bbm/Wus2，以促进体细胞胚胎的发育。

采用该方法，有可能获得非转基因逃逸植株、多拷贝插入以及未完全切除的转基因植株。这些植株的表型可能无明显差异，因此需要通过PCR检测来确定植株是否为转基因植株。为此，可使用位于切除区域内部的PCR引物以及跨越切除区域两侧的引物。此外，多个独立转化事件可能来源于同一个未成熟胚，这使得独立转化植株总回收率的确定变得困难。我们的标准做法是：根据每个产生植株的未成熟胚中选取一株进行取样，再除以感染的胚总数，以此计算转化率。该方法几乎肯定会低估实际回收的独立转化事件数量。要区分来自同一胚的独立转化事件，需对转基因侧翼区域进行测序，而这对于大多数应用而言成本过高且耗时；尽管在某些情况下，这些数据可能具有实用价值。

这种组织培养转化方法已被证明非常有效，但仍可能出现问题。如果植物材料没有产生预期反应，可能是特定的自交系存在问题，表明需要调整培养基成分和继代培养时间等变量。另一个变量是载体设计的合理性和载体构建的准确性，尤其是在原始载体被修改的情况下。此外，还可能存在咪唑烟酸敏感性问题，因为某些品系比其他品系更敏感，可能需要调整咪唑烟酸的浓度以获得成功转化的植株。

在过去的30年中，玉米组织培养和转化技术不断发展和进步；人们相信这一缩短的实验流程将进一步推动该领域的发展。该方法适用于学术研究环境，因为它比传统方法更节省时间。此外，该方法不需要操作人员具备高度专业化的技能，因此相较于传统方法更易于广泛推广。未来，该方法还可与基因组编辑等新技术相结合。

