方法文章

展示肾皮质提取物中血管内皮生长因子与黄体生成素之间的线性关系

DOI：

10.3791/60785

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2020年1月22日

 ,  , 
1Zietchick Research Institute

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种利用皮质肾提取物制备及总蛋白标准化的方法，以证明血管内皮生长因子与哺乳动物肾脏中黄体生成素之间的相关性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血管内皮生长因子（VEGF）有助于调控肾脏中的血管生成和血管通透性。糖尿病肾病等肾脏疾病与肾脏中VEGF的失调有关。然而，在生理条件下调控肾脏VEGF的因素尚不明确。促黄体生成素（LH）是一种促血管生成激素，可调节生殖器官中VEGF的生理表达。鉴于肾脏中存在LH受体，我们Zietchick研究所在本研究中提出假设：LH也可能参与调控肾脏中VEGF的表达。为提供证据，我们的目标是证明LH水平能够预测哺乳动物肾脏中VEGF的水平。大多数涉及肾脏的VEGF相关研究均采用低等哺乳动物作为模型（如啮齿类和兔）。为了将研究成果向人体转化，本研究选择在高等哺乳动物（即牛和猪模型）中探讨VEGF与LH之间的关系。本实验方案使用肾皮质的总蛋白裂解液。该方法成功的关键包括：从屠宰场动物死亡后立即获取肾脏，以及通过总蛋白含量对肾提取物中的分析物水平进行标准化。本研究成功证实了在牛和猪的肾脏中，LH与VEGF之间存在显著的线性关系，且结果在两个不同物种中均可重复。该研究提供了有力证据，表明牛和猪的肾提取物是研究肾脏生理学的优良、经济且丰富的资源，尤其适用于分析VEGF与其他分析物之间的相关性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A, VEGF-A）有助于调节肾脏及其他器官的血管生成和血管通透性1,2（下文中将VEGF-A简称为VEGF）。肾脏中VEGF的水平受到严格的稳态调控。当肾脏内VEGF水平升高或降低时，可能导致肾功能障碍。例如，出生后3周内，足细胞特异性VEGF杂合缺失的小鼠会出现内皮细胞病和无血流的肾小球（即人类先兆子痫中可见的肾病变），这些杂合子小鼠在3月龄时即发展为终末期肾衰竭。而足细胞特异性VEGF纯合敲除的小鼠则在出生后1天内因胎儿水肿和肾衰竭死亡3,4。

另一方面，肾组织中 VEGF 的过表达会导致蛋白尿和肾小球肥大3,4。例如，过表达 VEGF 的转基因兔在肾病早期表现为进行性蛋白尿和肾小球滤过率升高，而在后期则出现肾小球滤过率下降3。糖尿病肾病是糖尿病成人终末期肾病的主要病因，与 VEGF 调控异常密切相关2,5。在病理条件下，缺氧诱导 VEGF 表达的作用已受到广泛关注5。然而，在生理条件下（包括肾脏及其他器官）调控 VEGF 的因素尚不明确2,6。明确除氧气以外参与生理性和病理性 VEGF 调控的其他因素，是一项重要的研究任务。

黄体生成素（LH）是一种促血管生成激素，可帮助调节卵巢和睾丸等生殖器官中血管内皮生长因子（VEGF）的生理表达7,8。既往研究已提供证据表明，LH 还可在非生殖器官（如眼睛）中调节 VEGF 的表达6,9,10。肾脏的髓质和皮质中均存在 LH 受体11,12。值得注意的是，肾小管上皮细胞以及 LH 受体均可表达 VEGF11,12,13,14。综合以上两点观察结果，我们提出假设：LH 也可帮助调节肾脏中 VEGF 的表达13,14。为了验证这一 LH/VEGF 关系，本实验方案旨在证明 LH 水平能够预测肾脏中的 VEGF 水平。以往许多涉及肾脏的 VEGF 相关研究均采用低等哺乳动物模型（如啮齿类动物和兔）2。为了将研究成果向人体应用转化，本研究考察了高等哺乳动物（此处为牛和猪模型）中 VEGF 与 LH 之间的关系。为实现该目标，从牛和猪肾脏的皮质区域制备了总蛋白裂解液。

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方案

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本研究未使用任何活体或实验动物。

1. 组织处理

  1. 从屠宰场屠宰后立即获取牛和猪的完整肾脏。将肾脏置于冰上运输至实验室。
  2. 到达实验室后，用 50 mL 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗肾脏。重复此步骤 2 次，以彻底去除血液。
  3. 将肾脏置于冰上（或冷藏）直至进行后续提取操作。

