在三维（3D）多色荧光显微图像中校正色差位移对于定量数据分析至关重要。本实验方案旨在通过获取合适的参考图像，并利用开源软件Chromagnon进行处理，以测量和校正生物样品中的色差位移。
本文内容
摘要
摘要
定量多色荧光显微镜技术依赖于在不同波长下获取的颜色通道之间精确的空间匹配。由于色差以及相机对准不完美，各通道所获取的图像可能在三个维度中的任意维度上发生位移、放大或旋转。传统的校准方法通过附着在盖玻片表面的多色微球来测量色差位移，已有多种软件可用于从此类校准样品中测量色差位移。然而，色差可能随成像深度变化，受观测条件影响，并可能由生物样本本身引起，从而阻碍对目标样本及整个成像体积中真实色差位移量的准确确定。在超分辨率显微镜中，更高精度的色差校正尤为重要，因为即使微小的色差也可能影响定量分析并改变对多色图像的解读。我们开发了一款开源软件Chromagnon及配套方法，用于测量和校正生物样本中的三维色差位移。本文提供了一个详细的应用方案，包括针对样本制备、数据采集和软件处理的特殊要求，以在目标生物样本中准确测量色差位移。
引言
多色成像在生物荧光显微镜中是一个基本方面，尤其当不同分子或结构之间的空间关系是研究重点时。色差是一种由色散引起的多色光光学像差，会改变所关注的彩色物体的表观位置。类似地，配备多个相机分别采集各颜色通道的显微镜，由于光学元件的差异以及各通道之间未完全对齐，会产生更复杂的色差位移。因此，除非用户明确进行校正，此类色差位移可能导致错误结论。尽管在显微镜分辨率受限于经典分辨率极限的情况下，色差问题并不显著，但近年来超分辨率显微技术1的发展，促使人们需要对色差位移进行更精确的校正。
使用多色微珠校准载玻片来测量显微镜系统的色差位移是一种常见的做法2。基于微珠的校准方法适用于测量显微镜整个光学系统相对于盖玻片表面的色差位移2。然而，该方法无法测量感兴趣生物样本中的色差位移。需要注意的是，许多生物样本具有三维（3D）结构，其色差位移与盖玻片表面处的色差位移不同。此外，色差位移会随成像条件的变化而变化2,3。我们曾对三维生物样本中的色差位移进行测量，发现采用传统的多色微珠校准方法时，色差位移的不确定性通常可达350 nm3。因此，有必要在感兴趣的成像深度和实际使用的成像条件下，直接在生物样本中测量色差位移。
此处，我们介绍测量生物样品中色位移并使用我们的软件校正这些位移的方法。 Chromagnon3为了测量生物样本中的色度偏移，本方法使用两类数据集，一种 "目标" 图像和一个 "参考文献" 图像。该 "目标" 图像是感兴趣的多色图像，例如染色显示DNA、核膜和微管的图像。通常无法在此类图像中测量色差偏移，因此我们需要一个 "参考文献" 专门用于测量样品中色度偏移的图像。唯一的定义是一个 "参考文献" 图像是同一物体的多色图像。从这个意义上说，多色微球图像也是一种参考图像。本文描述了三种用于测量生物样品中色差的参考图像类型： "串扰参考图像", "明场参考图像" 和 "生物校准参考图像"参考图像的类型取决于所使用的显微镜类型或所需的校正精度，如表中所示。 表1.
| 串扰 | 明场 | 生物学校准（在另一张载玻片上） | 生物学校准（在同一张载玻片上） | |
| 准确性a | +++ | + | ++b | +++ |
| 简便性 | ++ | +++ | ++ | ++ |
| 适用的显微镜类型 | 宽场 | 宽场 | 所有类型 | 所有类型 |
| 局部校准的可用性 | + | + | -c | -c |
| a：加号"+"的数量表示评分递增。单个加号对应约50 nm，三个加号对应约15 nm（三维条件下）。 b：准确性取决于成像条件变化的恒定程度。 c：可通过多种荧光微珠样品测量局部校准，方法如方案第4节所述。 | ||||
表1：选择参考图像类型时的参数。
"串扰参考图像" 具有最高的校正精度，且实现相对简单3,4（表1）。其缺点是由于无法测量激发光路中的色差位移，因此在显微镜应用中受到限制。此外，要获得此类图像，显微镜必须配备多波段二向色镜以及可独立于激发滤光片或光源进行控制的发射滤光片。适用的显微镜技术包括传统的宽场显微镜、单分子定位显微镜（SMLM），例如光激活定位显微镜/随机光学重建显微镜（PALM/STORM）5,6，以及通过宽场显微镜观察的扩展显微镜7。串扰参考图像是从目标样本本身获取的，即一种荧光染料在所有所需通道中产生的串扰（渗漏）荧光图像。荧光发射总是向更长波长方向扩展，因此需激发发射波长最短的染料，以在较长波长的通道中获得串扰荧光。例如，当样本被蓝色、绿色和红色染色时，仅激发蓝色染料，并在蓝色、绿色和红色通道中采集发射光信号。在本方案中，使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色的DNA来获取串扰荧光。
"明场参考图像" 是一种比 "串扰参考图像" 更简便且光毒性更低的替代方法，但其准确性最低3（表 1）。这些图像是目标样本的明场图像，通过采集目标图像所用的所有颜色通道获得。
