建立一种用于 Clostridioides difficile 的幼年斑马鱼感染模型

摘要

本文介绍了一种通过显微注射和无创显微灌胃法感染荧光标记的厌氧C. difficile斑马鱼幼鱼的安全有效方法。

摘要

Clostridioides difficile 感染（CDI）被认为是美国最常见的医疗相关性胃肠道感染之一。尽管已有针对 C. difficile 的先天免疫反应的描述，但中性粒细胞和巨噬细胞在 CDI 中的具体作用仍不甚清楚。在本研究中，采用 Daanio rerio（斑马鱼）幼体建立 C. difficile 感染模型，以在活体条件下成像观察这些先天免疫细胞的行为及其协同作用。为监测 C. difficile，已建立一种使用荧光染料的标记方案。通过显微注射标记的 C. difficile 可实现局部感染，该菌在斑马鱼肠道内活跃生长，并模拟 CDI 中的肠道上皮损伤。然而，这种直接感染方案具有侵入性，会造成显微伤口，可能影响实验结果。因此，本文介绍了一种更为非侵入性的微量灌胃方案。该方法通过开口插入导管，将 C. difficile 细胞直接递送至斑马鱼幼体肠道内。这种感染方式更接近 C. difficile 的自然感染途径。

引言

C. difficile 是一种革兰氏阳性、可形成芽孢、厌氧且产毒素的杆菌，是引起胃肠道严重感染的主要原因¹。艰难梭菌感染（CDI）的典型症状包括腹泻、腹痛以及致命性的假膜性结肠炎，有时可导致死亡^1,2。已有证据表明，宿主免疫反应在该疾病的发展过程和最终结局中均起着关键作用³。除免疫反应外，肠道固有微生物群在CDI的发病机制中也至关重要⁴。在过去十年中，由于出现了一种高毒力的 C. difficile 菌株（BI/NAP1/027），CDI的病例数量和死亡率均显著上升^5,6。更深入地了解CDI过程中潜在的免疫机制以及微生物群的作用，将有助于推动新疗法的研发与进步，从而更好地控制这一流行病。

已开发出多种动物模型（如仓鼠和小鼠），以帮助深入了解针对C. difficile^7,8的免疫防御机制。然而，先天免疫细胞的作用仍知之甚少，尤其是因为目前关于先天免疫细胞行为的研究主要来源于组织学分析或体外培养细胞的实验。因此，建立一种透明的斑马鱼模型，以揭示活体脊椎动物体内对C. difficile的先天免疫应答，将有助于此类研究的开展。斑马鱼幼体具有功能性的先天免疫系统，但在受精后4–6周内缺乏适应性免疫系统⁹。这一独特特性使得斑马鱼幼体成为研究CDI中先天免疫细胞独立应答及其功能的优良模型。

本报告介绍了利用斑马鱼幼鱼研究相互作用的新方法 C. difficile 以及先天免疫细胞，例如巨噬细胞和中性粒细胞。首先，一种局部显微注射方案，包括 C. difficile 接种物制备与染色方法已展示。通过活体共聚焦时间序列成像，记录中性粒细胞和巨噬细胞向感染部位的迁移反应，并观察中性粒细胞和巨噬细胞对细菌的吞噬作用。然而，已有研究报道，注射操作本身可造成组织损伤，从而引发白细胞募集，该过程与细菌存在与否无关¹⁰因此，采用一种非侵入性微灌胃技术以递送 C. difficile 随后描述了向斑马鱼幼鱼肠道中接种的过程。先前的研究表明，内源性胃肠道微生物群可保护宿主，防止外源微生物的定植 C. difficile¹¹因此，也利用无菌斑马鱼幼虫来使感染的斑马鱼产生易感性 ¹²随后，进行肠道解剖以获取有活力的组织 C. difficile 并验证其在斑马鱼肠道中存留的时间。

方案

本文所述所有动物实验均依照相关法律法规进行（欧盟指令 2010/63，许可证号 AZ 325.1.53/56.1-TUBS 及许可证号 AZ 33.9-42502-04-14/1418）。

