基于活体显微镜的肠道通透性与上皮细胞脱落功能评估方法

摘要

利用活体显微技术，本文所介绍的方法能够实现对活体动物肠道上皮细胞脱落过程的实时可视化观察。因此，通过对麻醉小鼠的肠道黏膜进行局部染色（吖啶黄和罗丹明B-葡聚糖），可借助共聚焦显微镜以单细胞分辨率进行成像。

摘要

利用共聚焦成像技术对活体动物肠道进行活体显微观察，可实时监测上皮细胞脱落及屏障渗漏现象。因此，可对麻醉小鼠的肠黏膜局部施用非特异性染料（吖啶黄）和荧光示踪剂（罗丹明-B-葡聚糖），将其置于经生理盐水冲洗的载片上，直接使用共聚焦显微镜进行成像。该技术可作为其他无创性检测肠道通透性渗漏方法的补充，例如口服示踪剂跨黏膜转运的检测。此外，本文所述方法能够实现对细胞脱落事件的实时直接观察。结合适当的荧光报告小鼠模型，该方法适用于揭示调控肠上皮细胞外排的细胞与分子机制，也可用于研究其他生物学过程。在过去几十年中，利用活体显微技术开展的多项有趣研究，已增进了人们对内皮通透性、免疫细胞归巢至肠道、免疫-上皮细胞间通讯以及管腔成分侵入等现象的认识。综上所述，本文所述实验方案不仅有助于深入理解调控上皮细胞外排的机制，还可能为开发用于观察其他高度动态细胞过程（甚至在其他组织中）的新方法奠定基础。在技术局限性方面，特定组织的光学特性以及所选用的成像技术和显微镜配置，将决定成像的工作距离和所获图像的分辨率。

引言

肠道是一个高度特化的器官，其功能受到严格调控，能够同时实现两种相互矛盾的过程，即营养吸收和抵御有害的管腔物质。作为人体与外界环境之间的界面，肠上皮发挥着物理和免疫屏障的作用，并有助于维持肠道黏膜稳态^1,2。上皮完整性丧失以及紧密连接通透性增加，已被广泛证实与炎症性肠病（IBD）密切相关^3,4,5,6。因此，上皮结构的改变在IBD中既被视为慢性肠道炎症的诱因，也被认为是炎症持续放大的继发因素。因此，深入理解IBD患者肠道中早期上皮改变，对于开发恢复上皮完整性的新策略、实现IBD复发的可靠预测和有效预防具有重要意义。

肠上皮经历着复杂且受到严密调控的更新过程。从隐窝底部开始，由多能干细胞分化而来的终末分化肠上皮细胞（IECs）向上迁移至绒毛顶端，在此处衰老或受损的细胞被排出进入肠腔⁷。细胞分裂与细胞脱落之间的平衡可维持肠上皮细胞数量的稳定，避免形成细胞间隙和渗漏，同时也防止上皮细胞过度积聚，从而避免形成细胞团块及肿瘤发生⁸

方案

以下方案已获得德国埃尔兰根当地相关主管部门（下弗兰肯行政区，维尔茨堡）的批准。小鼠饲养于特定无病原体条件下。

注意：在 Pggt1b^iΔIEC 小鼠中，IEC 内 GGTase 介导的异戊二烯化作用受到抑制会导致肠道通透性发生严重改变²⁴。因此，本研究采用该小鼠模型来展示该实验方案如何用于研究肠道屏障缺陷。然而，该方案也可用于其他任何小鼠品系的研究。

1. 手术准备及小鼠肠道黏膜染色

注意：手术准备基于先前描述的方案²⁵。在手术过程中，将麻醉后的小鼠置于红色灯下，以防止其体温下降。

1. 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮 96 mg/kg；赛拉嗪 12.8 mg/kg）对小鼠进行麻醉。通过检查角膜反射是否消失来确认麻醉效果。
2. 使用棉签涂抹眼部保护膏。
3. 使用标准镊子和直头精细剪刀在小鼠左侧腹区做一切口（1 cm）。
4. 将一段肠管（约 5–7 cm）外置于体外。
5. 在对系膜侧使用电灼法纵向切开已外置的肠段。
6. 暴露黏膜，并用生理盐水短暂冲洗以去除粪便内容物。
   注意：可选操作，可在肠道局部直接应用赛拉嗪以避免因蠕....

结果

本文所述方案介绍了一种基于活体显微镜的技术，用于实时观察肠道上皮通透性及肠上皮细胞脱落过程。简言之，对小鼠进行麻醉并实施手术准备，以暴露小肠黏膜表面。通过局部应用吖啶橙对肠上皮细胞（IECs）进行染色；同时将罗丹明B标记的葡聚糖经肠腔灌注，作为示踪剂以检测其从肠腔向黏膜下间隙的跨膜迁移。随后，将完成手术准备的小鼠置于培养皿内的载玻片上，并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行时间序列成像（图1）。成像后的数据分析可计算出上皮细胞脱落速率（每分钟每基底膜长度的细胞脱落事件数），以及在特定时间点的瞬时渗漏百分比（细胞旁通透性）和“通透性细胞”比例（跨细胞通透性）。

为了诱导上皮完整性的改变，我们利用了先前报道的肠上皮细胞（IEC）特异性GGTase缺陷型条件性小鼠模型（Pggt1b^iΔIEC小鼠），该模型通过LoxP-Cre系统构建

讨论

尽管技术上具有挑战性，基于活体显微镜的方法仍是一种独特的实验手段，可实时观察高度动态的细胞过程，例如细胞脱落行为。迄今为止，尚无其他实验方法能够在体内可视化细胞挤出过程。我们相信，该方案有助于描述多种在维持肠道稳态中发挥重要作用的细胞过程。

利用活体显微技术，本文所介绍的方法能够实现对活体动物肠道上皮细胞脱落过程的实时可视化观察。因此，通过对麻醉小鼠的肠道黏膜进行局部染色（吖啶黄和罗丹明B-葡聚糖），可借助共聚焦显微镜以单细胞分辨率进行成像。结合常规示踪实验，该方法可在体内识别肠道通透性异常，并区分细胞旁路与跨细胞通透性。结合报告基因小鼠模型，类似方案可用于监测上皮细胞脱落过程，还可揭示紧密连接重新分布以封闭脱落细胞所遗留的暂时性渗漏区域的现象（拉链样效应）^22,26。

除了上皮细胞脱落外，本文所述方法的改进已被应用于分析发生在肠黏膜表面的其他高度动态的细胞过程。例如，通过静脉注射示踪分子并使用抗CD31抗体对.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸吖啶黄	Sigma Aldrich	A8251	1 mg/mL PBS 溶液
DeltaPhase 恒温垫	BrainTree	B-DP-PAD	-
Gemini 电凝系统	BrainTree	B-GEM-5917	-
氯胺酮	WDT	9089.01.00
LAS X	Leica	-	-
SP8 共聚焦显微镜	Leica	-	-
PBS	Biochrom	L182
罗丹明B葡聚糖	Invitrogen	D1824	分子量 10,000 kDa；2 mg/mL 溶液
标准镊子（Dumont SS）	Fine Science Tools	11203-23	-
直头精细剪刀	Fine Science Tools	14060-10	-
他莫昔芬	Sigma Aldrich	T5648	乙醇中 50 mg/mL 溶液
赛拉嗪	Bayer	1320422