"生物标定参考图像"的优势在于其适用于任何类型的显微镜，因为它能够测量激发和发射光路中的色差3,8（表1）。适用的显微镜包括宽场显微镜、共聚焦显微镜、光片显微镜、受激辐射损耗显微镜（STED）9、结构光照明显微镜（SIM）10、Airyscan/SORA11,12、在全内反射荧光（TIRF）模式下观测的单分子定位显微镜（SMLM）、奥林巴斯超分辨显微镜（OSR）13等。生物标定参考图像是从与目标样本制备方式相似的标定样本中获取的，但需对同一结构使用多种荧光染料进行染色。该方法的校正精度优于大多数超分辨显微镜的分辨率，且制备生物标定样本相对简单。另一个优势是可以对"多个参考图像进行平均"。因此，即使单个图像中包含的色差测量信息较少，通过多幅图像平均仍可提高信息含量。校正精度取决于成像条件保持恒定的程度。在这方面，当目标样本与参考样本位于同一载玻片上时性能最佳，例如使用8孔腔室盖玻片（表1，最右侧）。在本实验方案中，使用三种颜色的鬼笔环肽对肌动蛋白进行染色作为生物标定参考。
获得参考图像后，可使用我们的软件 Chromagnon 测量并校正色位移。Chromagnon 对可测量和校正色位移的通道数、Z 轴层数和时间帧数没有限制。Chromagnon 通过两个步骤测量色位移。第一步获取 X、Y、Z 轴方向的平移、X、Y、Z 轴方向的放大倍数以及绕 Z 轴旋转的"全局"或"仿射"配准参数。全局配准的计算精度在三维（3D）中约为 16 nm，在二维（2D）中约为 8 nm。第二步是在投影图像上进行可选的二维迭代"局部配准"，以获得更高的精度。在局部配准过程中，图像被划分为多个区域，并测量这些局部区域内的色位移。随后，区域被进一步细分，并迭代测量子区域中的色位移，直到区域内的像素数量达到最小像素数（通常为 60 × 60 像素）。生成的局部配准图与全局配准参数结合，并通过弹性变换应用于目标图像。完成此步骤后，计算精度提升至三维（3D）约 14 nm，二维（2D）约 6 nm。由于参考图像中的生物结构与目标图像中的生物结构不同，局部配准不适用于生物校准参考图像（表 1）。因此，对于生物校准参考图像，仅使用全局配准。
局部色差来源于两个方面：显微镜仪器的局部畸变和生物结构的不均一性。由于显微镜仪器的局部畸变是恒定的，因此可以通过多色微球参考样品进行测量，并作为固定参数予以校正。Chromagnon 可以整合显微镜仪器的局部畸变图和来自生物标定的全局对齐参数（表1）。采用该方法，预计生物标定的平均精度可进一步提高1−2 nm。
本文介绍了一种利用我们开发的软件Chromagnon对三维荧光图像中的色差位移进行校正的实验方案，涵盖从最基础到最高精度的各个级别。我们以HeLa细胞的免疫荧光染色为例，采用三维宽场显微镜和三维结构光照明显微镜（3D-SIM）进行观察。在第一部分中，我们描述了如何制备目标样本和生物学校准样本；该部分方案应根据具体研究目标进行优化。在第二部分中，我们介绍了通过显微镜获取三类参考图像的采集方法。默认获取蓝色、绿色和红色通道的图像，但具体通道组合应根据研究目标及显微镜配置进行调整。显微镜配备单个相机或多个相机均不影响本方法的适用性。在第三部分中，我们说明了如何利用本软件，结合参考图像对目标图像的色差位移进行测量与校正。最后，在第四部分中，我们介绍了一种利用显微镜仪器自身的局部校准功能来补充生物学校准参考图像的方法。
方案
1. 样品制备
- 靶样本的制备
- 在35 mm玻璃底培养皿中接种2.5 × 105个HeLa细胞，并在37 °C、5% CO2条件下，加入2 mL生长培养基（含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM培养基，补充10%胎牛血清[FBS]）进行培养。或者，在8孔腔室盖玻片上接种6 × 104个HeLa细胞，并在37 °C、5% CO2条件下，加入0.5 mL生长培养基进行培养。高分辨率显微镜观察请使用#1.5盖玻片（厚度为0.170 mm）。
注意：除步骤1.1.5、1.1.6、1.1.8、1.1.11和1.2.5（无论容器类型如何，体积均为100 µL）外，后续步骤均使用1/4体积。 - 培养约24小时后，弃去原液，加入2 mL含3.7%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻混匀后，在室温（RT）下于旋转平台上固定细胞15分钟。
警告：操作应在通风橱中进行。 - 在旋转平台上用2 mL PBS洗涤细胞，每次5−10分钟，重复3次。
注意：请遵循当地规定处理含甲醛废液。 - 在旋转平台上用含0.1% Triton X-100的PBS溶液2 mL对细胞进行透化处理5分钟，随后在旋转平台上用2 mL PBS洗涤3次，每次5−10分钟。