2. 肾脏解剖

  1. 使用无菌剪刀、镊子、刀片和培养皿解剖肾脏并切除所需组织部分。
  2. 在肾脏解剖前配制 RIPA 裂解缓冲液。将 5 mM NaCl、0.5 M EDTA、1 M Tris（pH = 8.0）、NP-40（ID + GEPAL CA-630）、10% 脱氧胆酸钠和 10% SDS 溶于双蒸水中，充分混匀。未使用时将 RIPA 裂解缓冲液置于冰箱冷藏保存。
  3. 沿矢状面将肾脏轻轻切成两半，并从肾脏中心的皮质区域切取一块组织（50–70 mm2，湿重 80–100 mg）。
  4. 用刀片将组织块切成小片，以辅助后续匀浆过程。
  5. 组织切碎后，将其转移至含有 1 mL 冰冷 1× RIPA 裂解提取缓冲液的微量离心管中。将离心管置于冰上，待后续提取使用。

3. 组织匀浆化

  1. 用特定的样本信息标记微量离心管，用于组织上清液的收集。
  2. 使用带有无菌探头的手持匀浆器，在低温条件下（将样本置于冰桶中）匀浆组织1-2分钟，直至肉眼不可见组织块。
  3. 立即对组织提取物进行冷藏离心机离心处理，条件为4 °C、9,600 × g 离心5分钟。
  4. 从离心机中取出离心管，放回冰桶中。
  5. 将上清液转移至新标记的微量离心管中，并置于冰上保存。弃去沉淀物。
  6. 分别准备上清液的独立分装样品，用于黄体生成素（LH）和血管内皮生长因子A（VEGF-A）酶联免疫吸附测定（ELISA）以及总蛋白分析，以避免反复冻融。

4. 牛和猪LH ELISA检测

  1. 将市售的黄体生成素（LH）ELISA试剂盒中的所有ELISA检测组分（参见材料表）储存于2-8 °C。这些组分包括抗体、HRP标记物、检测板（96孔）、校准品、洗涤缓冲液（20倍浓缩液）、底物A、底物B和终止液。按照制造商说明书推荐的方法配制所有试剂。
  2. 开始检测前，将所有试剂和检测板恢复至室温（RT）。根据实验需要使用相应数量的孔，密封后将未使用的孔板保存于4 °C，直至使用。
  3. 用双蒸水将洗涤缓冲液（15 mL的20倍浓缩液）稀释至300 mL。
  4. 设置空白孔，不加入任何溶液。
  5. 向每个孔中加入50 µL标准品或待测样本（n = 2），然后向每孔加入50 µL辣根过氧化物酶（hrp）标记物。立即再向每孔加入50 µL抗体溶液。密封反应板，充分混匀，并在37 °C孵育1小时。
  6. 用1倍洗涤缓冲液（每孔200 µL）洗涤孔板，重复洗涤4次。
  7. 向每孔加入50 µL底物A和50 µL底物B，通过轻轻拍打板子侧面充分混匀。密封反应板，在避光条件下于37 °C孵育15分钟。
  8. 向每孔加入50 µL终止液，轻轻拍打板子混匀，然后使用设定为450 nm波长的分光光度计读取吸光度值。
  9. 将牛和猪的LH水平归一化为总蛋白含量（见第6节）。

5. 牛和猪 VEGF-A ELISA 检测

  1. 将市售的血管内皮生长因子-A（VEGF-A）ELISA试剂盒中的所有ELISA检测组分（参见材料表）储存于2-8 °C。这些组分包括抗体、HRP偶联物、检测板（96孔）、校准品、洗涤缓冲液（20倍浓缩液）、底物A、底物B和终止液。按照制造商说明书推荐的方法配制所有试剂。
  2. 开始检测前，将所有试剂和检测板恢复至室温。根据实验所需使用相应数量的孔板，密封后将未使用的孔板保存于4 °C，直至使用。
  3. 用双蒸水将洗涤缓冲液（15 mL的20倍浓缩液）稀释至300 mL。
  4. 向每个孔中加入100 µL标准品或样品（n = 2）。密封孔板，充分混匀，并在37 °C孵育2小时。
  5. 吸去各孔中的液体，每孔加入100 µL检测试剂A，密封孔板，在37 °C孵育1小时。
  6. 用1倍洗涤缓冲液（每孔400 µL）洗涤孔板，重复4次。
  7. 每孔加入100 µL检测试剂B，轻轻拍打孔板侧面以充分混匀。密封孔板，在37 °C孵育1小时。
  8. 用1倍洗涤缓冲液（每孔400 µL）洗涤孔板，重复4次。
  9. 每孔加入90 µL底物溶液，轻轻拍打孔板，于37 °C孵育1小时。
  10. 每孔加入50 µL终止液，轻轻拍打孔板，然后使用设定为450 nm波长的分光光度计读取吸光度值。
  11. 将牛和猪的VEGF-A水平归一化为总蛋白含量（第6节）。