披露

Alicia Masters、William Gordon-Kamm 和 Todd Jones 是提供本文章所用 B73、Mo17 和 W22 玉米穗及实验方案的科迪华农业科技（Corteva Agriscience）的员工。作者 Minjeong Kang、Morgan McCaw、Jacob Zobrist 和 Kan Wang 无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢科迪华温室团队提供玉米未成熟果穗，感谢科迪华培养基制备实验室在培养基制备方面的协助，感谢科迪华的宁王（Ning Wang）在农杆菌（Agrobacterium）载体构建方面的帮助，以及感谢爱荷华州立大学的Keunsub Lee提供的协助。本项目部分得到了以下资助：K.W. 获美国国家科学基金会植物基因组研究计划项目1725122和1917138号拨款；J.Z. 获美国国家科学基金会预测性植物表型组学研究培训计划（DGE-1545453）资助；美国农业部NIFA哈奇项目#IOW04341、爱荷华州州政府资金，以及爱荷华州立大学作物生物工程中心的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）Millipore SigmaD7299
6-苄氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine, BAP）Millipore SigmaB3408
乙酰丁香酮（Acetosyringone）Millipore SigmaD134406
琼脂（Agar）Millipore SigmaA7921
铝箔（Aluminum foil）用于覆盖烧瓶
硫酸铵（Ammonium Sulfate）Millipore SigmaA4418
分析天平（Analytical balance）用于称量少量化学品
高压灭菌器（Autocalve）Primus (Omaha, NE)PSS5-K用于培养基和工具的高压灭菌
细菌接种环（10 µl）Fisher scientific22-363-597从平板上收集农杆菌并转移至液体中
细菌琼脂（Bactoagar）BD bioscience214030
烧杯（1 L, 2 L, 4 L）用于混合培养基化学品
苯菌灵（Benomyl）Millipore Sigma#45339
漂白剂（8.25% 次氯酸钠）Clorox用于种子消毒
硼酸（Boric Acid）Millipore SigmaB6768
二水合氯化钙（Calcium Chloride Dihydrate）Millipore SigmaC7902
羧苄青霉素（Carbenicillin）Millipore SigmaC3416
酪蛋白水解物（Casein Hydrolysate）PhytotechC184
头孢噻肟（Cefotaxime）PhytotechC380
锥形管（50 mL）Fisher scientific06-443-19用于盛装液体培养基和农杆菌悬浮液
比色皿（半微量，Cuvette）Fisher scientific14955127用于盛装液体以测量光密度（OD）
二氯喹啉酸（Dicamba）PhytotechD159
数字式温湿度计（Digital hygrometer）用于检测热处理过程中的温度和湿度
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA, Disodium Salt, Dihydrate）Millipore Sigma324503
微量离心管（2.0 mL）ThermoFischer ScientificAM12475
埃里克森维生素（Eriksson's Vitamins）PhytotechE330液体中1000倍浓缩
乙醇（70%）用于工具和表面的消毒
七水合硫酸亚铁（Ferrous Sulfate Heptahydrate）Millipore SigmaF8263
肥料，Osmocote Plus 15-9-12ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH)A903206肥料
烧瓶（2 L）Pyrex10-090E用于培养基和工具的高压灭菌
育苗盘（标准1020型，敞口带孔，11"W x 21.37"L x 2.44"D）Hummert International (Earth City, Mo)11300000用于盛放土壤和育苗插件，可与保湿罩配套使用
镊子（细尖和大号）细尖镊用于操作胚，大号镊用于处理大块植物材料或作为耳夹使用
庆大霉素（Gentamicin）Gold BiotechnologiesG-400
玻璃瓶（1 L）Pyrex06-414-1D用于培养基的高压灭菌
量筒（Graduated cylinder）用于调节培养基体积
咪唑啉酮（Imazapyr）Millipore Sigma37877
培养箱，20 °CPercival ScientificModel I-36NL用于母板培养及农杆菌感染期间的胚培养
培养箱，27 °CPercival ScientificModel I-36NL用于共培养板和玉米胚的培养
培养箱，45 °C用于热激处理
育苗插件（TO Standard, pots）Hummert International (Earth City, Mo)11030000用于将植株从生根阶段移栽至土壤，可与育苗盘和保湿罩配套使用
超净工作台（Laminar flow hood）维持无菌环境
L-脯氨酸（L-proline）PhytotechP698
七水合硫酸镁（Magnesium Sulfate Heptahydrate）Millipore SigmaM1880
玉米自交系种子 B73美国国家植物种质资源库（U.S National Plant Germplasm）id=47638
玉米自交系种子 Mo17美国国家植物种质资源库（U.S National Plant Germplasm）id=15785
玉米自交系种子 W22美国国家植物种质资源库（U.S National Plant Germplasm）id=61755
一水合硫酸锰（Manganese Sulfate Monohydrate）Millipore SigmaM7899
Milli-Q 水纯化系统（Milli-Q Water purification systems）Millipore sigmaMILLIQ用于提供组织培养级用水
MS 基本培养基（MS Basal Medium）Millipore SigmaM5519
MS 基本盐混合物（MS Basal Salt Mixture）Millipore SigmaM5524
N6 基本盐混合物（N6 Basal Salt Mixture）Millipore SigmaC1416
防滑回形针（Paperclips, non-skid）用于固定穗袋
蛋白胨（Peptone）BD bioscience211677
培养皿（100x15 mm）Fisher scientificFB0875713用于细菌培养基
培养皿（100x25 mm）Fisher scientificFB0875711用于植物组织培养基
pH 计（pH meter）Fisher scientificAB150用于调节培养基的 pH 值
移液器（1 mL）ThermoFischer Scientific4641100N
塑料盒（Plastic Boxes）The Container Store10048430用于组织培养物的储存和培养
塑料保湿罩（Plastic humidy dome, Humi-Dome）Hummert International (Earth City, Mo)14385100用于覆盖土壤育苗盘
碘化钾（Potassium Iodide）Millipore Sigma793582
硝酸钾（Potassium Nitrate）Millipore SigmaP8291
磷酸二氢钾（Potassium Phosphate Monobasic）Millipore SigmaP5655
电子秤（Scale）用于称量培养基化学品
手术刀片（No. 11, 4 cm）Thermo Scientific3120030用于切除籽粒顶部以进行胚分离
手术刀柄（Scalpel handle）用于安装手术刀片
申克与希尔德布兰特维生素（Schenk & Hildebrandt Vitamin, S&H vitamin）PhytotechS826100倍粉末
剪刀（Scissors）用于剪切果穗
果穗袋（Canvasback-半透明）Seedburo (Des Plaines, IL)S26半透明袋，用于覆盖果穗
硝酸银（Silver Nitrate）Millipore SigmaS7276
二水合钼酸钠（Sodium Molybdate Dihydrate）Millipore SigmaM1651
无土基质 LC1SunGro Horticulture (Agawam, Ma)#521用于玉米植株的栽培
双头微型锥形刮刀（Spatula, Double Ended Micro-Tapered）Fischer Scientific2140110用于从籽粒中分离胚
带勺刮刀（Spatula, with spoon）Fisher scientific14-375-10用于称量培养基化学品
壮观霉素（Spectinomycin）Millipore SigmaS4014
分光光度计（Genesys 10S UV-Vis）Thermo Scientific840-300000用于测量农杆菌悬浮液的光密度（OD）
搅拌子（Stirring bar）Fisher scientific14-513-67用于混合培养基
磁力搅拌加热板（Stirring hotplates）用于混合培养基
注射器（无针头，60 mL）Fisher scientific14-823-43用于过滤除菌
滤膜注射器（0.22 µm）Fisher scientific09-720-004用于过滤除菌
雄穗袋（Canvasback-棕色）Seedburo (Des Plaines, IL)T514用于覆盖非转基因植株的雄穗
雄穗袋（Canvasback-绿色条纹）Seedburo (Des Plaines, IL)T514G用于覆盖转基因植株的雄穗
盐酸硫胺素（Thiamine HCl）PhytotechT390
噻二唑脲（Thidiazuron）PhytotechT888
胸苷（Thymidine）Millipore SigmaT1895
替门汀（Timentin）PhytotechT869
吐温-20（Tween 20）Fisher ScientificCas #9005-64-5表面活性剂
涡旋混合器 Genie 2（Vortex Genie 2）Scientific IndustriesSI0236用于均质化液体（如农杆菌悬浮液）
水浴锅（大型 - Precision model 186）Fisher scientificany that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C用于保持高压灭菌后的培养基处于最佳温度
称量皿（Weigh dish）Fisher scientific08-732-112用于称量培养基化学品
称量纸（Weighing paper）Fisher scientific09-898-12A用于称量培养基化学品
酵母提取物（Yeast Extract）Fisher ScientificBP14222
玉米素（Zeatin）Millipore SigmaZ0164

参考文献

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农杆菌利用形态发生基因介导难转化玉米自交系未成熟胚的遗传转化
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