- 在旋转平台上用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液100 µL于室温孵育细胞1小时。
- 弃去溶液，加入100 µL一抗混合液（抗emerin多克隆抗体14和抗tubulin单克隆抗体15），用含1% BSA的PBS按适当稀释比例稀释（抗emerin抗体1/500，抗tubulin抗体1/100），4 °C孵育过夜。
- 在旋转平台上用2 mL PBS洗涤细胞，每次10分钟，重复3−5次。
- 弃去溶液，加入100 µL二抗混合液（Alexa Fluor 488标记的抗兔IgG和Alexa Fluor 555标记的抗小鼠IgG），用含1% BSA的PBS按1/500稀释，室温孵育3−4小时。
- 在旋转平台上用2 mL PBS洗涤细胞，每次5分钟，重复3−4次。
- 弃去溶液，加入约2 mL含0.5 µg/mL DAPI的PBS溶液，在旋转平台上室温染色30分钟。
注意：可使用相同浓度的Hoechst 33342替代DAPI进行染色。 - 弃去溶液，加入约100 µL封片剂（材料表）。
- 在35 mm玻璃底培养皿中接种2.5 × 105个HeLa细胞，并在37 °C、5% CO2条件下，加入2 mL生长培养基（含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM培养基，补充10%胎牛血清[FBS]）进行培养。或者，在8孔腔室盖玻片上接种6 × 104个HeLa细胞，并在37 °C、5% CO2条件下，加入0.5 mL生长培养基进行培养。高分辨率显微镜观察请使用#1.5盖玻片（厚度为0.170 mm）。
- 生物学校准样本的制备
- 按照步骤1.1.1−1.1.4所述方法制备固定细胞。
注意：建议使用腔室盖玻片，以便将靶样本和参考样本分别置于同一盖玻片的不同腔室内（表1，最右侧）。当实验需要最高校正精度时，推荐采用此方法。若需在普通盖玻片上制备样本，应选用厚度变异小的精密盖玻片（“No. 1.5H”），以确保实验可重复性。 - 将荧光染料标记的鬼笔环肽储备液溶于1.5 mL甲醇中，于-20 °C保存。将鬼笔环肽储备液按以下比例用PBS稀释：Alexa Fluor 405标记的鬼笔环肽1/100，Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽1/1,000，Alexa Fluor 594标记的鬼笔环肽1/200。
- 弃去溶液，加入1 mL步骤1.2.2中配制的鬼笔环肽混合液，在旋转平台上室温孵育30分钟。
- 在旋转平台上用2 mL PBS洗涤细胞，每次10分钟，重复3−5次。
- 弃去溶液，加入约100 µL封片剂。
注意：校准样本可在4 °C或-20 °C保存，以便重复使用。
- 按照步骤1.1.1−1.1.4所述方法制备固定细胞。
2. 参考图像的获取
- 串扰参考图像
- 将步骤1.1中制备的待测样本放置于宽场显微镜上。
- 在蓝色、绿色和红色通道中获取待测样本的荧光图像。
注意：对于三维图像，参考图像的Z轴步进尺寸可以与目标图像不同，只要图像文件包含步进尺寸的信息即可。参考图像和目标图像的Z轴步进尺寸最好小于Z轴光学分辨率的一半，该分辨率在衍射极限显微镜下由
计算得出，其中λ为波长（单位：纳米），NA为目标物镜的数值孔径。例如，若轴向分辨率为550 nm，则应使用小于275 nm的Z轴步进。参考图像无需时间序列采集。 - 随后，为获取参考图像的荧光信号，仅选择DAPI的激发光源，并在蓝色、绿色和红色通道中进行成像。在与待测图像完全相同的载物台位置和Z轴高度下采集参考图像，若为三维图像堆栈，也需保持一致。
注意：对于更长的发射波长，需要增加照明强度和曝光时间。
- 明场参考图像
- 将步骤1.1中制备的待测样本放置于宽场显微镜上。
- 在蓝色、绿色和红色通道中获取待测样本的荧光图像。
注意：Z轴步进尺寸最好满足步骤2.1.2中所述的奈奎斯特准则。 - 在与步骤2.2.2完全相同的载物台位置以及（若为三维堆栈）相同的Z轴高度下，采集待测样本在蓝色、绿色和红色通道中的明场图像。
- 生物学校准参考图像
- 将步骤1.1中制备的待测样本放置于3D-SIM显微镜上。
- 通过3D-SIM在蓝色、绿色和红色通道中采集待测样本的荧光图像，并重建超分辨图像。
注意：显微镜类型可以是任意类型，如3D-SIM、共聚焦、STED等。Z轴步进尺寸最好满足步骤2.1.2中所述的奈奎斯特准则。 - 通过3D-SIM在与待测图像（步骤2.3.2）相似的不同载物台位置，对步骤1.2中制备的参考样本采集多个荧光图像，并重建超分辨图像。
注意：所有参考图像在XY方向上的总像素数必须相同。Z轴步进尺寸在所有参考图像中必须一致。Z轴切片总数最好与目标图像相同，但并非绝对要求。这些参考图像在载物台上的XY位置无关紧要，因为其位置或盖玻片本身已与待测样本位置不同，且单个盖玻片上的色差位移小于15 nm3。成像条件（包括物镜、观测温度、浸油、共聚焦显微镜中的针孔尺寸以及高倾角照明显微镜中的倾斜角度16）均应与目标图像保持一致，以获得最佳校正效果。若显微镜配备多个相机以同时采集多通道信号，建议每周至少采集一次参考图像，以校正仪器漂移。