1. 低熔点琼脂糖、凝胶板及显微注射/显微灌胃针的制备

1. 将 0.08 g 低熔点琼脂糖（材料表，琼脂糖 A2576）溶解于 10 mL 30% Danieau's 培养基（含 0.12 mM MgSO₄、0.18 mM Ca[NO₃]₂、0.21 mM KCl、1.5 mM HEPES（pH = 7.2）和 17.4 mM NaCl）中，室温（RT）保存，配制成 0.8% 的溶液。
   注意：可使用更高或更低浓度的琼脂糖。然而，即使浓度相同，不同品牌的琼脂糖凝固所需时间也有所不同。
2. 使用玻璃毛细管（材料表）制备显微注射针和显微灌胃针。
   1. 使用微电极拉制仪，设置如下参数（注意：单位为本实验所用拉制仪特有；参见 材料表）：显微注射针（气压 = 500；加热 = 400；拉力 = 125；速度 = 75；时间 = 150）；显微灌胃针（气压 = 500；加热 = 400；拉力 = 100；速度 = 75；时间 = 150）。使用微加样吸头向拉制好的针尖中加入 3 µL 无核酸酶水（nuclease-free H₂O）。
   2. 将针插入注射仪并妥善固定。调整针的角度以适应注射操作。将显微注射针的注射压力设定在 600–900 hPa，显微灌胃针的注射压力设定在 200–300 hPa。
   3. 在校准载玻片的黑色圆圈上滴加一滴矿物油。使用精细镊子剪断针尖。向矿物油中注射一滴液体，以测量液滴大小。
   4. 对于显微注射，调节注射时间，使液滴直径达到 0.10–0.12 mm，相当于体积为 0.5–1.0 nL；对于显微灌胃，调节至液滴直径为 0.18–0.20 mm，相当于体积为 3–5 nL。
3. 使用塑料模具作为显微灌胃模具，在 10 cm 培养皿中用琼脂糖（材料表，8050）配制 1.5% 琼脂糖平板，培养基于 30% Danieau's 培养基。使用前于 4 °C 保存以防止干燥。实验前恢复至室温或 28 °C。

2. 用荧光染料制备并标记C. difficile及芽孢

1. 制备1 mM的荧光染料储备液（材料表）。由于染料以50 µg粉末分装出售，向瓶中加入69 µL DMSO，即可获得1 mM的储备液浓度。
2. 在离心管中加入2 µL 1 mM储备液和18 µL DMSO，配制100 µM的荧光染料工作液，并充分混匀。
3. 在厌氧操作台中，将2至3个菌落接种至10 mL BHIS液体培养基中，过夜静置培养C. difficile（R20291，一种027型核糖体分型菌株）。BHIS为添加了0.5%（w/v）酵母提取物和0.1%（w/v）L-半胱氨酸的BHI培养基。将1 g L-半胱氨酸溶于10 mL ddH₂O中，过滤除菌后加入已高压灭菌的培养基中，使其终浓度为1 g/L。平板制备时，在高压灭菌前向培养基中加入15 g/L琼脂粉。选择性培养C. difficile使用chromID C. difficile平板（材料表）。
4. 用荧光染料对C. difficile进行染色
   1. 在OD₆₀₀为1.0–1.2时收集C. difficile，用1 mL 1×PBS洗涤一次（5,000 × g，室温离心3分钟），然后重悬于1 mL 1×PBS中。
   2. 向1 mL细菌悬液中加入3 µL荧光染料工作液，在室温避光条件下孵育15分钟。用1 mL PBS洗涤染色后的C. difficile一次以去除残留染料，并重悬于1×PBS中，调节至OD₆₀₀为1.0（1.0 OD₆₀₀约相当于10⁸ cfu/mL）。

3. 将染色的 C. difficile 注入斑马鱼幼鱼

1. 在注射前约10分钟，用含有0.02%–0.04%三卡因（将三卡因粉末溶于双蒸水中，并用1 M Tris-HCl溶液调节pH至7）的30% Danieau's培养基对20–30条受精后5天（以下简称5 dpf）的斑马鱼幼鱼进行麻醉。将麻醉后的幼鱼转移至新的10 cm培养皿中，并去除多余的30% Danieau's培养基。
2. 在斑马鱼幼鱼上滴加一滴0.8%低熔点琼脂糖以覆盖幼鱼。轻轻调整幼鱼至侧卧位置。将培养皿置于冰上30–60秒，使低熔点琼脂糖凝固。随后加入含0.02%–0.04%三卡因的30% Danieau's培养基，淹没琼脂糖。
3. 准备注射液。在染色的C. difficile接种物中加入1 µL PBS中的0.5%酚红溶液，终体积为10 µL，以便观察注射过程。
4. 使用微量进样器将校准过的显微注射针头吸入注射液。将装有液体的针头安装到显微操作仪上，并置于体视显微镜下定位。
5. 调节注射压力至600–900 hPa，设定注射时间为0.1–0.3秒，以获得0.5–1.0 nL的注射体积。将针头在显微操作仪上以约45°角对准包埋的幼鱼。
6. 将针尖置于靠近泄殖腔孔的消化道上方。用针尖穿透琼脂糖及肌肉层，插入肠腔内，注射0.5–1.0 nL的C. difficile。使用荧光显微镜监测注射后的幼鱼，并挑选成功注射的个体用于共聚焦成像。

