本文介绍了一种通过显微注射和无创显微灌胃法感染荧光标记的厌氧C. difficile斑马鱼幼鱼的安全有效方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
Clostridioides difficile 感染（CDI）被认为是美国最常见的医疗相关性胃肠道感染之一。尽管已有针对 C. difficile 的先天免疫反应的描述，但中性粒细胞和巨噬细胞在 CDI 中的具体作用仍不甚清楚。在本研究中，采用 Daanio rerio（斑马鱼）幼体建立 C. difficile 感染模型，以在活体条件下成像观察这些先天免疫细胞的行为及其协同作用。为监测 C. difficile，已建立一种使用荧光染料的标记方案。通过显微注射标记的 C. difficile 可实现局部感染，该菌在斑马鱼肠道内活跃生长，并模拟 CDI 中的肠道上皮损伤。然而，这种直接感染方案具有侵入性，会造成显微伤口，可能影响实验结果。因此，本文介绍了一种更为非侵入性的微量灌胃方案。该方法通过开口插入导管，将 C. difficile 细胞直接递送至斑马鱼幼体肠道内。这种感染方式更接近 C. difficile 的自然感染途径。
引言
C. difficile 是一种革兰氏阳性、可形成芽孢、厌氧且产毒素的杆菌，是引起胃肠道严重感染的主要原因1。艰难梭菌感染（CDI）的典型症状包括腹泻、腹痛以及致命性的假膜性结肠炎，有时可导致死亡1,2。已有证据表明，宿主免疫反应在该疾病的发展过程和最终结局中均起着关键作用3。除免疫反应外，肠道固有微生物群在CDI的发病机制中也至关重要4。在过去十年中，由于出现了一种高毒力的 C. difficile 菌株（BI/NAP1/027），CDI的病例数量和死亡率均显著上升5,6。更深入地了解CDI过程中潜在的免疫机制以及微生物群的作用，将有助于推动新疗法的研发与进步，从而更好地控制这一流行病。
已开发出多种动物模型（如仓鼠和小鼠），以帮助深入了解针对C. difficile7,8的免疫防御机制。然而，先天免疫细胞的作用仍知之甚少，尤其是因....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本文所述所有动物实验均依照相关法律法规进行（欧盟指令 2010/63，许可证号 AZ 325.1.53/56.1-TUBS 及许可证号 AZ 33.9-42502-04-14/1418）。
1. 低熔点琼脂糖、凝胶板及显微注射/显微灌胃针的制备
- 将 0.08 g 低熔点琼脂糖（材料表，琼脂糖 A2576）溶解于 10 mL 30% Danieau's 培养基（含 0.12 mM MgSO4、0.18 mM Ca[NO3]2、0.21 mM KCl、1.5 mM HEPES（pH = 7.2）和 17.4 mM NaCl）中，室温（RT）保存，配制成 0.8% 的溶液。
注意：可使用更高或更低浓度的琼脂糖。然而，即使浓度相同，不同品牌的琼脂糖凝固所需时间也有所不同。 - 使用玻璃毛细管（材料表）制备显微注射针和显微灌胃针。
- 使用微电极拉制仪，设置如下参数（注意：单位为本实验所用拉制仪特有；参见 材料表）：显微注射针（气压 = 500；加热 = 400；拉力 = 125；速度 = 75；时间 = 150）；显微灌胃针（气压 = 500；加热 = 400；拉力 = 100；速度 = 75；时间 = 150）。使用微加样吸头向拉制好的针尖中加....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
C. difficile 为严格厌氧菌，但荧光蛋白的发色团通常需要氧气才能成熟。为解决这一问题，使用荧光染料对处于活跃生长状态的 C. difficile 活细胞（R20291，一种027型核糖体分型菌株；图1A）进行染色。利用Gal4/UAS系统，构建了稳定的转基因斑马鱼品系用于活体成像，其中 mpeg1.1 或 lyZ 启动子以Gal4依赖的方式分别驱动巨噬细胞和中性粒细胞表达EGFP荧光蛋白。
将染色的C. difficile注入5 dpf的斑马鱼肠道中，孵育1小时后对感染部位进行成像。延时成像显示，中性粒细胞和巨噬细胞均到达了感染部位（图1B），且这两种先天免疫细胞的数量持续增加，直至C. difficile被清除。清除过程通过吞噬和消化标记的C. difficile
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述方法对现有技术进行了改进和拓展，通过注射和微量灌胃两种方式感染斑马鱼幼鱼10,14。此外，该方法还展示了利用斑马鱼幼鱼研究厌氧病原体的策略22。同时，该实验方案有助于在活体条件下分析艰难梭菌（C. difficile）感染（CDI）及在斑马鱼体内定植过程中先天免疫细胞的反应。该方法可重复性强，易于在常规实验室或临床环境中实施。
为了监测白细胞对C. difficile的吞噬作用，使用了两种稳定的转基因斑马鱼品系（例如Tg[mpeg1.1: KalTA4]bz16）来可视化巨噬细胞（KalTA4：一种优化用于斑马鱼的Gal4变体），以及Tg(lyz: KalTA4)bz17品系，在与携带Tg(4xUAS: EGFP)hzm3转基因背景的鱼杂交后可可视化中性粒细胞。由于C.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢蒂莫·弗里茨施（Timo Fritsch）在动物护理方面提供的出色支持。感谢科斯特尔（Köster）实验室和施泰因特（Steinert）实验室的成员给予的支持和有益的讨论。感谢韩丹丹博士对稿件的审阅。我们感激下萨克森州政府通过下萨克森预先资助项目（Niedersächsisches Vorab，项目编号VWZN2889）提供的经费支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A2576 | 超低凝胶点琼脂糖 |
| 低熔点琼脂糖 | Pronadisa | 8050 | 它被用于琼脂糖平板 |
| BacLight 红色细菌染料 | 赛默飞世尔科技 | B35001 | 荧光染料 |
| 脑心浸液肉汤 | 卡尔罗特有限责任公司 | X916.1 | |
| Brass（野生型） | 黑色素合成缺陷，用于生成稳定的转基因品系 | ||
| 硝酸钙（Ca(NO3)2） | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| 毛细玻璃管 | 哈佛仪器公司 | 30-0019 | 注射针头 |
| 艰难梭菌 | R20291，一种027型核糖体分型菌株，产TcdA+/TcdB+/CDT+ | ||
| DMSO | 卡尔罗斯特有限公司 | A994 | |
| FIJI | 开源平台 | 图像处理 | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| 水平针头拉制器 | Sutter Instrument Inc | P-87 | |
| L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | 图像处理 | |
| 硫酸镁（MgSO4） | Carl Roth GmbH | P026 | |
| 显微注射器 | eppendorf | 5253000017 | |
| 显微注射模具 | 自适应科学工具 | TU1 | |
| Leica SP8 共聚焦显微镜 | Leica | ||
| 酚红 | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| 氯化钾（KCl） | 卡尔罗特有限责任公司 | 5346 | |
| 氯化钠（NaCl） | 卡尔罗特有限公司 | 9265 | |
| 牛磺胆酸 | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | 稳定转基因品系，其中lyZ启动子驱动中性粒细胞中EGFP荧光蛋白的表达 | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | 稳定转基因品系，其中mpeg1.1驱动巨噬细胞中EGFP荧光蛋白的表达 | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 酵母提取物 | BD Bacto | 212750 |
参考文献
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