3. 使用 Chromagnon 软件校正色差位移
- 使用网页浏览器访问 https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releases，下载最新版本的 Chromagnon 二进制发行包。
注意：Windows、Mac 以及部分 Linux 版本均提供相应的二进制发行包。 - 解压程序，并将可执行文件放置于方便访问的位置。在 Windows 或 Mac 系统上双击该文件以启动程序；在 Linux 系统上则可通过命令行执行该二进制文件。
注意：程序启动后将打开如 图1 所示的图形用户界面。由于安全限制，首次双击时程序可能无法打开。此时，请使用与平台相关的特定方法来运行从互联网下载的该程序。
图 1：Chromagnon 图形用户界面的截图。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 将参考文件拖放到“参考框”中（图1），或单击参考文件（图1A）以打开文件选择对话框。根据文件格式，如果程序提示安装 Java 开发工具包（JDK），请按是，用户将被引导至下载页面。请按照说明为操作系统下载并安装 JDK。Chromagnon 在重启程序后应能够读取图像文件格式。
注意：Chromagnon 可读取大多数图像文件格式（多页“tif”、“czi”、“nd2”、“oib”、“lif”、“dv”等）。此步骤建议使用原始显微镜图像格式，因为在将图像格式转换为多页 tif 文件时可能会丢失元数据。如果通道名称显示为 0、1、2 等，而非 528、609 等波长值（图2A，绿色框），则 Chromagnon 无法识别图像中通道的身份。在此情况下，请确保参考文件中的通道顺序和像素大小与目标文件一致。例如，若参考文件中的通道顺序为绿色和红色，则目标文件中的通道顺序也必须为绿色和红色，而不能是红色和绿色。
图2：加载多个文件的示例截图。（A）所有参考图像均有对应目标图像的情况。本示例所用图像文件中的通道名称已通过波长（由绿色框标示）正确识别。（B）使用单个参考图像校正多个目标图像的情况。（C）多个参考图像（由红色框标示）被取平均值，平均后得到的参考图像用于校正多个目标图像的情况。请点击此处查看此图的放大版本。
- 将目标文件拖放到“目标框”中（图1），或单击目标文件（图1B）以打开文件选择对话框。
注意：如果存在多个目标图像，且每个目标图像都有对应的参考图像，则对应的参考图像和目标图像必须分别位于参考框和目标框中的同一行（图2A）。单个参考图像也可用于对齐多个目标图像（图2B）。 - 如果未选中，请勾选裁剪边距复选框（图1C）。
注意：如果勾选此复选框，则会裁剪由对齐产生的边距。一般情况下建议启用此选项；但如果需要在对齐前后进行像素级图像比较，则应取消勾选。 - 从下拉列表中选择输出图像格式（图1D）。
注意：可用格式包括 'tif'（ImageJ17 格式）、'dv' 和 'ome.tif'；其中 'ome.tif' 格式需安装 JDK 后方可使用。 - 指定输出文件名的后缀（图1E，默认值为 '_ALN'），该后缀将添加至目标文件名之后。
- 对于具有高信噪比的串扰参考图像，请从局部对齐的下拉列表中选择局部对齐模式（图1F），选择投影以启用局部对齐，选择无则禁用该功能。建议最小窗口尺寸不小于60（图1G）。
注意：使用局部对齐时，所有目标图像必须具有对应的参考图像（图2A）。由于不同样本之间的局部色差偏移存在差异，因此不建议将局部对齐用于生物校准参考图像（表1）。出于相同原因，单个局部对齐参数不能应用于多个目标图像（图2B）。例外情况是，当待测样本仅位于盖玻片表面，且视场中充满明亮物体时（如多色荧光微球样本），可使用该方法。 - 对于多个生物校准参考图像，请勾选平均参考图像选项（图1H），以从平均后的参考图像中计算单一的对齐参数，并将该参数应用于所有目标图像（图2C）。此时应在局部对齐中选择无（图1F）。
- 单击运行全部（图1I）开始测量；对齐参数将被应用到目标图像上。
注意：程序在从参考文件中测量出色差偏移后，会生成扩展名为 "chromagnon.csv" 或 "chromagnon.tif" 的文件。输出文件类型取决于是否启用了局部对齐（图1F）。若未启用局部对齐，则输出为 "chromagnon.csv"；若启用了局部对齐，则输出为 "chromagnon.tif"。文件名与参考文件相同，仅附加指定的后缀（图1J，默认无后缀）以及扩展名（"chromagnon.csv" 或 "chromagnon.tif"）。对齐过程的详细描述可参见在同一文件夹中生成的 "Chromagnon.log" 文件。 - 等待校正后的图像在查看器中显示（图3）。