6. 总蛋白定量

  1. 根据制造商说明，使用商品化试剂盒（参见材料表），通过标准牛血清白蛋白（BSA）测定法估算牛和猪肾脏提取物的总蛋白含量。

7. 统计分析

  1. 计算每种分析物的均值、中位数和标准差。
  2. 利用 Kolmogorov-Smirnov 检验测试样本分布相对于正态分布的偏离程度，以确定在应用时选择参数检验还是非参数检验 与非参数统计检验。若数据呈正态分布，则采用参数检验进行统计分析。
  3. 在适当条件下（如数据呈正态分布），利用回归模型分析黄体生成素（LH）与血管内皮生长因子A（VEGF-A）之间的线性关系。

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结果

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不同动物种类及性别的 LH 和 VEGF 平均值与中位数水平见表1。通过 Kolmogorov-Smirnov 正态性检验确认数据正态分布后，采用线性回归模型分析 LH 与 VEGF 之间的关系。结果表明，LH 在牛和猪的肾脏中均为 VEGF 的强效且显著的预测因子（牛肾脏模型：n = 7，R2 = 0.86，p = 0.002；猪肾脏模型：n = 7，R2 = 0.66，p = 0.025）。

LH与VEGF的线性关系如图1（牛回归模型）和图2（猪回归模型）所示。牛的线性方程为：VEGF水平 = 2.156 × LH水平 + 68.75。猪的线性方程为：VEGF水平 = 196.7 × LH水平 + 47.94。

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讨论

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在动物死亡后立即从屠宰场获取肾脏是本方法成功的关键。这正是使用牛和猪器官相较于人类尸体器官的主要优势。人类尸体器官的获取通常在死亡后至少延迟12至24小时。由于器官的化学组成在死亡后2小时内即发生显著变化15,16，因此在人类尸体肾脏中进行的VEGF研究可能无法反映真实生理状况。尽管本方案特别强调在动物器官取出后应立即获取并置于冰上，但目前尚不清楚其他研究人员是否同样重视此步骤。例如，一项近期研究（利用牛和猪肾脏检测抗生素残留）的方法部分并未说明动物死亡与器官获取及冷藏之间的时间间隔17。

本研究使用 commercially available、species-specific 的 ELISA 检测目标分析物（VEGF 和 LH）。ELISA 具有高灵敏度，操作简便，且结果可靠18。该实验方案中的关键步骤是将（ELISA 测定的）分析物水平通过总蛋白进行标准化。肾皮质提...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zietchick 研究所（ZRI）是一家私营（营利性）研究机构，Tammy Movsas 博士（ZRI 的创始人兼主任）已提交了关于促性腺激素拮抗剂用于治疗眼部疾病和糖尿病的专利申请，并拥有相关已核准专利。除在 ZRI 担任雇员（生物化学家）外，A. Muthusamy 博士无其他财务利益冲突需要申报。A. Arivalagan（ZRI 夏季实习生，密歇根大学本科生）无其他财务利益冲突需要申报。

致谢

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作者感谢密歇根州布利斯菲尔德的肖尔屠宰场（Scholl's Slaughterhouse）提供牛肾和猪肾。本研究未使用任何资助经费。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛LH ELISA试剂盒MyBiosource, San Diego, CA.MBS700951
牛VEGF-A ELISA试剂盒MyBiosource, San Diego, CA.MBS2887434
Micro BCA蛋白定量检测试剂盒ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.23235
猪LH ELISA试剂盒MyBiosource, San Diego, CA.MBS009739
猪VEGF-A ELISARay Biotech, Norcross, GA.ELP-VEGFA-1
RIPA裂解与提取缓冲液ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.89901

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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