4. 无菌斑马鱼幼鱼的制备

1. 采用成熟的自然繁殖方法制备无菌斑马鱼胚胎，包括：体外受精、使用含抗生素的培养基（1 µg/mL 两性霉素B、10 µg/mL 卡那霉素和 20 µg/mL 氨苄青霉素）清洗、用0.1% wt/vol 聚乙烯吡咯烷酮-碘（PVP-I）溶液清洗，以及在细胞培养超净台中孵育胚胎¹²。
2. 在无菌条件下培养所有无菌斑马鱼幼鱼，直至受精后5天（5 dpf）或灌胃前即刻。灌胃后，将斑马鱼幼鱼转移至标准培养箱中，但使用无菌的30% Danieau's培养液。

5. 斑马鱼幼鱼的灌胃

1. 按照步骤1.2所述校准微量灌胃针。
2. 将微量矿物油滴加至校准载玻片上，并将针尖置于其上，测量针尖直径。确保针尖直径为30–40 µm，末端钝化且表面光滑。丢弃尖锐或粗糙的针头。
   注意：可通过快速火焰灼烧钝化针头的锋利边缘。
3. 按照步骤3.3所述配制灌胃溶液。
4. 按照步骤3.4所述将针头装填并固定到显微操作器上。调节显微操作器，使针头呈45°角定位。
5. 对步骤3.1中提及的斑马鱼幼鱼进行麻醉。当幼鱼停止活动后，使用巴斯德吸管将其转移至微量灌胃模具的凹槽中。
6. 在斑马鱼幼鱼上滴加一滴0.8%低熔点琼脂糖，使其完全覆盖。轻柔调整幼鱼位置，使其头部朝上并与凹槽呈45°角，尾部紧贴凹槽壁。确保各幼鱼头部角度大致相同，以便与灌胃针的角度对齐。将微量灌胃模具置于冰上30–60秒，使低熔点琼脂糖凝固，从而固定幼鱼位置。
7. 调节注射压力至200–300 hPa，设定注射时间为0.1–0.3秒，以实现3–5 nL的C. difficile注射体积。
8. 轻柔操作针头穿过琼脂糖，进入斑马鱼幼鱼口部，并沿食道推进。当针尖到达前肠膨大部时，踩下注射踏板释放细菌，使肠腔被注入的液体充分填充。注意避免液体从食道或泄殖腔溢出。注射完成后，轻柔地将针头从幼鱼口中撤出。
9. 灌胃结束后，使用柔性微加载吸头从琼脂糖中回收感染的斑马鱼幼鱼：先切割去除周围琼脂糖，再小心提起幼鱼。将幼鱼转移至无菌的30% Danieau's培养液中，用无菌培养液清洗两次。随后将幼鱼转移至新的10 cm培养皿中，在最多维持至11 dpf（受精后天数）期间进行培养。

6. 显微注射斑马鱼幼鱼的共聚焦显微镜分析

1. 将斑马鱼幼鱼麻醉，参见步骤3.1。在直径35 mm的培养皿底部打一个孔，并在孔上贴附一片盖玻片，此装置称为成像室。将胚胎转移至成像室底部，并加入适量的30% Danieau's培养基。
2. 加入200–300 μL的1%低熔点琼脂糖，以覆盖麻醉后的幼鱼。由于使用倒置共聚焦显微镜，应尽可能使幼鱼的感染区域紧贴盖玻片。
3. 将琼脂糖置于冰上固化30–60秒。用含有0.02%–0.04%三卡因的30% Danieau's溶液淹没琼脂糖。
4. 使用共聚焦激光扫描显微镜对幼鱼进行成像（材料表）。

7. 解剖幼年斑马鱼肠道以回收有活性的 C. difficile

1. 分离幼虫的胃肠道以分析细菌载量。首先使用 0.4% 三卡因对斑马鱼幼虫实施安乐死。
2. 用无菌 1× PBS 快速冲洗斑马鱼，并将其转移至新的琼脂糖平板上。
3. 斑马鱼解剖
   1. 将一根针插入斑马鱼幼体头部附近的背部躯干以固定斑马鱼，然后用采血针在鳃后方切除头部。
   2. 将第二根针插入背部躯干中部，第三根针插入斑马鱼腹部，并将肠道从体腔中拉出。
      注意：需格外小心以完整分离肠道。若操作困难，可进行额外牵拉，使剩余肠道与其他内脏器官完全分离。
   3. 使用显微注射针将 10–15 条肠道转移至含有 200 µL 无菌 1× PBS 的 1.5 mL 离心管中。
   4. 用研杵充分匀浆肠道组织以制备匀浆液。确保研杵触及管底，以彻底破坏所有肠道组织。
4. 在厌氧培养箱中，将匀浆液接种于含 D-环丝氨酸和头孢西丁的 C. difficile 培养基中，可选择性添加牛磺胆酸盐（TCA，C. difficile 孢子的萌发诱导剂）。
5. 将平板置于 37 °C 厌氧条件下培养 48 小时。
6. 使用细菌培养物进行 16S rRNA-PCR 检测。
   1. 将单个菌落重悬于 50 µL H₂O 中，在 95 °C 煮沸 15 分钟。离心（14,000 rpm，室温 2 分钟）收集裂解物沉淀，取 2 µL 上清液作为模板，加入 25 µL PCR 反应体系中，使用 C. difficile 特异性引物（Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3'）进行扩增。
   2. 若使用液体培养物中的细菌，取 1 mL 培养液，用 1 mL PBS 洗涤一次（14,000 rpm，室温 2 分钟）。将菌体沉淀重悬于 100 µL H₂O_dd 中，后续操作同上。为进一步鉴定细菌菌落，可划线接种于 BHIS 平板或 chromID 平板（材料表）。