注意：使用鼠标拖动可移动图像，滚动鼠标滚轮可调整缩放比例。移动滑块（图3A）可切换显示的 Z 层（及适用时的 T 时间点）。如果查看器刷新图像过慢，可单击将全部数据加载到内存按钮（图3B），以避免程序频繁访问硬盘数据。拖动颜色框的左侧或右侧边缘（图3C）可调节显示的最小值或最大值。单击各通道对应的按钮（图3D）可在查看器中切换该通道的显示或隐藏状态。右键单击颜色框（图3D）可让用户选择显示颜色、更改色标显示选项，并可通过选择“缩放至…”来精确设定显示缩放的最小值和最大值。单击正交视图按钮（图3E）可显示 ZY 和 XZ 方向的图像。移动十字线可改变侧视图中显示的位置。
图3：图像查看器的截图。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 为检查测量是否正确执行，将参考图像拖放到“参考框”和“目标框”中。运行程序，检查图像是否完全重叠。
注意：若有可用的“chromagnon.csv”或“chromagnon.tif”文件，可将其用作参考，以跳过测量步骤。若图像中的色位移仍未校正，请尝试参考下述总结的解决方案 表2. - 要访问样本中的对齐参数，或需要手动编辑对齐参数时，可使用任意文本编辑器或电子表格软件直接打开“chromagnon.csv”文件。编辑完成后，请将其保存为“csv”格式。
注意：“tz”、“ty”、“tx”的单位为像素，“r”的单位为度，“mz”、“my”、“mx”的单位为放大倍数。- 或者，将“chromagnon.csv”或“chromagnon.tif”文件导入 Chromagnon参考或目标框（图1），然后双击以打开比对编辑器（图4).
- 要查看参数编辑后通道的偏移程度，可将参考图像文件拖放到底部区域（图4A）在编辑器中打开图像。编辑表格中的数值后（图4B）并点击 回车/换行 关键，观察相应通道的图像在数值变化时如何移动。编辑完成后，单击 另存为… (图4C) 以保存更改。
图 4：对齐参数编辑器的截图。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 为查看局部对齐图，通过 Chromagnon 的参考图像或目标图像框加载“chromagnon.tif”文件（图1），然后双击该文件以打开对齐编辑器（图4）。单击查看（图4D）以查看由线条表示的局部位移，线条长度按放大倍数下拉菜单中指定的倍数进行放大显示（图4E）。
注意：通过指定“原始图像文件”（图4F），可将位移信息与原始图像一同映射显示。
4. 生成显微镜特异性的局部比对图
- 将2 µL直径为200 nm的多色荧光微球加入18 µL乙醇中稀释。
- 涡旋混匀溶液，并取10 µL微球溶液置于玻璃底培养皿中心。确保使用#1.5盖玻片（厚度为0.170 mm），以适用于高分辨率显微成像。
- 将培养皿在室温下静置1小时，使其完全干燥。
- 将培养皿放置于待校准的显微镜载物台上，聚焦于荧光微球。
- 使用待校准的显微镜获取二维或三维图像，并通过改变载物台位置获取多幅图像。
- 打开Chromagnon图形用户界面。
- 将微球图像文件拖放到“参考框”（图1）中，或点击参考文件（图1A）以打开文件选择对话框。
- 勾选平均参考图像选项（图1H）。在局部对齐下拉菜单中（图1F），选择投影。设置最小窗口尺寸为60（图1G）。点击运行全部（图1I）以开始测量。
注意：系统将生成一个“.chromagnon.tif”文件，用于存储显微镜的局部对齐图。 - 测量完成后，点击附加参数（图1K）。在显微镜仪器的局部畸变选项框中，点击下拉菜单并选择新建…以打开对话框。将步骤4.8生成的“chromagnon.tif”文件拖放到文件名输入框中，或点击选择文件按钮打开文件选择对话框。输入显微镜名称后点击确定。
- 当从串色或生物样本校准参考图像中测量色差位移时，点击附加参数（图1K）。在显微镜仪器的局部畸变选项框中，选择步骤4.9中指定的显微镜名称，然后点击确定。
注意：“显微镜仪器的局部畸变”选项在程序关闭后不会被保存。 - 按照第3节所述方法进行无需局部对齐的色差校正。
注意：也可在显微镜校准的基础上额外使用局部对齐。在此情况下，局部对齐将以显微镜校准结果为起点开始。
结果
使用串扰参考图像进行色差校正的示例如图5所示。该图像通过配备单个相机的宽场显微镜获得。利用DAPI的荧光发射作为参考（图5A,B），对蓝色、绿色和红色通道进行校正。图像包含60个Z切片的3个通道，每个切片由256 × 256像素组成。在测量色差之前，图像已进行去卷积处理。在配备Intel Core i7（四核八线程，2.7 GHz）、16 GB内存和1 TB闪存存储的Mac计算机上，使用Chromagnon测量局部色差耗时51秒。将所得的配准参数应用于目标图像（图5C,D），该目标图像与参考图像具有完全相同的体素数量。生成配准后文件耗时3秒。由于在配准过程中裁剪了边缘像素（图1C中的crop margins复选框），配准后的体素数量有所减少（图5B，51个Z切片，252 × 251像素）。在配准前，后期桥（anaphase bridge）中的DNA（由箭头指示）错误地位于核膜外侧（图5C，在显示XZ视图的下层面板中尤为明显）；而在配准后，DNA正确地位于核膜内侧（图5D），符合预期。
使用生物标定参考图像进行色差校正的示例如图6所示。图像通过配备三个相机的SIM显微镜获得。对用与蓝色、绿色和红色染料偶联的鬼笔环肽染色的HeLa细胞的三幅图像进行了平均处理（图6A）。参考图像包含76个Z切片的3个通道，每个切片由1,024 × 1,024像素组成。在上述Mac系统上，使用Chromagnon软件在未进行局部对齐的情况下测量色差耗时194秒。该参数被应用于一个包含73个Z切片的3通道目标图像，每个切片由1,024 × 1,024像素组成。生成对齐后的文件耗时25秒。XZ视图显示通道在Z方向上存在明显位置偏差，在X方向上也有轻微偏差（图6A,C），但对齐后这些错位得到了校正（图6B,D）。
图 5：使用串扰参考图像进行校准的示例。 HeLa 细胞用 DAPI 染色标记 DNA（显示为品红色），用 Alexa Fluor 488（显示为黄色）标记核膜，用 Alexa Fluor 555（显示为蓝色）标记微管。图像通过单台相机的三维宽场显微镜采集，并进行去卷积处理。(A,B) 使用 DAPI 发射光获得的代表性串扰参考图像，在使用 Chromagnon 进行校准前后的对比。三个颜色通道以叠加方式显示。(C,D) 三维图像堆栈在三个通道中校准前后的光学切片。箭头所示的后期桥接结构处的轴向色差明显可见。A 图中的比例尺表示所有图中均为 5 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：使用生物校准参考图像进行对齐的示例 图像通过配备三台相机的三维结构光照明显微镜（3D-SIM）采集。（A,B）对齐前（A）和对齐后（B）三幅图像平均得到的参考图像。HeLa细胞用与Alexa Fluor 405、488或594偶联的鬼笔环肽染色。（C,D）目标图像在对齐前（C）和对齐后（D）的结果。HeLa细胞用DAPI染色DNA（显示为品红色），Alexa Fluor 488染色核膜（显示为黄色），Alexa Fluor 594染色微管（显示为蓝色）。A图中的比例尺表示所有图中均为5 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
色差校正的过程需要在准确性和操作复杂性之间进行权衡。为了节省不必要的工作量，最好事先明确您的研究需要达到的准确程度。对于常规的宽场（活体）成像，通常不需要最高的准确性，因此使用明场参考图像往往足以校正色差位移。同样，当成像条件和环境保持恒定时，重复使用生物标定参考图像可以节省时间。另一方面，如果需要实现高精度的图像配准，则必须使用高质量的串扰或生物标定参考图像。为了获得最佳校正效果，参考图像应尽可能在与目标图像相同条件下、同时获取。只要参考图像和目标图像均通过同一显微镜系统获取，更高的空间分辨率将有助于提高校正的准确性。如果参考图像和目标图像均可进行去卷积处理，则在校正前实施去卷积可能进一步提升校正精度。此外，为了实现最佳性能，参考图像和目标图像文件均应满足光学（Z）轴的采样定理，以实现精确的亚像素插值（方案步骤 2.1.3）。
未能校正色差位移会导致错误的结论。此外，使用错误的校准方法甚至可能加剧色差位移而非纠正它，因此必须避免这种情况。我们已在表2中总结了可能的失败原因及其常见解决方案。要检查失败原因，首先需要直观地确认参考图像中的色差位移是否已精确校正（实验方案步骤3.12）。大多数失败是由于参考图像质量不佳所致，根据表2中的说明通常可轻松解决。关于参考图像的质量，需要注意的是，如果整个视场未被样本填满，则全局配准的准确性会下降（图7，表2）。与图7A所示的良好示例相比，图7B所示的不良示例仅在左上区域包含三个核膜，导致Chromagnon未能成功配准该图像的一部分。这是因为Chromagnon的全局配准方法将视场划分为四个区域（图7C），以高精度测量旋转和放大倍率的差异3。该方法若正确操作，其精度比其他线性方法（如对数极坐标变换和单纯形法）高出一个数量级3。如果四个区域中任一区域缺乏足够特征，则Chromagnon将切换至效果较差的线性方法。因此，为获得最佳性能，应避免出现图7B和图7C所示的情况，四个区域均应被足够多的结构填充。用户可通过查看日志文件（“Chromagnon.log”；见实验方案步骤3.10）来检查视场中是否存在无法用于测量的二次区域。幸运的是，通过平均多个生物学校准图像，或对串扰或明场参考图像使用局部配准，可轻松克服此问题（表2）。与参考图像校正失败的情况不同，目标图像校正失败更难识别。此类失败通常源于参考图像与目标图像之间在文件格式、成像条件、成像时间、成像/配准方法上的差异（表2），因此用户在使用与目标图像成像条件或时间不同的参考图像时应格外谨慎。部分示例图像可用于测试（https://github.com/macronucleus/Chromagnon），以帮助理解良好与不良示例图像的具体区别。