   

结果

C. difficile 为严格厌氧菌，而荧光蛋白的发色团通常需要氧气才能成熟。为解决这一问题，使用荧光染料对处于活跃生长期的活 C. difficile 细胞（R20291，一种027型核糖体分型菌株；图1A）进行染色。利用Gal4/UAS系统，构建了稳定的转基因斑马鱼品系用于活体成像，其中mpeg1.1 或 lyZ 启动子以Gal4依赖的方式分别在巨噬细胞和中性粒细胞中驱动EGFP荧光蛋白的表达。

在受精后5天（5 dpf）时，将染色的 C. difficile 注入斑马鱼肠道内，并在感染后1小时对感染部位进行成像。延时成像显示，中性粒细胞和巨噬细胞均迁移至感染部位（图1B），且这两种先天免疫细胞的数量持续增加，直至 C. difficile 被完全清除。清除过程通过吞噬和消化标记的 <...

讨论

本文所述方法对现有技术进行了改进和拓展，通过注射和微量灌胃两种方式感染斑马鱼幼鱼^10,14。此外，该方法还展示了利用斑马鱼幼鱼研究厌氧病原体的策略²²。同时，该实验方案有助于在活体条件下分析艰难梭菌（C. difficile）感染（CDI）及在斑马鱼体内定植过程中先天免疫细胞的反应。该方法可重复性强，易于在常规实验室或临床环境中实施。

为了监测白细胞对C. difficile的吞噬作用，使用了两种稳定的转基因斑马鱼品系（例如Tg[mpeg1.1: KalTA4]^bz16）来可视化巨噬细胞（KalTA4：一种优化用于斑马鱼的Gal4变体），以及Tg(lyz: KalTA4)^bz17品系，在与携带Tg(4xUAS: EGFP)^hzm3转基因背景的鱼杂交后可可视化中性粒细胞。由于C...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A2576	超低胶凝琼脂
糖 琼脂糖低熔点 （LM）	Pronadisa	8050	用于琼脂糖板
BacLight Red 细菌染色	Thermo Fisher Scientific	B35001	荧光染料
Brain-Heart-Infusion 肉汤	Carl Roth GmbH	X916.1
黄铜（野生型）			缺乏黑色素合成，用于产生稳定的转基因细胞系
硝酸钙 （Ca（NO3）2）	Sigma-Aldrich	C1396
毛细管玻璃	哈佛仪器	30-0019	注射针
艰难梭菌			R20291，，核糖型 027 菌株，TcdA + / TcdB + / CDT + 生产
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
斐济	开源平台		图像处理
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
卧式拔针器	萨特仪器公司	P-87
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	168149
徕卡应用程序套件 X （LAS X）	徕卡		图像处理
硫酸镁 （MgSO4）	Carl Roth GmbH	P026
微量注射器	eppendorf	5253000017
微量注射模具	自适应科学工具	TU1
Leica SP8 共聚焦显微镜	Leica
酚红	Sigma-Aldrich	P0290
氯化钾 （KCl）	Carl Roth GmbH	5346
氯化钠 （NaCl）	Carl Roth GmbH	9265
牛磺胆酸盐	Carl Roth GmbH	8149
Tg（lyZ：KalTA4）bz17/Tg（4xUAS-E1b：EGFP）hzm3			稳定的转基因系，其中 lyZ 启动子驱动中性粒细胞
中 EGFP 荧光蛋白的表达Tg（mpeg1.1：KalTA4）bz16/Tg（4xUAS-E1b：EGFP）hzm3			稳定的转基因系，其中mpeg1.1驱动巨噬细胞中EGFP荧光蛋白的表达三卡
因	Sigma-Aldrich	E10521
提取物	BD Bacto	212750