| 问题 | 原因 | 解决方案 |
| 未能校正参考图像 | 对比度低 | 尽可能获取对比度更高的图像。如果使用明场参考图像，可尝试在水基溶液中重新成像，以获得更高的细胞对比度。或者尝试应用计算去噪方法（例如高斯滤波）。关闭局部对齐功能，因其对噪声更为敏感。 |
| 无关图像的污染 | 若可能，移除样本中无关图像的来源。对于串扰参考图像，检查用于目标图像染料的激发光谱。如果染料在串扰图像采集过程中被激发（例如 Alexa Fluor 568 或 594），请考虑更换其他染料（例如 Alexa Fluor 555）。如果相机芯片上的灰尘导致明显的通道差异，请清洁相机芯片或使用计算平场校正方法。 | |
| 宇宙射线导致的极亮光点 | 若可能，重新采集图像。或者尝试应用计算去噪方法（例如中值或高斯滤波）。 | |
| 去卷积伪影（轴向和侧向边缘处的人工信号） | 去卷积后裁剪边缘像素或Z层面。若裁剪一侧，另一侧也应相应裁剪，以保持图像中心位置不变。 | |
| Z步长过大 | 应按照协议2.1.3所述，采集满足奈奎斯特准则的Z栈图像。 | |
| 光学像差 | 球面像差是用户引起的最主要像差。应为样本选择合适的物镜，并使用厚度为170 µm的盖玻片。若物镜配备校正环，请调节校正环，找到焦点处荧光信号最强的位置。对于无校正环的油浸物镜，应调整浸油的折射率，以提高焦点处的荧光信号强度。 | |
| 视场未填满（图7） | 对于生物标定参考图像，应平均多幅图像。对于串扰或明场参考图像，使用局部对齐方法。 | |
| 未知的软件缺陷 | 通过GitHub报告问题（https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues） | |
| 未能校正目标图像 | 图像文件的元数据丢失 | 使用包含完整元数据的原始显微镜文件格式，避免在处理前转换为多页TIFF文件。使用与协议3.3中所述相同的通道顺序。 |
| 针对当前显微技术选择了错误的对齐方法 | 在从生物标定参考图像到目标图像的测量中，不要应用局部对齐方法。除宽场显微镜外，不要使用其他显微技术的串扰参考图像。 | |
| 成像条件存在差异 | 保持参考图像与目标图像之间的成像条件一致，如协议2.3.3所述。 | |
| 样本差异（包括盖玻片） | 始终使用相同的封片介质、盖玻片（例如No. 1.5H）以及相似的焦深。 | |
| 自上次校准以来显微镜发生漂移 | 建议每两周进行一次校准。保持恒温环境，并使用防震台以避免显微镜硬件漂移。 |
表2：色差校正的故障排除。
图7：参考图像示例。 裂殖酵母细胞的核膜用GFP和mCherry标记。图像通过传统的宽场显微镜采集。使用Chromagnon软件对色差进行校正，未采用局部对齐，而是直接以图像本身作为参考图像。随后对图像进行去卷积处理以显示细节。(A) 视野中包含大量目标对象的良好示例。(B) 仅在左上角存在目标对象的不良示例，图像某区域的错位现象明显。(C) 一个不理想的示例，其中四分之一区域（由虚线十字线分隔）为空。A图中的比例尺表示全视野为5 µm，放大视图为1.25 µm，该比例尺适用于所有子图。请点击此处查看该图的放大版本。
在本方案中，我们描述了三种不同类型的参考图像（表1）。其中，串扰参考图像和生物校准参考图像需要进一步详细讨论。对于串扰参考图像，使用DAPI或Hoechst 33342染色并以甘油或商用封片剂封片的样品，可有效用于蓝、绿和红通道的对齐。类似地，Alexa Fluor 488可用于绿通道与红通道的对齐。然而，获取串扰荧光通常较为困难，因为除DAPI和Hoechst外，许多蓝色染料的亮度较低且衰减速度比大多数绿色和红色染料更快。此外，现代染料的发射光谱更窄，使得通过该方法对三个以上通道进行对齐具有挑战性。还需注意某些常见的红色染料（如Alexa Fluor 568和594，但不包括Alexa Fluor 555）可被紫光激发，这会妨碍从蓝色染料获得高对比度的串扰图像。另一个缺点是，该方法无法测量多色激发中激发光路的色差，因为激发时仅使用单一激发波长（表1）。由于大多数先进的显微镜采用改进的照明光学系统，该方法的应用受到限制。尽管如此，其较高的校正精度仍具有足够优势，因此在本方案中予以描述。通常情况下，应在获取目标图像后采集串扰图像，以避免光漂白或光毒性效应。对于在宽场模式下观察的SMLM，应在采集目标图像前获取参考图像，因为在成像过程中荧光染料可能发生漂白。
生物标定参考图像使用户能够轻松对齐任意数量的通道，但需要额外的样品制备。生物标定参考图像的另一个优势在于可以“平均”多个参考图像，从而覆盖全部视野。如果标定样品制备在不同的载玻片上，则该方法可能受到成像条件差异的影响。若将目标样品与参考样品制备在同一张载玻片上（例如使用商用带腔盖玻片（表1）），并保持其他成像条件与方案步骤2.3.3中一致，则大部分问题可得以解决。在此情况下，可望获得与串扰参考图像相似的校正精度3。如本方案所示，使用鬼笔环肽（phalloidin）是对单一细胞结构进行多色染色的最简便方法之一。制备生物标定样品存在多种可能的策略。对于免疫染色，可先用单一的一抗标记样品，再使用多种颜色的二抗进行染色，从而实现对同一目标结构的多色标记。另一种方法是利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine），通过“点击化学”（click chemistry）以高密度对新合成的DNA进行多色标记，具体方法此前已有详细描述8。对于活细胞，可构建转基因菌株，使其携带两个拷贝的基因，分别与GFP或mCherry融合，以实现对同一结构的双色标记。若基因拷贝数至关重要（如常在膜蛋白中观察到的情况），则可将单个基因以串联方式同时融合GFP和mCherry（图7）。光转换荧光蛋白（如mEOS218）也可通过施加适量的紫光照射，获得经光转换与未经光转换的两种蛋白形式。在低氧条件下，GFP也可作为可从绿色光转换为红色的光转换蛋白19,20。因此，选择合适的标定样品将使实验更加稳健。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金 JP19H03202（授予 A.M.）、JP18H05528 和 JP17H03636（授予 T.H.），以及 JP17H01444 和 JP18H05533（授予 H.Y.）资助。L.S. 感谢威康信托基金会（Welcome Trust）战略奖 091911 和 107457/Z/15/Z 对牛津微结构成像中心（Micron Oxford）先进成像技术的资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16% 甲醛溶液 | Polyscience | 18814-10 | |
| 35 mm 玻底培养皿 | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Alexa Fluor 405 鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | A30104 | |
| Alexa Fluor 488 鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| 牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 16170078 | |
| 盖玻片 | Matsunami | No. 1S HT | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐） | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（含 L-谷氨酰胺和丙酮酸钠） | Nacalai Tesque | 08458-16 | |
| 封片剂（VECTASHIELD） | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 小鼠抗微管蛋白单克隆抗体（TAT1） | 见参考文献15。 | ||
| Nunc Lab-Tek II 多孔腔室载玻片（8 孔） | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| 兔抗emerin多克隆抗体（ED1） | 由日本群马大学 Hiroshi Yorifuji 和日本国立神经与精神卫生中心 Kiichi Arahata 惠赠；已故。 | ||
| 偶联 Alexa Fluor 488 的二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | |
| 偶联 Alexa Fluor 555 的二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-21424 | |
| 偶联 Alexa Fluor 594 的二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| TetraSpeck 微球，0.2 µm | Thermo Fisher Scientific | T7280 |
参考文献
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